BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường Báo cáo thực hành: VI SINH ĐẠI CƯƠNG Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: • Dương Thị Cẩm Diệu • Nguyễn Thị Hà Diệp • Phan Thị Mỹ Ngọc • TP Hồ Chí Minh, 2014 MỤC LỤC BÀI 1: CÁC QUY TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT .5 BÀI : CÁC THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG .6 2.1 DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ VI SINH 2.1.1 Dụng cụ thuỷ tinh .6 2.1.1.1 Ống nghiệm 2.1.1.2 Đĩa petri 2.1.1.3 Pipette micropipette 2.1.1.4 Các dụng cụ thuỷ tinh khác 2.1.2 Các dụng cụ thiết bị khác 2.1.2.1 Dây cấy 2.1.2.2 Tủ ấm autoclave .8 2.2 BAO GÓI DỤNG CỤ 2.2.1 Nguyên tắc 2.2.2 Phương pháp bao gói .8 2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG 2.3.1 Nguyên tắc 2.3.2 Các phương pháp khử trùng 10 2.3.2.1 Khử trùng nhiệt khô 10 2.3.2.2 Khử trùng sức nóng ướt 11 2.3.2.3 Khử trùng phương pháp lọc .13 2.3.2.4 Khử trùng xạ 13 BÀI : MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 13 3.1 HÓA CHẤT – VẬT LIỆU – DỤNG CỤ .13 3.1.1 Hóa chất – vật liệu 13 3.1.2 Dụng cụ 13 3.2 MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG 14 3.2.1 Khái niệm 14 3.2.2 Các yêu cầu môi trường dinh dưỡng 14 3.2.3 Phân loại môi trường dinh dưỡng 14 3.2.3.1 Dựa vào thành phần nguồn gốc 15 3.2.3.2 Dựa vào tính chất lý học .15 3.2.3.3 Dựa vào công dụng 15 3.2.4 Phương pháp pha môi trường .15 3.2.4.1 Nguyên tắc pha môi trường 16 3.2.4.2 Các bước pha môi trường dinh dưỡng 16 3.3 CÔNG THỨC VÀ CÁCH PHA MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG THÔNG DỤNG 19 3.3.1 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn ( cao thịt – pepton ) 19 3.3.2 Môi trường nuôi cấy nấm mem ( Hansen ) 20 3.3.3 Môi trường nuôi cấy nấm mốc ( Czapek ) 21 3.3.4 Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn ( Gauze I ) 22 3.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG .23 3.4.1 Nguyên tắc khử trùng 23 3.4.2 Một số phương pháp khử trùng môi trường dinh dưỡng 24 Bài 4: Phân lập – Nuôi cấy – Bảo quản vi sinh vật 24 4.1 Hóa chất - Vật liệu – Dụng cụ .24 4.1.1 Hóa chất - Vật liệu 24 4.1.2 Dụng cụ .24 4.2 Phương pháp pha loãng mẫu 25 4.2.2 Nguyên tắc 25 4.2.3 Phạm vi áp dụng .25 4.2.4 Phương pháp thực 25 4.2.5 Đối với mẫu chất lỏng 25 4.2.6 Đối với mẫu chất rắn 25 4.3 Phân lập vsv 25 4.3.1 Nguyên tắc 25 4.3.2 Quá trình phân lập vi sinh vật khiết .25 4.3.3 Tạo khuẩn lạc riêng rẽ môi trường phân lập 26 4.3.4 Phân lập vsv môi trường thạch, đĩa petri .26 4.3.5 Kiểm tra độ tinh khiết giống phân lập 26 4.4 Quy trình phân lập số chủng vi sinh vật 26 4.4.1 Quy trình phân lập Vi Khuẩn BACILLUS SUBTILIS .26 4.4.2 quy trình phân lập nấm mốc 27 4.4.3 Quy trình phân lập nấm men 27 4.4.4 Quy trình phân lập xạ khuẩn 28 4.5 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 28 4.5.4 Phương pháp cấy thạch nghiêng 28 4.5.5 Phương pháp cấy thạch đứng 29 4.5.6 Phương pháp cấy đĩa petri .29 4.5.7 Kết việc nuôi cấy 29 4.6 Phương pháp bảo quản vi sinh vật 30 4.6.1 Phương pháp cấy chuyển định kì môi trường .30 4.6.2 Phương pháp giữ giống đất, cát, hạt .30 4.6.3 Phương pháp đông khô 30 BÀI 5: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI 30 5.1 NGUYÊN TẮC VÀ CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI 30 5.1.1 Nguyên tắc kính hiển vi 30 5.1.2 Các phận kính hiển vi 30 5.1.3 cách sử dụng kính hiển vi .31 5.2 Hóa chất – vật liệu – dụng cụ .32 5.2.1 khái niệm thuốc nhuộm 32 5.2.2 Một số loại thuốc nhuộm 32 5.2.3 Nguyên liệu 32 5.2.4 Dụng cụ 32 5.3 Cách làm tiêu tạm thời 33 5.3.1 Đặc điểm tiêu tạm thời .33 5.3.2 Cách lấy giống vi sinh vật làm tiêu 33 5.3.3 Cách làm tiêu giọt ép .33 5.3.4 Cách làm tiêu tạm thời có nhuộm màu 33 5.3.4 Nguyên tắc 33 5.3.4.2 Cách nhuộm 33 5.4 Cách làm tiêu cố định 34 5.4.1 Đặc điểm tiêu cố định .34 5.4.2 Các bước làm tiêu cố định 34 5.4.2.1 Làm vết bôi 34 5.4.2.2 Cố định vết bôi .34 5.4.3 Nhuộm tiêu cố định 34 5.4.3.1 Nguyên tắc 34 4.5.3.2 Cách nhuộm 34 5.5 Quan sát đặc điểm sinh học nhóm vi sinh vật 34 5.5.1 Quan sát đặc điểm sinh học vi khuẩn .34 5.5.1.1 Quan sát đại thể 34 5.5.1.2 Quan sát vi thể 35 5.5.2 Quan sát đặc điểm sinh học xạ khuẩn 36 5.5.2.1 Quan sát đại thể 36 5.5.2.2 Quan sát vi thể 36 5.5.3 Quan sát đặc điểm sinh học nấm mốc 37 5.5.3.1 Quan sát đại thể 37 5.5.3.2 Quan sát vi thể 37 5.5.4 Quan sát đặc điểm sinh học nấm men 37 5.5.4.1 Quan sát đại thể 37 5.5.4.2 Quan sát vi thể 38 5.6 Phương pháp nhuộm kép 39 5.6.1 Phương pháp nhuộm Gram 39 5.6.1.1 Hóa chất – Vật liệu – Dụng cụ 39 5.6.1.2 Nguyên tắc nhuộm Gram 39 5.6.1.3 Các bước tiến hành 40 5.6.2 phương pháp nhuộm từ bào tử 40 5.6.2.1 Hóa chất – Vật liệu – Dụng cụ 40 5.5.2.2 Phương pháp nhuộm bào tử .40 BÀI 1: CÁC QUY TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT Thao tác an toàn yêu cầu quan trọng kiểm nghiệm vi sinh vật làm việc với vi sinh vật, thường thao tác với số lượng lớn đậm đặc tế bào vi sinh vật (ở mức 109 tế bào /ml) nhiều chủng vi sinh vật tác nhân gây bệnh nên cần luôn cẩn thận với tất chủng thao tác Mặt khác, nhân viên kiểm nghiệm củng phải sử dụng nhiều loại hóa chất, có acid hóa chất có độc tính Do vậy, cần tuẩn thủ số quy tắc an toàn để đảm bảo an cho thân cho người khác phòng thí nghiệm sau: - Nắm vững nguyễn tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật - Không ăn uống, hút thuốc phòng kiểm nghiệm mang trang thao tác với vi sinh vật - Mặc áo blouse thời gian làm việc - Trươc bắt đầu cần sát trùng mặt bàn giấy lau tẩm cồn 70 dung dịch chất diệt khuẩn khác ( Lysol 5%, amphyl 10%, chlorol 10%), để khô Thực tương tự cho hai tay Chú ý chưa đốt đèn cồn hai tay chưa khô cồn lặp lại việc sát trùng sau hoàn thành công việc - Cần ghi tên chủng, ngày tháng thí nghiệm llên tất đĩa petri, ống nghiệm môi trương, bình nuôi cấy - Khi lỡ tay làm đổ, nhiễm vi sinh vật nới làm việc, dùng khăn giấy tẩm chất diệt khuẩn lau kỹ, sau thực khử trùng lại bàn làm việc - Cẩn thận thao tác với đèn cồn tắt lửa chưa có nhu cầu sử dụng sau thực xong thao tác Lưu ý tránh đưa tay, tóc qua lửa.cần có cách bảo vệ tóc thích hợp trường hợp tóc dài - Sử dụng bóp cao su thao tác ống hút định lượng (pipette), không hút miệng - Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, cẩn thận mang tay thu gom tất mảnh vỡ vào túi rác riêng - Tách riêng chất thải rắng chất thải lỏng - Tất chất thải rắn, môi trường chứa nhiễm vi sinh vật cần hấp khử trùng trước thải bỏ vào bải rác Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần ngâm vào dung dịch chất diệt khuẩn ( nước javel) trước rửa tái sử dụng - Cần gói rang băng keo đặt chồng các đĩa petri lên - Không mở đĩa petri dùng muỗi ngửi để tránh nhiễm vi sinh vật vào đương hô hấp - Khi đốt que cấy có dính sinh khối vi sinh vật cần đặt vòng đầu que vào chân lửa để ranh văng nhiễm vi sinh vật vào không khí - Sát trùng rửa tay sách trước rời phòng thí nghiệm BÀI : CÁC THIẾT BỊ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG 2.1 DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ VI SINH 2.1.1 Dụng cụ thuỷ tinh 2.1.1.1 Ống nghiệm - Ống nghiệm sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật, có nút gòn không thấm nước nhựa chịu nhiệt Ống nghiệm sử dụng để nuôi cấy, tăng sinh vi khuẩn môi trường lỏng A B Hình 1.1: A: Ống nghiệm có nút nhựa vặn B: Ống nghiệm có nút gòn 2.1.1.2 Đĩa petri - Đĩa petri gồm nắp lớn đáy nhỏ úp lồng vào nhau, đường kính cm, 10 cm, 12 cm … Đĩa petri sử dụng nhằm mục đích phân lập vi sinh vật Hình 1.2: Đĩa petri 2.1.1.3 Pipette micropipette - Pipette hay gọi pipette chia vạch dụng cụ sử dụng để phân phối chất lỏng vào dụng cụ - Micropipette hay gọi pipetteman loại pipette cho phép định lượng xác lượng dung dịch tích nhỏ Hình 1.3 Pipette micropipette loại 2.1.1.4 Các dụng cụ thuỷ tinh khác - Becher - Bình tam giác (Erlen) 2.1.2 Các dụng cụ thiết bị khác 2.1.2.1 Dây cấy - Dây cấy thẳng: Sử dụng để cấy sâu hay ly trích vi sinh vật môi trường thạch - Dây cấy vòng: Dùng cấy ria vi sinh vật trên mặt thạch hay phân lập vi sinh vật môi trường lỏng môi trường thạch - Dây cấy thước thợ: Dùng để cấy loại nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn Những loại dây cấy thường làm kim loại không bị oxy hoá nhiệt độ cao Hình 1.4: Các loại dây cấy sử dụng nuôi cấy vi sinh vật : a Dây cấy vòng b Dây cấy thẳng 2.1.2.2 Tủ ấm autoclave - Tủ ấm gọi tủ thiết bị giúp ổn định nhiệt độ, sử dụng để theo dõi tăng trưởng vi sinh vật - Autoclave hay gọi nồi hấp tiệt trùng áp suất cao thiết bị sử dụng để tiệt trùng môi trường nuôi cấy (a) (b) Hình 1.5: (a) Tủ ấm (b) Autoclave 2.2 BAO GÓI DỤNG CỤ 2.2.1 Nguyên tắc - Dụng cụ bao gói phải đảm bảo khô - Bao gói phải kín cẩn thận để sau khử trùng đảm bảo vô trùng dụng cụ lớp giấy gói lấy sử dụng dễ dàng 2.2.2 Phương pháp bao gói Việc bao gói dụng cụ gồm khâu: - Làm nút bông: Cho ống nghiệm, bình tam giác, que trang - Bao gói: Cho hầu hết dụng cụ khác a Cách làm nút - Với ống nghiệm: • Lấy không thấm nước cuộn lại • Đẩy cuộn gập đôi từ từ vào miệng ống nghiệm • Yêu cầu:  Nút có kích thước độ chặt vừa phải  Đầu nút tròn, gọn, phần lớn phần  Lấy nút hay đóng vào dễ dàng - Với chai, lọ, bình tam giác có kích thước lớn: cách làm tương tự sử dụng lượng nhiều - Với pipet: Dùng sợi dây thép nhỏ nhét vào đầu lớn pipet để hạn chế không khí từ bóp cao su vào pipet b Cách bao gói dụng cụ Với dụng cụ sau làm nút cần bao gói phần có nút giấy báo để khử trùng nút không bị ướt đảm bảo điều kiện vô trùng tốt Cách làm sau: -Cắt đoạn bang giấy hình chữ nhật với kích thước tuỳ theo dụng cụ cần bao bao gói -Quấn quanh phần đầu có nút -Cột lại thật chặt Yêu cầu: -Phần giấy bao bên phải chặt kín -Bao giấy dầu với dụng cụ hấp ướt -Bao giấy báo với dụng cụ sấy khô khử trùng ướt Với dụng cụ pipet, que trang phải dung giấy bao kín toàn Có thể dung hộp nhôm để đựng dụng cụ để khử trùng 2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG 2.3.1 Nguyên tắc Sau khử trùng cần đảm bảo: • Sự vô trùng tuyệt đối cho dụng cụ vật phẩm • Không làm thay đổi chất lượng mẫu vật Bảo đảm an toàn tuyệt đối cho người 10 2.3.2 Các phương pháp khử trùng Khi khử trùng nhiệt, tế bào sinh dưỡng VSV bị tiêu diệt dễ dàng bào tử tồn nhiệt độ Khả chịu nhiệt vi sinh vật phụ thuộc vào: -Tính chất môi trường -Số lượng tế bào -Độ pH vật cần khử trùng Do để khử trùng nhiệt hiệu cần xác định ngưỡng nhiệt độ thấp khoảng thời gian ngắn cần thiết để tiêu diệt toàn VSV bào tử chúng có dụng cụ cần khử trùng Có thể khử trùng phương pháp nhiệt khô hay nhiệt ướt 2.3.2.1 Khử trùng nhiệt khô Khử trùng tủ sấy -Được thực tủ sấy -Cách tiến hành: • Đặt dụng cụ bao gói vào tủ sấy • Bật công tắc tủ hoạt động • Điều chỉnh thời gian nhiệt độ thích hợp (160oC 180oC 30 phút) • Tắt tủ sấy, để nguội tới 60oC mở tủ lấy dụng cụ Tránh mở tủ lấy dụng cụ nhiệt độ tủ cao làm dụng cụ thuỷ tinh dễ vỡ • Các dụng cụ sau sấy mà giấy bao có màu vàng đạt yêu cầu Nếu giấy bao có màu nâu chứng tỏ nhiệt độ khử trùng cao làm giấy biến thành gondron ( hợp chất có tính sát trùng) sử dụng dụng cụ để nuôi cấy VSV Khử trùng cách đốt lửa đèn cồn -Phương pháp dung để khử trùng que cấy, ống hút, đầu ống nghiệm, miệng bình tam giác sau lấy nút -Cách khử trùng: • Hơ dụng cụ lửa đèn cồn, đưa qa đưa lại – lần Với dây mayxo đầu que cấy phải nung cho thật đỏ hết chiều dài dây cấy • Đợi dụng cụ nguội sử dụng để tránh vỡ vi khuẩn không bị tiêu diệt lấy giống 26 • Phân lập VSV cần thiết • Kiểm tra độ tinh khiết VSV      4.3.3 Tạo khuẩn lạc riêng rẽ môi trường phân lập Nếu ban đầu dạng rắn phải chuyển dạng lỏng cách Cân 10g (hoặc 25g) mẫu cho vào erlen bao nilon vô trùng Cho 90ml (hoặc 225ml) nước muối sinh lí (dd pha loãng thích hợp) vô trùng rùi pha loãng Sau thực mẫu dạng lỏng Típ tuc pha loãng nồng độ cần thiết Cấy mẫu môi trường đặc trưng Chú ý: ko có môi trường đặc trưng sử dụng môi trường mà VSV phát triển bình thường có bổ sung chất ức chế VSV khác phát triển 4.3.4 Phân lập vsv môi trường thạch, đĩa petri Để phân lập vi khuẩn thuần, sử dụng phương pháp chuyên biệt cho trình phân lập Đó phương pháp cấy trang cấy ria 4.3.5 Kiểm tra độ tinh khiết giống phân lập  Kiểm tra vết cấy Quan sát sinh trưởng vsv môi trường thạch - Nếu vết cấy có bề mặt màu sắt đồng đều, chứng tỏ giống phân lập chủng => giữ lại - Nếu vết cấy hk chủng loại bỏ  Kiểm tra độ khuẩn lạc • Chọn khuẩn lạc riêng rẽ môi trường thạch nghiêng • Tách khuẩn lạc ra, hòa tan pha loãng nồng độ cần thiết nước cất vô trùng • Nhỏ giọt dịch vào đĩa petri có môi trường • Dùng que trang trải dịch khắp mặt đĩa petri thứ ,rồi đĩa thứ 2, • Ủ đĩa petri thời gian nhiệt độ thích hợp • Sau quan sát khuẩn lạc riêng rẽ Sự khiết khuẩn lạc biểu khiết giống 4.4 Quy trình phân lập số chủng vi sinh vật 4.4.1 Quy trình phân lập Vi Khuẩn BACILLUS SUBTILIS Mẫu cỏ khô Môi trường phân lập cao thịt pepton Cách thực - Cỏ khô cắt nhỏ cho vào bình tam giác - Bổ sung thêm urea nước cho ngập cỏ - Đun sôi 15p để diệt tb sinh dưỡng tb ko sinh bào tử - Đậy nút để tủ ấm 25-260c 48 – 72 h - Kết • Xuất lớp váng xám có nhiều vi khuẩn bacillus subtilis cỏ khô bao h xuất bào tử vi khuẩn 27 • Trên kính hiển vi tb vk bacillus subtilis có hình que, dài, bào tử hình ovan nằm xa tâm hay gần tâm khuẩn lạc Tế bào có kích thước 3-5 x um Tiến hành cấy chuyển - Từ bình tam giác có trên, tiến hành cấy chuyển sang môi trường cao thịt pepton để tăng sinh - Dùng pipepman hút ml dịch mẫu từ bình tam giác cho vào ống nghiệm chứa môi trường cao thịt pepton - Ủ nhiệt độ 300C 24h - Quan sát ống nghiệm ghi nhận lại kết chứng minh diện vk môi trường cao thịt pepton: môi trường bị đục,có váng bề mặt có cặn đáy ống nghiệm - Làm tiêu kính hiển vi 4.4.2 quy trình phân lập nấm mốc Mẫu: phân lập nấm mốc cơm nguội, xôi làm mốc tương, bánh mì để khộ ngày Môi trường phân lập: czapek agar Cách thức phân lập ( nấm mốc thuần) - Thông qua màu sắc mốc nhận diện • Mốc có màu trắng: mucor rhizopus • Mốc có màu đen: aspergillum italicum • Mốc có màu xanh lục: Penicillum italicum Penicillum aspergillum • Dùng que cấy hình vòng lấy sợi nấm cấy vào môi trường thạch czapek • Ủ nhiệt độ 30 0c 24h • Quan sát nhận xét nấm mốc khiết Cách thức phân lập (quan sát nấm mốc): pp nuôi cấy lame kính Chuẩn bị đĩa môi trường czapek agar • Chuần bi đĩa petri vô trùng chứa mảnh giấy lọc, 2thanh đũa tre lame 4.4.3 Quy trình phân lập nấm men Mẫu: • Bề mặt trái cấy dịch ép số trái lê, táo … • Trong rượu nếp, bánh men rượu, bia, nước mía để vài hôm,… Môi trường phân lập hansen agar 28 Cách thức: • Đối với mẫu bánh men cơm rượu, 10g cho vào erlen vô trùng, bổ sung 90 ml nước cất vô trùng đồng -> nồng độ pha loãng 10-1 • Sau tiến hành pha loãng nồng độ 10-2,10-3, 10-4 • Ở nồng độ pha loãng, tiến hành hút 0,1 ml cho vào đĩa môi trường hansen agar sử dụng que trang dịch môi trường hansen • Ủ nhiệt độ 30 0C 24h – 48h 4.4.4 Quy trình phân lập xạ khuẩn Mẫu: đất vườn Môi trường phân lập:GAUZE I Cách thức phân lập: • Mẫu đất vườn sau đưa phòng thí nghiệm, tiến hành cân 100g cho vào đĩa petri đem sấy nhiệt độ 105 0ctrong 30 p • Mẫu sau sấy tiến hành pha loãng = cách cân 10g mẫu, sau thêm 90 ml nước muối vô trùng • Từ dịch mẫu pha loãng cấy ria môi trường Gauze I Ủ nhiệt độ 30 0C 48h 4.5 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 4.5.1 khái niệm Quá trình nuôi cấy vi sinh vật gồm khâu: nuôi cấy - nuôi: trình đảm bảo trì điều kiện thuận lợi cho hoạt động phát triển vi sinh vật - cấy: thao tác chuyển vi sinh vật từ môi trường sống sang môi trường thuận lợi cho phát triển chúng Hai khâu gắn bó với trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật 4.5.2 Nguyên tắc - Mọi thao tác nuôi cấy phải thực điều kiện vô trùng để tránh nhiễm khuẩn - Môi trường dụng cụ nuôi cấy phải khủ trùng - Duy trì điều kiện thuận lợi để vi sinh vật phát triển 4.5.3 pương pháp cấy 4.5.3.1phương pháp chung việc cấy chuyển • • • • • • Khử trùng dây cấy đèn cồn Dùng ngón út lấy nút ống nghiệm cần lấy vi khuẩn Cho dây cấy khử trùng để nguội vào ống nghiệm lấy vòng sinh khối Đậy nút ống nghiệm thứ lấy nút ống nghiệm thấy thứ Cho sinh khối vào ống nghiệm thứ đậy nút lại Khử trùng lại dây cấy sau hoàn tất • • • • 4.5.4 Phương pháp cấy thạch nghiêng Sử dụng dây cấy vòng Cấy giống vào thạch nghiêng Hòa giống đầu que cấy vào giọt nước đáy ống nghiệm Nhẹ nhàng lướt que cấy mặt thạch nghiêng 29 4.5.5 Phương pháp cấy thạch đứng • Sử dụng dây cấy thẳng • Sau lấy sinh khối … • Nhẹ nhàng để không làm vỡ môi trường thạch 4.5.6 Phương pháp cấy đĩa petri - Để đĩa petri lên bàn - Dùng que cấy lấy sinh khối vsv - Mở nắp đĩa petri đủ que cấy vào - Nhẹ nhàng nhanh chóng lướt que cấy mặt thạch: • Theo hình chữ chi toàn mặt thạch • Theo đường song song • Theo hình chữ chi góc Dùng pipet: dùng để định lượng vsv.có cách Cách • Trộn dịch cấy vào thạch cách hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống nghiệm có môi trường thạch nhiệt độ 50 • Đậy nút lại, lắc nhẹ cho vsv môi trường • Đỗ thạch vào đĩa petri khử trùng • Xoay tròn đĩa thạch phân bố mặt đĩa • Để yên cho môi trường thạch phân bố mặt đĩa • Để yên cho môi trường đông đặc ủ nhiệt độ thích hợp Cách • Hút 0,1 ml dịch cần nghiêng cứu cho vào đĩa petri có môi trường đặc • Dùng que trang trải khắp mặt đĩa • Ủ nhiệt độ thời gian thích hợp 4.5.7 Kết việc nuôi cấy - Trong môi trường lỏng vsv phát triển làm đục môi trường - Trong môi trường rắn thạch nghiêng: • Nấm men, vi khuẩn phát triển tạo vệt thạch hay trắng đục • Nấm mốc tạo nên sợi mảnh từ vết cấy 30 4.6 Phương pháp bảo quản vi sinh vật 4.6.1 Phương pháp cấy chuyển định kì môi trường 4.6.2 Phương pháp giữ giống đất, cát, hạt 4.6.3 Phương pháp đông khô BÀI 5: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA VI SINH VẬT DƯỚI KÍNH HIỂN VI 5.1 NGUYÊN TẮC VÀ CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI 5.1.1 Nguyên tắc kính hiển vi Kính hiển vi cấu tạo hệ thống thấu kính hội tụ hệ thống hoạt động kính lúp Kính lúp quay phía vật quan sát gọi vật kính Kính lúp dùng để nhìn gọi thị kính 5.1.2 Các phận kính hiển vi Kính hiển vi gồm có: - Một chân: làm kim khí nặng để giữ thăng - Một ống kính: chuyện động mang thị kính - Một trục quay có gắn vật kính - Một đinh ốc cấp để vặn cho trục kính chuyển động chậm - Một đinh ốc lớn để vặn cho trục kính chuyển động nhanh - Một bàn kính mạng vật mẫu để quan sát Bộ phận cố định - Dưới bàn kính phận ngưng tụ ánh sáng 31 - Một gương với hai mặt ( mặt phẳng mặt lỡm) 5.1.3 cách sử dụng kính hiển vi Trước hết dùng miếng vải mềm lau vật kính thị kính.lau nhẹ tay không hạt bụi làm xay xát vật kính thị kính Tuyệt đối không tháo gỡ vật kính thị kính Khi sử dụng nên ấn nhẹ, cần kính để trục kính nghiêng phía góc 10 – 150 Kế tiếp, quay trục ống kính lúc nghe tiếng “kích” nhỏ: trục vật kính nằm thẳn hàng với trục vật kính Sau mở hết chắn sáng để ánh sáng vào cực đạivà hướng mặt lỡm gương phản chiếu quay phía nguồn sáng Sau để mẫu vật lên bàn kính, vặn đinh ốc sơ cấp để hạ vật kính xuống cách mẫu vật chừng 1cm kính hiển vi có cản an toàn ngừng vặn đinh ốc mắc cứng Nhìn vào thị kính, vặn đinh ốc lớn nâng từ từ ống kính lên lúc thấy ảnh kính Sau dùng đinh ốc vi cấp điều chỉnh cho ảnh rõ Lúc ảnh rõ, ta đóng bớt chắn sáng lại thấy mẫu sáng Đinh ốc vi cấp chuyển động chiều, chiều có vòng Nếu đinh ốc vi cấp bị kẹt cứng chưa quay đủ vòng, ta phải quay đinh ốc vi cấp vòng hướng Tuyệt đối không ráng sức vặn đinh ốc kẹt 32 5.2 Hóa chất – vật liệu – dụng cụ 5.2.1 khái niệm thuốc nhuộm - Thuốc nhuộm hợp chất hóa học dùng để nhuộm màu - Căn vào tính chất hóa lý, chia làm loại thuốc nhuộm chính: • Thuốc nhuộm kiềm thuốc nhuộm gốc kiềm có khả nhuộm màu, chúng kết hợp chặt chẽ với phần nhân tế bào • Thuốc nhuộm acid thuốc nhuộm mà gốc kiềm có khả kết hợp chặt chẽ với thành phần tế bào chất 5.2.2 Một số loại thuốc nhuộm Thuốc nhuộm Fuchsin Methylene blue Xanh Methylen Loeffler Dung dịch lactophenol Tím gentian Dung dịch lugol aceton 5.2.3 Nguyên liệu - Môi trường Hasen nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae - Môi trường cao thịt – pepton dịch thể cấy E.coli, B subtilis, S aureus - Môi trường czapek nuôi cấy nấm mốc - Môi trường Gauze I nuôi cấy xạ khuẩn - Nước cất vô trùng 5.2.4 Dụng cụ - Lame, lamelle - Que cấy, đèn cồn - Giấy lọc 33 - Bình tia - Kính hiển vi, dầu soi kính 5.3 Cách làm tiêu tạm thời 5.3.1 Đặc điểm tiêu tạm thời 5.3.2 Cách lấy giống vi sinh vật làm tiêu - Đốt đèn cồn - Một tay cầm ống nghiệm chứa vi sinh vật - Tay lại cầm que cấy để khử trùng - Kéo nút khỏi ống nghiệm khủ trùng miệng ống nghiệm - Đưa que cấy vào lấy sinh khối vi sinh vật - Rút que cấy ra, khử trùng miệng ống nghiệm - Đưa giọt môi trường (hoặc sinh khối) vi sinh vật đầu que cấy đặt vào giữ lame để làm vết bôi 5.3.3 Cách làm tiêu giọt ép - Dung que cấy lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi - Đặt lamelle lên giọt canh trường, tránh tạo bọt khí - Quan sát kính hiển vi 5.3.4 Cách làm tiêu tạm thời có nhuộm màu 5.3.4 Nguyên tắc 5.3.4.2 Cách nhuộm Có cách nhuộm vi khuẩn sống: Cách 1: - Nhỏ giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm - Đậy lamelle Cách 2: Nhỏ giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0,001% lên lame Quan sát tiêu vật kính X10 X40 34 - Nhỏ giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0,001% lên lame - Dùng que cấy dàn thành vùng nhỏ để khô tự nhiên - Nhỏ giọt dịch vi khuẩn lê vùng màu khô - Quan sát tiêu với vật kính X10 X40 5.4 Cách làm tiêu cố định 5.4.1 Đặc điểm tiêu cố định 5.4.2 Các bước làm tiêu cố định 5.4.2.1 Làm vết bôi - Chon lame khô - Lấy sinh khôi vi sinh vật cho vào giữ lame - Để vết bôi khô tự nhiên không khí 5.4.2.2 Cố định vết bôi - Cố định nhiệt - Cố định hóa chất 5.4.3 Nhuộm tiêu cố định 5.4.3.1 Nguyên tắc Có cách nhuộm chính: - Nhuộm đơn: dùng loại thuốc nhuộm tiêu - Nhuộm kép: dùng đồng thời hay nhiều loại thuốc nhuộm tiêu 4.5.3.2 Cách nhuộm 5.5 Quan sát đặc điểm sinh học nhóm vi sinh vật 5.5.1 Quan sát đặc điểm sinh học vi khuẩn 5.5.1.1 Quan sát đại thể - Đục - cặn 35 5.5.1.2 Quan sát vi thể a) Các đặc trung sinh học cần quan sát vi khuẩn - Vi khuẩn có nhiều hình thái khác nhau: hình cầu, hình que, hình xoắn, hình dấu phẩy, hình sợi - Bào tử hình thức tiềm sinh vi khuẩn Khi gặp điều kiện khó khăn, vi khuẩn có khả hình thành bào tử b) Cách quan sát Quan sát cầu khuẩn: loại vi khuẩn có hình cầu Tế bào hình cầu đứng riêng rẽ hay liên kết với Quan sát trực khuẩn : Trực khuẩn: Là tên chung tất vi khuẩn có hình que A Trực khuẩn B Cầu khuẩn 36 5.5.2 Quan sát đặc điểm sinh học xạ khuẩn 5.5.2.1 Quan sát đại thể Khuẩn lạc xạ khuẩn môi trường Gauze I có đặc điểm: tròn, lồi, màu trắng, bông, xốp 5.5.2.2 Quan sát vi thể a) Các đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát - Đa số xạ khuẩn có cấu tạo dạng sợi, sợi kết với tạo thành khuẩn lạc có nhiều màu sắc khác nhau: trắng, vàng, nâu, tím, xám v.v Màu sắc xạ khuẩn đặc điểm phân loại quan trọng Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng từ 0,1 - 0,5 µm Có thể phân biệt hai loại sợi khác - Xạ khuẩn sinh sản sinh dưỡng bào tử Bào tử hình thành nhánh phân hoá từ khuẩn ty khí sinh gọi cuống sinh bào tử Cuống sinh bào tử loài xạ khuẩn có kích thước hình dạng khác Có loài dài tới 100 - 200 nm, có loài khoảng 20 - 30 nm Có loài cấu trúc theo hình lượn sóng, có loài lò xo hay xoắn ốc Sắp xếp cuống sinh bào tử khác Chúng xếp theo kiểu mọc đơn, mọc đôi, mọc vòng chùm Đặc điểm hình dạng cuống sinh bào tử tiêu chuẩn phân loại xạ khuẩn - Bào tử hình thành từ sinh bào tử theo kiểu kết đoạn (fragmentation) cắt khúc (segmentation) b) Cách quan sát Hình : xạ khuẩn quan sát kính hiển vi 37 5.5.3 Quan sát đặc điểm sinh học nấm mốc 5.5.3.1 Quan sát đại thể Khuẩn lạc nấm mốc môi trường Czapek: hình thành tơ nấm màu trắng môi trường Hình : lạc khuẩn nấm mốc môi trường czapek 5.5.3.2 Quan sát vi thể a) Các đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát b) Cách quan sát Hình: nấm mốc quan sát kính hiển vi 5.5.4 Quan sát đặc điểm sinh học nấm men 5.5.4.1 Quan sát đại thể Khuẩn lạc nấm men môi trường Hansen có đặc điểm: tròn, lồi, bóng có màu trắng sữa 38 Hình: Khuẩn lạc nấm men môi trường Hansen 5.5.4.2 Quan sát vi thể a) Những đặc điểm sinh học cần quan sát - Nấm men thường có hình cầu hình bầu dục, số loại có hình que hình dạng khác - Có loại bào tử: bào tử bắn bào tử túi bào tử túi bào tử hình thành túi nhỏ gọi nang Trong nang thương chứa từ 18 bào tử, lên đến 12 bào tử bào tử bắn bào tử hình thành nhờ lượng tế bào bắn mạnh phía đối diện hình thức phát tán bào tử b) Cách quan sát Hình : tế bào nấm men quan sát kinh hiển vi 39 5.6 Phương pháp nhuộm kép 5.6.1 Phương pháp nhuộm Gram 5.6.1.1 Hóa chất – Vật liệu – Dụng cụ a) Hóa chất – Nguyên liệu - Hóa chất • Các loại thuốc nhuộm • Nước muối sinh lý: dung dịch NaCl 0,85% - Nguyên liệu • Các ống thạch nghiêng nuôi cấy ông vi sinh vật: B subitilis, E.Coli b) Dụng cụ - ống nghiệm đựng nước cất vô trùng - lame, lamelle - que cấy, đèn cồn, diêm quẹt - Bình đựng nước rửa tiêu - Chậu thủy tinh - Cốc thủy tinh, cầu thủy tinh - Kính hiển vi, dầu soi kính - Giấy lọc, kẹp sắt 5.6.1.2 Nguyên tắc nhuộm Gram - Loại phức chất thứ giữ nguyên màu thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi xử lý cồn vi sinh vật có phức chất vi khuẩn Gram dương - Loại phức chất thứ hai không giữ màu thuốc nhuộm nên màu xử lý cồn bắt màu thuốc nhuộm bổ sung Vi sinh vật có phức chất thuộc loại Gram âm 40 5.6.1.3 Các bước tiến hành - Làm tiêu bản: • Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm vết bôi lame • Dùng que cấy lấy sinh khối làm vết bôi theo thứ tự sau: o Bên trái lame B.subitilis o Bên phải lame E.coli o lame B.subitilis trộn lẫn với E.col • Để khô vết bôi không khí cố định nhẹ đèn cồn • Nhuộm tiêu bản: • Đặc miếng giấy lọc lên vết bôi • Nhuộm tiêu thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc phút • Nhuộm lugol phút • Rửa nước • Tẩy cồn 30s, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ giọt cồn tan hết màu • Rửa nước • Nhuộm bổ sung fuchsin safranin từ 10 – 30s • Rửa nước • Làm khô soi tiêu với vật kính dầu 5.6.2 phương pháp nhuộm từ bào tử 5.6.2.1 Hóa chất – Vật liệu – Dụng cụ 5.5.2.2 Phương pháp nhuộm bào tử