MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh sán gan lớn bệnh phổ biến trâu bò động vật khác dê, cừu Bệnh có khả lây truyền qua người ăn rau sống mọc nước có chứa nang trùng Có hai loại sán gan lớn Fasciola gigantica Fasciola hepatica Fasciola gigantica phổ biến vùng nhiệt đới Đông Nam Á, Châu Phi, Hawaii, Pakistan Thái Lan; Fasciola hepatica phổ biến Châu Âu, vùng Đông Nam Châu Phi, Mỹ, Châu Úc Nhật Bản Các công trình nghiên cứu tác giả nước cho thấy động vật ăn cỏ Việt Nam trâu bò bị nhiễm sán gan cao đa số F gigantica Bệnh sán gan làm giảm trọng lượng vật rõ rệt, giảm phẩm chất thịt (thịt bị thấm ướt), giảm sức chống đỡ với bệnh khác, làm giảm lượng sữa trâu bò nuôi lấy sữa Bệnh sán gan Fasciola spp không gây thiệt hại nặng nề ngành chăn nuôi mà bệnh truyền lây người động vật Tại Việt Nam, tỷ lệ gia súc, vật nuôi đặc biệt ca bệnh người nhiễm sán gan lớn Fasciola gigantica năm gần theo chiều hướng tăng cao tập trung chủ yếu miền Trung Do vậy, bệnh sán gan coi mối quan tâm lớn thú y y tế giới Có nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh sán gan phương pháp gạn rửa sa lắng tìm trứng phân phát bệnh vào khoảng tuần thứ 8-10 sau nhiễm thời gian sán trưởng thành bắt đầu thải trứng lúc thời điểm mô gan bị phá hoại di hành sán Bởi vậy, việc phát bệnh sớm nhu cầu thiết yếu để điều trị kịp thời cho đàn gia súc trước sán gan kịp phá hoại nhu mô gan Hiện nay, phương pháp ELISA phát có mặt kháng thể phương pháp chẩn đoán có độ đặc hiệu độ nhạy cao bệnh sán gan trâu bò Tuy nhiên, phương pháp đòi hỏi lựa chọn kháng nguyên có độ đặc hiệu cao Do đó, việc xác định phân tích thành phần kháng nguyên Fasciola gigantica điều cần thiết, tạo sở cho việc chế kit chẩn đoán bệnh vắcxin phòng bệnh sán gan Sự thành công đề tài với kỹ thuật ứng dụng nghiên cứu protein tạo tiền đề cho nghiên cứu chuyên sâu khác protein, công nghệ gene lĩnh vực sinh học phân tử ký sinh trùng Việt Nam Hai loài F.gigantica F.hepatica có nhiều điểm giống khác Để phân biệt hai loài người ta sử dụng phương pháp hình thái học (Periago CS, 2006) Theo Periago CS (2006) [6], dựa vào đặc điểm hình thái quan trọng chiều dài, chiều rộng thể, khoảng cách từ giác bụng đến cuối thân tỷ lệ chiều dài/chiều rộng cho phép xác định loài SLGL Phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, không cần thiết bị phức tạp thực hầu hết phòng thí nghiệm Việc xác định loài sán gan lớn sở để lựa chọn, thực nghiên cứu nhằm tìm hiểu chế bệnh sinh, nghiên cứu tạo kít huyết chẩn đoán, nghiên cứu thuốc điều trị, tình hình kháng thuốc… Qua góp phần quan trọng công tác phòng chống bệnh sán gan lớn gây động vật người phù hợp với điều kiện quốc gia, vùng lãnh thổ Theo công trình nghiên cứu khoa học giới, ký sinh thể vật chủ, sán gan lớn tiết chất có đặc tính sinh học kháng nguyên (nên gọi kháng nguyên tiết) thể chủ Loại kháng nguyên đánh giá có mức độ đặc hiệu cao kháng nguyên thân kháng nguyên bề mặt, việc chẩn đoán bệnh sán gan xác sử dụng loại kháng nguyên Ngoài ra, dịch tiết có thành phần cysteine-protease biết enzyme thiết yếu cho cầu ký sinh ký sinh vật thể chủ Enzyme tinh chế dùng làm vaccine tiêm chủng cừu cho thấy, không loại trừ hoàn toàn phát triển sán gan kết thí nghiệm chứng minh có giảm làm hẳn xuất trứng sán phân Điều góp phần hạn chế lây lan dịch bệnh, giảm thiệt hại kinh tế.Vì tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu đặc điểm hình thái, phân loại thành phần kháng nguyên chất tiết sán gan lớn Fasciola spp  • Mục tiêu đề tài Xác định đặc điểm hình thái phân loại sán gan lớn Fasciola spp • Xác định thành phần kháng nguyên chất tiết sán gan lớn Fasciola spp PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát đặc điểm sinh học sán gan lớn Sán gan lớn (Fasciola) kí sinh trùng lây truyền theo đường tiêu hóa 2.1.1 Phân loại sinh học Theo Dunn ( 1978 ) Soulsby ( 1982 ), Sự phân loại sán gan lớn sinh giới sau: Ngành: Giun sán Lớp: Giun dẹt Dưới lớp: lưỡng tính Họ: sán Giống (chi): Fasciola Loài: Fasciola hepatica Linnaeus, 1758 Fasciola gigantica Cobbold, 1885 2.1.2 Hình thái sinh học sán gan lớn Tất kí sinh trùng sán nói chung trâu bò có hình dẹt, kích thước dao động từ – 30 mm( có loài có kích thước đến 75 mm) Sán có hai gác bám, giác miệng phía đầu nối với manh tràng, chia hai nhánh nhánh mở rộng phía thể, giác bụng tròn gần giác miệng Sán gan hệ tuần hoàn hô hấp Hệ tiết phát triển gồm nhiều ống nhỏ, phân nhánh thông với hai ống Hai ống hợp lại cuối thân thông qua lỗ tiết Đặc điểm sán gan lớn có mặt tế bào hình lửa hệ tiết sán Thực quản tương đối ngắn, ống tiêu hóa dài tận phần cuối thân sau, phân thành nhiều nhánh Dịch hoàn nằm sau buồng trứng phân nhánh Hệ thần kinh phát triển gồm hạch thần kinh phần đầu sán từ phát dây thần kinh phía sau thể Sán lưỡng tính, phận sinh dục có lỗ nằm gần giác bụng Cơ quan sinh dục đực bao gồm hay nhiều tinh hoàn kết nối với ống đơn ống dẫn tinh lớn, nhờ vào ống ngắn ống dẫn tinh Ống dẫn tinh kết thúc quan sinh dục đực Cơ quan sinh dục bao gồm buồng trứng kết nối với ống dẫn trứng Ống dẫn trứng nối với ống noãn hoàng Ống dẫn trứng nối tiếp với ootype bao quanh khối tuyến ngoại tiết Tử cung nằm cuối ootype Sự thụ tinh xảy loài sán Cũng nhiều loai sán lá, sán gan lớn tự thụ tinh thụ tinh chéo, thể sán có quan sinh dục đực Hệ thống sinh dục phát triển, tử sán chứa đầy trứng PGS.TS Phan Địch Lân (1994), phân biệt khái quát hai loài sán gan sau: - Một loài có chiều dài thân gấp ba lần chiều rộng, sán dài từ 25 – 75 mm, rộng từ -12mm, vai sán nhìn không rõ rệt, nhánh ruột chia tỏa nhiều nhánh ngang, loài F.gigantica Hai rìa bên thân sán song song với nhau, đầu cuối thân tù Giác bụng tròn lồi Ruột, tuyến noãn hoàng, buồng trứng tinh hoàn phân nhánh Trứng hình bầu dục, màu vàng nâu, phôi bào to xếp kín vỏ Kích thước trứng: 0,125 - 0,170 x 0,06 - 0,10 mm - Loài có thân lá, thân rộng, phía đầu lồi hẳn phía trước làm cho sán có “vai đặc biệt”, nhánh ruột chia nhỏ, loài F.hepatica Fasciola hepatica dài 18 - 51 mm, rộng - 13 mm, phần thân trước nhô ra, tạo cho sán có vai bè hai bên Hai rìa bên thân sán không song song với mà phình chỗ vai thót lại đoạn cuối thân Những ống dẫn tuyến noãn hoàng chạy ngang, chia vùng sán thành phần trước phần sau thân Phần sau thân có tinh hoàn phận sinh dục đực Tinh hoàn phân nhiều nhánh xếp phía sau thân Tử cung phần thân trước tạo nên mạng lưới rối tơ vò Buồng trứng phân nhánh nằm sau tử cung Trứng sán có hình thái, màu sắc tương tự trứng loài F gigantica, kích thước 0,130,145×0,07-0,09 mm Hình : Hình thể sán gan lớn trưởng thành (A F hepatica; B F.gigantica) (Nguồn: www.Iranhelminthparasites com) Hình : Cấu tạo loài sán gan lớn (Nguồn: www.impe-qn.org.vn ) 10 mang điện phụ thuộc hình dạng kích thước phân tử protein, phân tử có kích thước lớn chạy chậm phân tử nhỏ  Cách tiến hành: A, Chuẩn bị dung dịch hóa chất    Pha gel separating nồng độ 12%T: +2,64ml nước +1,5ml dung dịch + 60µl dd +1,8 ml dd + TEMED 100µl +APS 130µl Pha gel stackinggel nồng độ 12% T: +2ml dd +1ml dd +40µl dd +0,96 ml nước +50µl TEMED +100µl APS Chuẩn bị dung dịch sample buffer: DD xanh – glycerol dùng để pha mẫu: glycerol 2ml + SDS10% 2,5ml + 2ml đệm tập trung + màu bromphenol 80µl + nước cất 10ml Bảo quản 4◦C  Dung dịch đệm điện di: Dung dịch đệm bình điện di: Tris base (12g); glycine (57,6g) Hòa tan  chỉnh 1000ml Bảo quản 4◦C Chuẩn bị dung dịch nhuộm: Coomassie R250 (2,5g); Methanol(600ml); acid acetic (90ml) Trộn  vào để hòa tan + 300ml nước Chuẩn bị dung dịch tẩy nhuộm: Methanol (50ml); acid acetic (75ml); nước 1000ml B, Chuẩn bị mẫu thử Làm biến tính protein cách đun sôi chúng với chất tẩy rửa anion,SDS, mercapthoethanol dithioltheol 43 Mẫu thử sau xác định nồng độ trộn với dung dịch pha mẫu (1:1) đun mẫu 100◦C phút C, Chuẩn bị gel Chuẩn bị kính để đổ gel Chuẩn bị gel polyacrylamide có nồng độ 12%T Bề mặt gel phân giải + Isobutanol 0,5ml dung dịch + 20µl dung dịch + 1,48ml nước Đổ gel phân tách (separating gel) trước cho butanol vào để nén mặt gel ( không để tạo bọt khí)  để gel đông  rửa lớp butanol nước cất  đổ stacking gel, cài lược để tạo giếng  gel trùng ngưng xong lấy lược lắp gel vào bình điện di Gel nắp vào điện cực, sau đặt điện cực có gel vào bể chứa ( running buffer = Tris/ glycin + SDS, pH= 8,3) đủ ngập gel D, Tiến hành Mẫu vừa chuẩn bị cho vào giếng gel, chạy điện di với tốc độ 150 Vol 30 phút Điện di xong ngâm dung dịch hoạt hóa EDTA 1mM, glycine 0,1M, L-cystein 10mM pH = 30 phút Thay nước ngâm tiếp dung dịch để qua đêm Gel nhuộm Commassie blue điều kiện nhiệt độ phòng có chế độ lắc Tẩy cách ngâm gel dung dịch tẩy gel suốt Thay dung dịch thuốc tẩy dung dịch có màu tương đương với màu gel Xem kết chụp ảnh gel 3.3.6, Phương pháp xử lí số liệu Các số liệu thu thập từ kết nghiên cứu xử lí phương pháp thống kê sinh học 44 PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết hình thái sán gan lớn Để phân biệt loài F hepatica F gigantica, tác giả trước thường dựa chủ yếu vào đặc điểm: Kích thước F gigantica dài hơn, phần nhô lên vai phần đầu hình nón ngắn hơn, buồng trứng chia nhiều nhánh hơn, kích thước giác bụng lớn giác miệng…[40] Tuy nhiên, nhiều tác giả cho số có khoảng gối lên mặt số lượng kích thước, nhiều trường hợp khó phân biệt F hepatica F gigantica Thời gian gần số nghiên cứu số BR (chu vi thể), tỷ số BL/BW, VS-P có khác biệt rõ ràng, có khoảng gối lên nhau; nên coi số hình thái có giá trị việc phân biệt F hepatica F gigantica [59, 60] Trong nghiên cứu này, để thu số hình thái SLGL, áp dụng cách xác định số Urquhart cộng (2006) [64] Chúng tiến hành đo đạc kích thước số số hình thái quan trọng 15 mẫu SLGL thu thập tỉnh Bắc Giang Hà Nội Kết thu sau: Bảng Kích thước chiều dài, chiều rộng, giác miệng, giác bụng khoảng cách từ giác bụng đến cuối thân sán gan lớn S T T Chiều dài BL (mm) Chiều rộng BW ( mm) Giác miệng OS (µm) 28 31 26 26 26 35 28 10 8 296,62 487,99 342,56 432,54 555,17 379,24 255,32 Giác Khoảng cách từ bụng giác bụng đến VS (µm) cuối thân VS-P ( mm) 685,18 24,9 561,76 27,5 734,81 22,5 928,86 22,4 738,28 23,3 600,14 31,2 946,1 24,7 Tỷ lệ BL/BW ( mm) 3,5 4,42 2,6 3,71 3,25 5,83 3,5 45 26 34 10 385,87 513,33 971,47 1186,43 22,5 26,7 4,33 3,4 10 11 12 13 14 26 18 25 32 33 9 375,83 499,47 246,91 239,79 240,96 493,90 413,48 564,64 637,49 760,53 22,3 15 21,32 29,1 28,8 2,88 2,25 2,77 4,57 3,7 Kết bảng cho biết: Đo kích thước hình thái học 14 mẫu SLGL nhuộm Carmin (Bảng 4.1) cho thấy: hầu hết mẫu sán có dạng thon dài, chiều dài SLGL dao động từ 25 mm đến 35 mm, chiều rộng dao động từ mm đến 10 mm Kích thước giác bụng lớn giác miệng Cụ thể kích thước giác bụng dao dộng từ 423,48 µm đến 1186,43 µm giác miệng dao dộng từ 239,79 µm đến 555,17 µm Khoảng cách từ giác bụng đến cuối thân trung bình dao dộng từ 15 mm đến 31,2 mm Tỷ lệ BL/BW sán dao động từ 2,25 đến 5,83 So với số liệu Periago et.al (2006) đa số sán giống F.gigantica (có 9/14 sán có tỷ lệ BL/BW > 3,4), số lại thuộc loài F.hepatica Bảng so sánh kích thước loài sán gan Kích thước F.gigantica Chiều dài thể (mm) 26 – 35 Chiều rộng thể (mm) – 10 Tỷ lệ BL/BW 3,4 – 5,83 Tỷ lệ khoảng cách từ 22,4 – 29,1 giác bụng đến cuối thân (mm) F.hepatica 18 – 33 – 10 1,5 - 3,25 15 – 23,3 46 Kích thước chiều dài thể sán nhóm có chồng lấn lên nhau: nhóm loài F.gigantica có chiều dài thể dao động từ 26 mm đến 35 mm, chiều rộng từ 6mm đến 10mm; nhóm F.hepatica có chiều dài thể dao động từ 18mm đến 33mm, chiều rộng từ 8mm đến 10 mm.Khoảng cách từ giác bụng đến cuối thân tương tự Như nói trên, số số hình thái SLGL, số BL, BW, VS-P BL/BW số quan trọng để phân loại SLGL mặt hình thái Từ định loại loài sán gan mà trâu bò bị nhiễm kiểm tra mẫu gan số lò mổ thuộc Bắc Giang Hà Nội Trong nghiên cứu chúng tôi, qua biểu đồ ta thấy sán gan loại Fasciola gigantica chiếm 64% tổng số định loại sán gan loại Fasciola hepatica chiếm 36% tổng số định loại Như phần lớn trâu bò Bắc Giang, Hà Nội bị nhiễm sán F.gigantica Điểm lại số nghiên cứu sán gan lớn Việt Nam, hầu hết cho SLGL F gigantica (Nguyễn Quốc Doanh CS, 2006 ); Nguyễn Thế Hùng CS, 2008); ( Phan Địch Lân, 1980); (Nguyễn Thị Hoàng Yến, 2014) tiến hành định loại 150 mẫu sán gan lớn có 90 mẫu/150 mẫu phù hợp với F.gigantica chiếm 60% Kết phân loại hình thái nghiên cứu loài SLGL trâu bò tỉnh Bắc Giang Hà Nội F Gigantica chiếm 64% tổng số sán định loại Đối với SLGL, kích thước hình dạng SLGL thay đổi phụ thuộc vào vật chủ ký sinh, số lượng sán nhiễm vật chủ tình trạng dinh dưỡng vật chủ, thời gian thu thập mẫu năm… 47 Hình : Một số hình ảnh sán gan lớn (Ký hiệu mẫu: BGS02: Bắc Giang sán 02, HNS01: Hà Nội sán 01, HNS02: Hà Nội sán 02 ) Hình : Hình thể kích thước mẫu SLGL số điểm nghiên cứu (ký hiệu mẫu: HNS 02: Hà Nội sán 02) Sán gan lớn Fasciola spp có hình dẹt hình dạng đặc trưng cho loài sán (Hình 9, hình 10) Sán F.gigantica có số điểm khác biệt với 48 F.hepatica kích thước thường dài hơn, trung bình 25 – 75 mm chiều dài (hình 10) – 12 mm chiều rộng, phần thể giống hình dạng loài F.hepatica Hình Kích thước giác bụng giác miệng sán gan lớn Hình ảnh soi từ KHV……vật kính 4x với độ phóng đại 40 ( Hình 12) Kích thước giác miệng sán gan lớn đo 513,33 µm kích thước giác bụng 637,49 µm 4.2 Thu thập sán chế kháng nguyên chất tiết Sau thu thập mẫu lò mổ chế kháng nguyên chất tiết theo quy trình Chúng chế 188ml kháng nguyên chất tiết để eppendorf bảo quản tủ âm -20◦C ( Hình 13 ) Hình Kháng nguyên chất tiết sán gan lớn 49 Kháng nguyên chất tiết sau chế tiến hành phân tích thành phần kháng nguyên thông qua phương pháp điện di gel kết thể hình 4.2 cho thấy kháng nguyên thu chứa nhiều loại protein thể vệt nhuộm với thuốc nhuộm commassie blue -45 kDa Hình : Kết điện di kháng nguyên chất tiết Kháng nguyên chất tiết kháng nguyên thô bao gồm nhiều thành phần protein khác Hình 11 Thành phần MC protein chuẩn bao gồm số loại protein xác định trọng lượng phân tử, thành phần khác ES 1, ES 2, ES 3, ES kháng nguyên chất tiết thô qua lần chế khác bao gồm vạch protein vị trí 28kDa biểu rõ nét gel xuất mẫu kháng nguyên Đối với kháng nguyên thô lần chế khác thành phần nồng độ kháng nguyên có khác biệt định, điểm cần khắc phục kháng nguyên thô Theo nghiên cứu Meshgi cs (2008) sau chạy điện di SDS PAGE mẫu kháng nguyên chất tiết thấy xuất dải protein có khối lượng phân tử 15, 16, 20, 24, 33, 42 kDa Những nghiên cứu khác cho thấy khác số dải protein số lượng phân tử chúng Nguyên nhân loài sán ký sinh vật chủ khác phân bố địa lý Sự tồn kháng nguyên có giá trị lớn chẩn đoán bệnh người động vật Silva cs (1996) cho thấy dải protein có khối 50 lượng 25- 27- kDa dùng để chẩn đoán bệnh nhân nhiễm F.hepatica F.gigantica Độ nhạy kháng nguyên chất tiết Rokni Ghravi (2002) chứng minh chạy điện di SDS – PAGE so với kháng nguyên thân Có giá trị lớn chẩn đoán miễn dịch, chẩn đoán bệnh sán gan lớn người động vật Do thời gian thực tập có hạn nên thí nghiệm tiến hành chiết tách thành phần protein có mặt kháng nguyên chất tiết Kết tiền đề cho việc phân tích chọn lựa thành phần kháng nguyên đặc hiệu mà chúng tối dự kiến tiếp tục nghiên cứu Tuy kết ban đầu đóng vai trò quan trọng việc nhận biết thành phần protein kháng nguyên làm sở cho nghiên cứu sâu lĩnh vực miễn dịch bệnh sán gan 51 PHẦN V KẾT LUẬN - TỒN TẠI - ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Kết hình thái học SLGL trưởng thành nghiên cứu đa số Fasciola gigantica Dựa vào tỷ lệ chiều dài/chiều rộng thân sán có 9/15 mẫu phù hợp với F gigantica (chiếm 60%) Kết phân loại hình thái nghiên cứu loài SLGL trâu bò Hà Nội Bắc Giang F gigantica Thu thập chế 188ml kháng nguyên chất tiết Dịch tiết sán gan lớn chứa thành phần protein trội có trọng lượng phân tử khoảng 28kDa Đặc tính khàng nguyên tiết thành phần protein đặc hiệu so với kháng nguyên thân Fasciola sp nên sử dụng để chẩn đoán bệnh sán gan lớn người xác 5.2 Tồn Do điều kiện thời gian thực tập ngắn, nhiều vấn đề nghiên cứu chưa hoàn thiện Chưa có đầy đủ dụng cụ, thiết bị 5.3 Đề nghị Cần có phối hợp phương pháp phân loại SLGL mặt hình thái phân loại sinh học phân tử để có kết luận xác loài Trên sở ứng dụng kỹ thuật phân tử để nghiên cứu đặc tính enzyme mục đích chẩn đoán điều chế vaccine chống sán gan lớn 52 MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU Hình : Tìm sán gan trưởng thành ống dẫn mật Hình : : Sán trưởng thành sau nhuộm 53 Hình : Ngâm sán cồn 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu nước Bùi Khánh Linh Kiểm tra kháng nguyên chất tiết dùng chẩn đoán sán gan bò phản ứng ELISA, luận văn Thạc sỹ, 1999 Đoàn Văn Phúc, Vương Đức Chất, Dương Thanh Hà Kết điều tra nhiễm sán gan trâu bò khu vực Hà Nội ứng dụng điều trị Tạp chí Nông Nghiệp Công nghiệp thực phẩm số 1, 1995; 36-37 Lương Tố Thu cs Nghiên cứu chế kháng nguyên chất tiết Fasciola ứng dụng ELISA phát kháng thể sán gan Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y số – Tập IV, 1997 Nguyễn Quốc Doanh, Lê Thanh Hòa Một số đặc điểm hình thái phân tử sán gan (Fasciola sp.) bò tỉnh Nghệ An Cao Bằng Tạp chí Kỹ thuật Thú y 2006, tập XIII, số 5, tr.59-67 Bộ Y tế, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương (2006), “Hướng dẫn chẩn đoán điều trị số bệnh giun sán Việt Nam”, Hà Nội – 2006, tr 40-48 Nguyễn Văn Đề (2004), "Tình hình bệnh sán gan lớn Fascicoliasis đƣợc phát miền Bắc Việt Nam", Tạp chí Y học thực hành, 8, tr 40-44 Đỗ Ngọc Ánh, Nguyễn Khắc Lực, 2012 Xác định loài sán gan lớn gây bệnh bò người miền Bắc hình thái học sinh học sinh học phân tử Tạp chí y dược học quân sự, 9:121129 Lê Thanh Hòa, Nguyễn Văn Đề, 2002 55 Xác định loài sán gan lớn (Fasciola gigantica) Việt Nam phương pháp sinh học phân tử hệ gen ty thể sử dụng gen Nad1 (nicotinamide dehydrogenase subunit 1) Tạp chí Phòng chống sốt rét bệnh ký sinh trùng, 3:41-48 Lê Quang Hưng, Hồ Việt Mỹ, Võ Hưng, Nguyễn Văn Quốc, Đặng Tất Thế, Cao Văn Viên, Trần Vinh Hiển, Trần Thị Kim Dung, 2003 Nghiên cứu định loại đặc điểm dịch tễ học sán gan lớn Bình Định Báo cáo hội nghị phòng chống bệnh sán người WHO FAO tổ chức Hà Nội 10 Trịnh Văn Thịnh, 1963 Ký sinh trùng thú y, Nxb Nông thôn, Hà Nội, tr 281 - 292 11 Trịnh Văn Thịnh, Đỗ Dương Thái , 1978 Công trình nghiên cứu ký sinh trùng Việt Nam, tập II: Giun sán động vật nuôi , Nxb Khoa học kỹ thuật Hà Nội, tr 112 – 118 12 Lương Tố Thu, Bùi Khánh Linh, 1996 Tình hình nhiễm sán gan (Fasciola) kết thử nghiệm Fasinex tẩy sán gan cho trâu bò Hội thú y Việt Nam, số 1, tr 74-81 13 Phan Địch Lân , Lê Hồng Căn, 1972 "Ký chủ trung gian sán gan trâu F.gigantica" Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, số 8, tr 304 – 310 14 Phan Địch Lân, 1980 Bệnh sán gan trâu, bò Fasciola gigantica phía Bắc Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ Thú y, Viện Thú y quốc gia, tr 34 – 47 15 Phan Địch Lân, 1985 "Những nghiên cứu sán gan bệnh sán gan trâu bò nước ta" Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, số 6, tr 49-57 56 B Tài liệu nước Marcilla, M D Bargues and S Mas-Coma A PCR-RFLP(2002) Assay for the distinction between Fasciola hepatica and Fasciola gigantica” Mol Cell Probes.Oct; 16(5): 327-33 Ichikawa, M., Itagaki, T., 2010 “Discrimination of the ITS1 types of Fasciola spp based on a PCR-RFLP method” Parasitol Res 106, 757–761 M.V Periago, et al 2006 First phenotypic description of Fasciola hepatica/Fasciola gigantica intermediate forms from the human endemic area of the Nile Delta, Egypt Infection, Genetics and Evolution 2008, 8, pp.51-58 Alicata, J.E (1938) Observations on the life history of Fasciola gigantica, the common liver fluke of cattle in Hawaii and the intermediate host Fossaria ollula Bulletin of the Hawaii Agricultural Experimental Station 80, 22pp Amer S., Dar Y., Tada C., Fukuda Y., Ichikawa M., Itagaki T and Nakai Y., 2011 Identification of Fasciola species isolated from Egypt based on 56 sequence analysis of genomic (ITS1 and ITS2) and mitochondrial (NDI and COI) gene markers Parasitology International, 60:5-12 Grigoryan GA., 1958 Experimental study of Fasciola gigantica infestation in sheep Trudy Armyansk Inst Zhivotnovod i Veterinariya, 3:155–168 6.Hiroshima Yamasaki, Tadashi Aoki and Hiroshi Oya Cystein proteinase from liver fluke Fasciola spp: Purification, characterization, localization and application to immunodiagnosis 57 [...]... trong các bệnh giun sán xuất bản những năm 1950 đến các nghiên cứu phân loại miễn dịch giun sán tự nhiên và thu được, lý luận và cơ chế của các quá trình đáp ứng miễn dịch ký sinh trùng nói chung và giun sán nói riêng: cấu trúc kháng nguyên của sán lá gan 1996-1971 đã được Climenco nghiên cứu Sau đó, hàng loạt các nghiên cứu về cấu trúc kháng nguyên, sự hình thành kháng thể chống sán lá gan, các nghiên. .. Mỹ và cs (2000), sán lá gan lớn thường gây tổn thương gan và có thể gây nên những biến chứng nặng nề ở vật chủ 25 Trâu, bò được xem là vật chủ chính của sán lá gan lớn và người là vật chủ tình cờ do ăn rau sống hoặc uống nước bị nhiễm ấu trùng sán lá gan lớn 2.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2.3.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước thuộc lĩnh vực của đề tài Bệnh sán lá gan. .. Vòng đời của sán lá gan lớn Sự phân bố các loài ốc - vật chủ trung gian của sán lá gan phụ thuộc vào các vùng địa lý khác nhau Theo Phạm Văn Khuê và cs (1996) [3], vật chủ trung gian của sán lá Fasciola là các loài ốc nước ngọt Lymnaea: L auricularia, L swinhoei, L viridis, Agalba truncatula, Radix ovata Phan Địch Lân (1985) [11] đã nghiên cứu đặc điểm sinh học của ốc - vật chủ trung gian của F.gigantica... dịch cho vật chủ Sự nghiên cứu kháng nguyên tạo ra từ chất thải, chất bài tiết trong quá trình trao đổi chất là một hướng nghiên cứu đang được mở rộng, áp dụng hàng loạt các phương pháp miễn dịch hóa học, hóa sinh học, khuyếch tán trên thạch…  Dịch tiết sán lá gan lớn trong thời kì kí sinh: + Protein tiết và đáp ứng miễn dịch Protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn được tiết ra ở các giai đoạn phát... bò lớn hơn đàn dê, cừu - Thành phần loài sán lá gan lớn cần phải tiếp tục nghiên cứu tiếp, theo một số tác giả điều tra bước đầu cho thấy, loài sán lá gan lớn ở Việt Nam chủ yếu là F.gigantica Trâu, bò ở nước ta có đặc điểm chăn thả rông, đó là điều kiện để trâu bò nhiễm bệnh sán lá gan lớn cao hơn các nơi khác trên thế giới, kể cả tỷ lệ nhiễm, cường độ nhiễm Khả năng phát tán mầm bệnh sán lá gan lớn. .. về sán lá gan và bệnh sán lá gan trên trâu bò, ốc trung gian truyền bệnh và các vấn đề có liên quan, đặc biệt trong các công trình nghiên cứu của các nhà khoa học Liên Xô giai đoạn những năm 50 –60, phải kể đến một mảng nghiên cứu quan trọng về miễn dịch học ký sinh trùng, miễn dịch học các bệnh giun sán, mở ra một hướng nghiên cứu mới cho nhân loại Từ các nghiên cứu đầu 28 tiên của các tác giả Sulin,... dịch của tế bào chủ bằng sự phân cắt các immunoglobulins Do đó, việc xác định và tinh chế thành phần protease này có ý nghĩa quan trọng trong việc phòng ngừa và điều trị bệnh sán lá gan lớn ở người và gia súc Các thử nghiệm tạo vaccine từ các loại protease trong vật liệu tiết của sán lá gan lớn ở giai đoạn non và trưởng thành đã được thực hiện cho thấy có kết quả tốt tác động lên sự dinh dưỡng và phát... Nguyễn Trọng Kim và cs (1997), giữa tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán lá gan của ốc - vật chủ trung gian với tỷ lệ nhiễm sán lá gan của trâu có mối tương quan thuận, nghĩa là nếu tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán lá gan ở ốc nước ngọt cao thì tỷ lệ nhiễm sán lá gan của trâu ở khu vực đó cũng cao Vòng đời phát triển của sán lá gan nước ta được xác định với các 11 khoảng thời gian như sau: Fasciola trưởng thành ký sinh trong... súc trước khi sán lá gan kịp phá hoại các nhu mô gan Ở Việt Nam, các phương pháp ký sinh trùng học và các phương pháp huyết thanh học như kết tủa khuyếch tán trên thạch (Bùi Khánh Linh và cs, 2003), ELISA phát hiện kháng thể (Lương Tố Thu và cs, 1997) trong chẩn đoán bệnh sán lá gan cũng đã được nghiên cứu 2.3.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu nước ngoài thuộc lĩnh vực của đề tài Sán lá gan được biết... gel agarosa Sự di chuyển của các phân tử sinh học trên gel phụ thuộc vào kích thước của lỗ gel, điện tích của phân tử cần phân tách và điện trường Giới hạn trọng lượng phân tử của các phân tử sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-acrylamide: nếu nồng độ gel thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thước lớn và ngược lại nếu nồng độ