ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM /// Đào Thị Ngọc Ánh NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI, KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DDT VÀ SINH LACCASE CỦA CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ ĐẤT Ô NHIỄM HỖN HỢP THUỐC TRỪ SÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM /// Đào Thị Ngọc Ánh NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI, KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DDT VÀ SINH LACCASE CỦA CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ ĐẤT Ô NHIỄM HỖN HỢP THUỐC TRỪ SÂU Chuyên ngành Mã số : Sinh học thực nghiệm : 60.42.30 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà Thái Nguyên - 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Lời Cảm Ơn ! Trong trình nghiên cứu vừa qua, gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến hướng dẫn, bảo tận tình PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà, anh chị nhóm nghiên cứu Công nghệ sinh học xử lý khử độc chất ô nhiễm hữu khó phân hủy, phòng Công nghệ Sinh học Môi trường, đặc biệt Ths Nguyên Bá Hữu, KS Đàm Thúy Hằng, KS.Nguyễn Nguyên Quang, KS Nguyễn Quang Huy Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Khoa sau đại học, Khoa Sinh-Kỹ thuật nông nghiệp – Trường đại học Sư phạm – Đại Học Thái Nguyên lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, tận tình dạy dỗ tạo điều kiện cho hoàn thành khóa học thực luận văn Bên cạnh đó, xin cảm ơn người thân gia đình bạn bè tạo điều kiện động viên giúp đỡ vật chất tinh thần để hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2009 Đào Thị Ngọc Ánh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BẢNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4,- dichlorophenoxyacetic acid 2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,3,7,8-TCDD 2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-dioxin ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) bp Base pair DDE Dichlorodiphenyldichloroethylene DDD Dichlorodiphenyldichloroethane DDT Dichloro - Trichloroethane Diphenyl DNA Deoxyribonucleic acid EC Enzyme Commission EPA U.S Environmental Protection Agency HCH Hexacyclohexan Lac Laccase LB Luria - Bertani LiP Lignin peroxidase MnP Manganese peroxidase PAH Polycyclic aromatic hydrocarbon PCB Polychlorinated biphenyl PCR Polymerase Chain Reaction POP Persistent Organic Pollutant RBBR Remazol brilliant blue R RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indodyl- β galactosidase Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học MỤC LỤC MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA DDT 1.1 Cấu trúc DDT 1.2 Tính chất lý hóa DDT ẢNH HƢỚNG ĐẾN MÔI TRƢỜNG VÀ SỨC KHỎE CON NGƢỜI CỦA DDT 2.1 Ảnh hƣởng đến môi trƣờng 2.2 Ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời TÌNH TRẠNG Ô NHIỄM DDT 3.1 Nguồn gốc phát sinh 3.2 Tình trạng ô nhiễm DDT giới 3.3 Tình trạng ô nhiễm DDT Việt Nam CÁC PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ Ô NHIỄM DDT 4.1 Các phƣơng pháp cơ, hóa lý 4.1.1 Phương pháp chôn lấp, cô lập 4.1.2 Phương pháp đốt có xúc tác 4.1.3 Phương pháp phân hủy kiềm nóng 4.2 Phƣơng pháp phân hủy sinh học PHÂN HỦY SINH HỌC DDT 5.1 Khả phân hủy DDT vi sinh vật 5.1.1 Loại clo trình khử 5.1.2 Khoáng hoá DDT nấm thủy phân lignin 5.1.3 Phân hủy DDT vi khuẩn điều kiện hiếu khí 5.2 Các điều kiện môi trƣờng ảnh hƣởng đến phân hủy sinh học DDT dẫn xuất DDT LACCASE 6.1 Định nghĩa 6.2 Cấu trúc phân tử laccase 6.3 Cơ chế xúc tác laccase 6.4 Tính chất hóa sinh laccase 6.5 Sự phân bố số vi sinh vật sinh laccase 6.6 Gene mã hóa laccase 6.7 Ứng dụng laccase 6.8 Lignin peroxidase Mangan peroxidase 6.8.1 Lignin peroxidase 6.8.2 Mangan peroxidase PHÂN LOẠI VI SINH VẬT 7.1 Phân loại theo phƣơng pháp truyền thống 7.2 Phân loại phƣơng pháp xác định so sánh trình tự gene mã hóa 18S Rrna Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 6 6 7 11 11 13 14 16 16 16 17 17 18 20 20 21 22 23 26 27 27 28 30 32 33 34 36 37 37 38 39 39 39 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học 7.2.1 Một số phương pháp phân loại sinh học phân tử 7.2.2 Phân loại dựa vào trình tự gene mã hoá 18S rRNA PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VẬT LIỆU 1.1 Nguyên liệu 1.2 Hóa chất 1.3 Thiết bị 1.4 Môi trƣờng nuôi cấy PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng nấm sợi 2.2 Sàng lọc khả sinh Lac, LiP, MnP 2.3 Nghiên cứu khả phân hủy DDT chủng FNA1 2.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme 2.4.1 Xác định hoạt tính laccase 2.4.2 Xác định hoạt tính LiP 2.4.3 Xác định hoạt tính MnP 2.5 Khảo sát điều kiện môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả phát triển sinh laccase chủng FNA1 2.6 Xác định số tính chất hóa sinh laccase thô 2.7 Phân loại nấm sợi dựa vào xác định so sánh trình tự gen mã hóa 18S rRNA 2.7.1 Tách DNA tổng số từ nấm sợi 2.7.2 Nhân đoạn gen kỹ thuật PCR 2.7.3 Gắn sản phẩm PCR vào vectơ biến nạp vào E.coli 2.7.4 Tách chiết DNA plasmid 2.7.5 Kiểm tra plasmit mang sản phẩm PCR mong muốn 2.7.6 Điện di kiểm tra DNA tổng số 2.6.8 Xây dựng phát sinh chủng loại 2.6.7 Xác định trình tự đoạn gene mã hóa 16S rRNA PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI KHUẨN LẠC VÀ CUỐNG SINH BÀO TỬ CỦA CÁC CHỦNG FNA1, FNA2, FNA3 SÀNG LỌC KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP Lac, LiP, MnP KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DDT CỦA CHỦNG FNA1 CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ẢNH HƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP LACCASE CỦA CHỦNG FNA1 4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ, pH môi trường nuôi cấy, nồng độ NaCl 4.1.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 4.1.2 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy 4.1.3 Ảnh hưởng nồng độ NaCl 4.2 Ảnh hưởng nồng độ DDT nồng độ glucose 4.2.1 Ảnh hưởng nồng độ DDT 4.2.2 Ảnh hưởng nồng độ glucose Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 40 42 42 42 42 42 43 45 45 45 45 46 46 47 47 48 49 50 50 51 53 53 54 55 55 55 56 56 57 59 64 64 64 65 67 68 68 69 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học 4.3 Ảnh hưởng chất cảm ứng 4.3.1 Guaiacol, veratyl alcohol, CuSO4 4.3.2 Các chất ô nhiễm khác 4.4 Ảnh hưởng chất hoạt động bề mặt 4.5 Ảnh hưởng nguồn carbon, nitơ môi trường thay 4.5.1 Ảnh hưởng nguồn carbon 4.5.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 4.5.3 Ảnh hưởng môi trường thay MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA LACCASE THÔ 5.1 pH tối ưu độ bền pH 5.1.1 pH tối ưu 5.1.2 Độ bền pH 5.2 Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động laccase độ bền nhiệt 5.2.1 Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động laccase 5.2.2 Độ bền nhiệt PHÂN LOẠI CHỦNG NẤM SỢI FNA1 BẰNG PHƢƠNG PHÁP SO SÁNH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN MÃ HÓA 18S rRNA 6.1 Tách chiết DNA tổng số 6.2 Nhân đoạn gen 18S rRNA kỹ thuật PCR 6.3 Tách dòng gen 18S rRNA vectơ pTZ57R/T 6.4 So sánh trình tự đoạn gen mã hóa 18S rRNA chủng FNA1 KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 71 71 72 74 76 76 78 80 81 81 81 83 84 84 85 86 86 87 88 91 94 95 96 103 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học MỞ ĐẦU DDT (Dichloro - Trichloroethane Diphenyl) thuốc trừ sâu tổng hợp đƣợc biết đến nhiều DDT đƣợc tổng hợp vào năm 1874, nhƣng thuộc tính thuốc trừ sâu DDT 1939 đƣợc khám phá Vào năm đầu Chiến tranh Thế giới thứ II, DDT đƣợc sử dụng với lƣợng lớn để kiểm soát muỗi truyền bệnh sốt rét, bệnh sốt phát ban, bệnh côn trùng khác quân đội lẫn dân cƣ DDT trở thành loại thuốc trừ sâu phổ biến sử dụng nông nghiệp Chúng có mặt khắp nơi, không khí, đất, nƣớc lƣợng lớn đƣợc giải phóng phun cánh đồng rừng để diệt muỗi côn trùng Ngày DDT bị cấm sử dụng tính độc nhƣ có khả gây ung thƣ tiềm tàng, gây đột biến gây ô nhiễm môi trƣờng nghiêm trọng Để bảo vệ môi trƣờng sức khỏe ngƣời, cần phải xử lý khử độc DDT môi trƣờng đất nhƣ môi trƣờng khác DDT đất giảm bay hơi, xói mòn đất, hấp thu động vật, thực vật phân hủy sinh học vi sinh vật có sẵn đất nhƣng với thời gian tƣơng đối lâu Trên giới nhƣ Việt Nam, có số phƣơng pháp khử độc khác đƣợc nghiên cứu áp dụng Trong phƣơng pháp xử lý sinh học nhờ vi sinh vật hệ enzyme chúng tiết hƣớng có nhiều triển vọng Hệ enzyme sử dụng xử lý sinh học chủ yếu enzyme ngoại bào, chúng có khả phá vỡ liên kết hợp chất hữu xúc tác chuyển hóa chúng thành chất độc dạng dễ bị phân hủy Nhóm enzyme có vai trò lớn trình phân hủy DDT nhƣ chất thuộc POPs khác gồm có laccase (Lac), mangan Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học peroxidase (MnP) lignin peroxidase (LiP), laccase có vai trò quan trọng bắt đầu đƣợc quan tâm nghiên cứu giới Việt Nam Tại Nhóm nghiên cứu Công nghệ sinh học xử lý khử độc chất ô nhiễm hữu khó phân hủy (Persistent Organic Pollutants – POPs), phòng Công nghệ Sinh học Môi trƣờng, Viện CNSH, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam có nghiên cứu bƣớc đầu khả phân hủy DDT, DDD, DDE sinh enzyme ngoại bào Lac, MnP, LiP [4,5,6] Để làm rõ chất sinh học khả sinh enzyme chủng nấm sợi phân lập từ đất ô nhiễm DDT phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng enzyme ngoại bào vào xử lý chất ô nhiễm khó phân hủy POPs, thực đề tài với tên là: “Nghiên cứu phân loại, khả phân hủy DDT sinh laccase chủng nấm sợi phân lập từ đất ô nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu” Nội dung bao gồm: Phân loại định tên chủng nấm sợi dựa vào đặc điểm hình thái trình tự đoạn gene mã hoá 18S rRNA Nghiên cứu khả phân hủy DDT chủng nấm sợi FNA1 Nghiên cứu khả sinh laccase chủng nấm sợi FNA1 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA DDT 1.1 Cấu trúc DDT DDT thuốc diệt côn trùng, chúng nhóm hợp chất hữu có hai vòng thơm có chứa Clo, bao gồm 14 hợp chất hữu cơ, đó: 71% p,p,- DDT, 14.9% o,p,- DDT, 0.3%p,p,- DDD, 0.1% o,p,-DDD, 4% p,p,- DDE, 0.1% o,p,-DDE, sản phẩm khác 3.5% (Hình 1.1) p-p DDT p-p DDE p-p DDD o-p DDT o-p DDE o-p DDD Hình 1.1 Công thức cấu tạo số đồng phân DDT 1.2 Tính chất lý hóa DDT Tất đồng phân DDT dạng tinh thể màu trắng, không mùi, không vị, có công thức tổng quát C14H9Cl5, khối lƣợng phân tử 354.5 Nhiệt độ nóng chảy khoảng 108.5 - 1090C, áp suất bay 2.53 x10 Pa (1.9 x10 -7mmHg) 200C DDT tan nƣớc (1g/l) nhƣng có khả giữ nƣớc, tan tốt hợp chất hữu đặc biệt mỡ động vật Khả Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học hoà tan DDT nƣớc thấp (hệ số hấp phụ cao) nên DDT có xu hƣớng bị hấp phụ cặn bùn, đất đá, trầm tích Điều có vai trò đặc biệt phân hủy sinh học DDT Một số đặc tính DDT đồng phân đƣợc trình bày phụ lục [59] ẢNH HƢỚNG ĐẾN MÔI TRƢỜNG VÀ SỨC KHỎE CON NGƢỜI CỦA DDT 2.1 Ảnh hƣởng đến môi trƣờng DDT [ 1,1,1-trichloro-2,2-bis-(p-chlorophenyl)ethane] đƣợc tổng hợp vào năm 1874, nhƣng đến 1930, Bác sĩ Paul Muller (Thụy Sĩ ) xác nhận DDT hóa chất hữu hiệu việc trừ sâu rầy từ đƣợc xem nhƣ thần dƣợc có ảnh hƣởng nguy hại đến ngƣời Khám phá mang lại cho ông giải Nobel y khoa năm 1948 DDT đƣợc sử dụng rộng rãi khắp giới cho việc khử trùng kiểm soát mầm mống gây bệnh sốt rét Nhƣng hai thập niên sau đó, số chuyên gia giới khám phá tác hại DDT môi trƣờng sức khỏe ngƣời dân Do đó, Hoa Kỳ từ năm 1972 DDT bị cấm sử dụng hẳn DDT bị nhiễm vào môi trƣờng không khí, nƣớc, đất suốt trình sử dụng, DDT có mặt nhiều vị trí ô nhiễm khác nhau, sau tiếp tục bị lan truyền gây ô nhiễm môi trƣờng Đặc biệt đất, giữ nƣớc thành phần tử rắn trở thành dạng bền vững (EPA 1986) đƣợc EPA Hoa Kỳ xếp vào danh sách loại hóa chất phải kiểm soát có nguy tạo ung thƣ cho ngƣời động vật [59] DDT, DDE (1,1-dichloro-2,2-bis(pchlrophenyl)ethylene), DDD (1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlrophenyl)ethylene) đƣợc thải vào không khí chúng bay từ đất nƣớc nhiễm độc Một lƣợng lớn DDT đƣợc thải vào môi trƣờng nhƣ vào không khí, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học đất nƣớc thông qua trình tƣới, phun diện tích sản xuất nông nghiệp rừng để diệt côn trùng muỗi [59].DDT đồng phân bị ngấm vào mạch nƣớc ngầm đƣợc sử dụng để diệt côn trùng gần cửa sông v.v Trong đất, DDT suy giảm nhờ trình bốc hơi, trình quang phân trình phân hủy sinh học (hiếu khí kị khí) nhƣng trình xảy chậm tạo sản phẩm DDD DDE có độ bền tƣơng tự nhƣ DDT DDD đƣợc sử dụng nhƣ loại thuốc trừ sâu, DDE đƣợc tìm thấy môi trƣờng nhiễm bẩn phân hủy sinh học DDT Quá trình bốc hơi, phân hủy DDT, DDD, DDE đƣợc lặp lại nhiều lần kết DDT, DDD, DDE đƣợc tìm thấy nơi xa Những hợp chất hóa học đƣợc phát đầm lầy, tuyết động vật vùng Bắc Cực & Nam Cực, xa so với nơi chúng đƣợc sử dụng, DDT, DDD, DDE cuối đất thời gian dài, hầu hết bị phân hủy chậm thành DDD DDE thƣờng hoạt động vi sinh vật Chu kỳ bán hủy hợp chất khí bay đƣợc ƣớc tính 1,5- ngày DDT đất phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nhiệt độ, loại đất, độ ẩm v.v vùng nhiệt đới DDT bay dễ vi sinh vật phân hủy nhanh DDT đất ẩm bị phân hủy nhanh đất khô Chúng làm giảm giá trị đất bị phân hủy DDT đƣợc chuyển thành DDE điều kiện hiếu khí kị khí Những hợp chất bốc không khí lắng đọng lại vị trí khác có độc tính cao Chúng sâu đất, thấm qua đất vào mạch nƣớc ngầm Trên bề mặt nƣớc, DDT liên kết phần tử nƣớc, lắng xuống lắng đọng trầm tích Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Gần DDT 12 hoá chất đƣợc nhà khoa học giới xếp vào hạng chất ô nhiễm khó phân hủy (POPs) Năm 1998, đại diện 92 quốc gia giới tụ họp Montreal bàn thảo biện pháp nhằm cấm sản xuất sử dụng hoá chất lý tác hại chúng tích luỹ lâu dài không khí, lòng đất nguồn nƣớc, kết tụ vào mô động vật- nguồn thực phẩm loài ngƣời [7] DDT tích trữ lƣợng lớn cá động vật biển (ví dụ: hải cẩu, cá heo) Tính độc DDT đƣợc biết đến thông qua nghiên cứu kỹ lƣỡng vi sinh vật, động vật không xƣơng sống dƣới nƣớc, cá, lƣỡng cƣ, động vật không xƣơng sống cạn loài động vật có vú khác (chuột hang, thỏ v.v.) Trong động vật này, DDT đƣợc tìm thấy lƣợng lớn mô mỡ tiếp tục di chuyển đến quan khác Ngƣỡng độc DDT đồng phân xác định thông qua số LC50 (LC50 liều gây chết 50% mẫu sinh vật thí nghiệm) số loài động vật thí nghiêm là: LD50 lợn khoảng 1.000mg DDT/kg [12], LD50 thỏ 300mg DDT/kg 4.000-5.000 mg DDD/kg [12] DDT đất đƣợc hấp thụ số thực vật thể ngƣời ăn thực vật [57] 2.2 Ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời Những nghiên cứu dịch tễ học đƣợc tác hại DDT hợp chất có liên quan tới số loài việc sử dụng bị cấm giảm nhiều nƣớc hậu độc hại Nhƣng số liệu ảnh hƣởng ngƣời chƣa đƣợc biết đến nhiều Các nghiên cứu ảnh hƣởng ngƣời đƣợc nghiên cứu công nhân làm việc nhà máy có sản xuất DDT Các nghiên cứu khác cho kết có Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học giá trị nhƣng hạn chế nghiên cứu dịch tễ học nên chƣa xác định đƣợc nguyên nhân gây bệnh từ chúng Con ngƣời bị nhiễm DDT thông qua nhiều cách khác phơi nhiễm trực tiếp gián tiếp Phơi nhiễm trực tiếp, xảy qua phổi qua da Nhiễm gián tiếp xảy ăn thực phẩm nhƣ ngũ cốc, rau đậu bị nhiễm DDT, nhƣ tôm cá sống vùng bị ô nhiễm, DDT vào thể qua đƣờng tiêu hoa tích tụ theo thời gian mô mỡ gan ngƣời Nguồn lây nhiễm DDT thịt, cá, gia cầm sản phẩm từ sữa Nếu ngƣời ăn loại lƣơng thực thực phẩm đƣợc phun DDT ăn kéo dài có nhiều nguy dẫn tới ngộ độc mãn tính, sinh quái thai Mức độ tối thiểu mà ngƣời chịu đựng không gây hại 285 mg/kg DDT có tác động rõ rệt lên hệ thống thần kinh ngoại biên, gây nên rối loạn hệ thống thần kinh, ức chế enzyme chức đòi hỏi dịch chuyển ion dẫn đến tê liệt Những ngƣời bị nhiễm lƣợng lớn gây ngộ độc cấp tính, dễ bị kích động, bị rùng gây tai biến mạch máu não Chúng gây nên đổ mồ hôi, đau đầu, buồn nôn, chóng mặt Những ảnh hƣởng nhƣ xuất hít DDT không khí hấp thụ lƣợng lớn qua da [59] Đối với ngƣời bị nhiễm DDT mức độ thấp (20 mg/ngày) - ví dụ nhƣ ngƣời làm việc nhà máy sản xuất DDT, xuất biến đổi nồng độ enzyme có gan máu Nhiều nghiên cứu DDT, DDE, DDD gây bệnh ung thƣ, mà trƣớc tiên ung thƣ gan, ung thƣ vú, ung thƣ tuỷ [59] Những nghiên cứu Garabrant cộng 1992 nhóm công nhân nhà máy sản xuất thuốc hóa học năm 1948 đến năm 1971 phát DDT Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học gây ung thƣ tủy dẫn đến tử vong vào năm 1953- 1988 [59] Bên cạnh gây nên số bệnh ung thƣ khác nhƣng chƣa đƣợc nghiên cứu kỹ nhƣ: ung thƣ tuyến tiền liệt, ung thƣ tinh hoàn, ung thƣ máu, ung thƣ v.v Trẻ bú sữa mẹ hay sữa tƣơi bị nhiễm độc DDT trực tiếp qua diện DDT sữa tƣơi hay gián tiếp thức ăn ngƣời mẹ Tệ hại nữa, nhiều bà mẹ bị sảy thai vùng ảnh hƣởng DDT Ở nƣớc ta, có số công trình nghiên cứu rút nhận xét tất bà mẹ dù có tiếp xúc hay không tiếp xúc trực tiếp với DDT có lƣợng DDT sữa mẹ cao Vì DDT xâm nhập vào thể chủ yếu qua đƣờng tiêu hóa, cao nhiều lần so với liều lƣợng cho phép OMS (0.05ppm), Liên Xô (0.14ppm) Hungari (0.13ppm) [53] TÌNH TRẠNG Ô NHIỄM DDT 3.1 Nguồn gốc phát sinh DDT (1,1,1-trichloro-2,2-bis (p-chlorophenyl) ethane) đƣợc tổng hợp lần vào năm 1873 nhà khoa học ngƣời Đức Othmar Ziedler Tuy nhiên, phải đến 1939 nhà hoá học Thuỵ Sỹ- Paul Hermann Muller khám phá đặc tính để diệt trừ côn trùng DDT, chúng phá huỷ nhanh chóng hệ thần kinh côn trùng Năm 1948, Paul Muller đƣợc trao giải thƣởng Nobel sinh - y học khám phá DDT có hiệu chống lại rận, bọ chét, muỗi mang mầm bệnh sốt phát ban, dịch hạch, sốt rét, sốt vàng v.v DDT đƣợc dùng rộng rãi 20 năm đƣợc xem nhân tố việc gia tăng sản lƣợng lƣơng thực giới ngăn chặn bệnh tật từ côn trùng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học DDT đƣợc tạo thành từ phản ứng trichloroethanol với chlorobenzen (Hình 1.2) Tên thƣơng mại tên khác DDT bao gồm Anofex, Cesarex, Chlorophenothane, Dadelo, p,p-DDT, dichlorodiphenyltrichloroethane, Dinocide, Didimac, Digmar, ENT 1506, Genitox, Guesapon, Guesarol, Gexarex, Gyrol, Hildit, Ixodex, Kopsol, Neocid, OMS 16, Micro DDT 75, Pentachlorin, Rukseam, R50 Zerdane Hình 1.2 Tổng hợp DDT từ trichloroethanol chlorobenzen DDT loại thuốc hóa học diệt côn trùng đƣợc sử dụng rộng rãi từ chiến tranh giới lần thứ II khắp giới hàng triệu đƣợc sản xuất, sử dụng trƣớc lƣu giữ đất tiếp tục phân tán môi trƣờng Một lƣợng lớn DDT đƣợc giải phóng vào không khí, đất nƣớc sử dụng để diệt côn trùng, muỗi địa điểm nhạy cảm nhƣ cửa sông [59] Đầu năm 1960, nhà hoạt động ngƣời Mỹ Rachel Carson xuất sách Silent Spring khẳng định DDT nguyên nhân bệnh ung thƣ nguy hại đến sinh sản chim làm mỏng lớp vỏ trứng Cuốn sách gây phản đối kịch liệt công chúng kiện dẫn đến lệnh cấm sử dụng DDT nông nghiệp Mỹ Tiếp theo năm 1970 1980, DDT bị cấm sử dụng nông nghiệp hầu hết nƣớc phát triển ảnh hƣởng nguy hại môi trƣờng Mặc dầu vậy, DDT đƣợc sử dụng rộng rãi số quốc gia phát triển Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học 3.2 Tình trạng ô nhiễm DDT giới Do tác hại DDT môi trƣờng sức khỏe ngƣời dân Hoa Kỳ từ năm 1972 DDT bị cấm sử dụng hẳn Tuy nhiên, đến hóa chất gây tác hại vùng nông nghiệp sử dụng vùng quanh nơi sản xuất DDT trƣớc Hiện DDT ngƣng tụ nơi thềm lục địa vùng Palos Verdas (ngoài khơi vùng biển Los Angeles) nhà máy sản xuất DDT Montrose Chemical.co Torrance thải DDT vào hệ thống cống rãnh thành phố vào năm 1971 Việc xử lý ô nhiễm DDT cho vùng ƣớc tính vào khoảng 300 triệu USD [7] Cho đến Mỹ lợi ích kinh tế nên sản xuất DDT để xuất cảng qua Phi châu nƣớc Á châu có Việt Nam DDT loại thuốc sát trùng công hiệu mạnh, đặc biệt quan trọng việc kiểm soát bệnh sốt rét nên đƣợc sử dụng rộng rãi nƣớc phát triển bất chấp nguy gây hại tiềm tàng lâu dài Sự tích tụ nhiều DDT hợp chất có liên quan biển phía Tây Trung Quốc bờ biển khác, lƣợng tích tụ DDT lớn nhƣ: vịnh Bengal, biển Arabian, biển bắc Trung Quốc v.v.Từ năm 1980-1983, có nhiều phân tích tích tụ DDT trầm tích biển EPA [54] Hàm lƣợng trung bình DDT, DDE, DDD là: 0.1, 0.1, 0.2 g/kg (trọng lƣợng khô) Hàm lƣợng DDT sản phẩm chuyển hóa mẫu trầm tích đƣợc phân tích đáy sông vịnh River Washington: 0.1-234 g/kg Sự tích trữ DDT, DDE, DDD tổng lƣợng DDT đáy trầm tích từ sông San Joaquen nhánh sông California-1992 lần lƣợt là:1.4 - 115, 0.7 - 14, 0.4 - 39, 2.2 - 170 (ng/l) [45] Trong Orestinba Creat có hàm lƣợng DDT cao hẳn so với vị trí khác Ở Canada, tổng lƣợng DDT lắng đọng bề mặt trầm tích hồ khác dọc ngang lục địa vào Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học khoảng 9.7g/kg Iwata et al (1993) thu thập phân tích 68 ví dụ hàm lƣợng DDT nƣớc bề mặt từ vài đại dƣơng (18 khu vực) nêu lên ảnh hƣởng chủ yếu lắng đọng khí từ tháng 4/1989-8/1990 Nhiều nghiên cứu cho thấy có mặt DDT mẫu trầm tích với nồng độ cao DDT đƣợc vận chuyển từ khu vực bị ô nhiễm đến Bắc cực Nam cực Tổng lƣợng DDT đại dƣơng New Zealand Ross Iland, Antarctica tháng tháng (1990) là: 0.40 0.81 pg/m3 [14, 33] Vùng Gulf Mexico (1977) chứa trung bình 34pg/m3 DDT với tỉ lệ 10-78pg/m3 [13] Lƣợng DDT cao đƣợc tìm thấy gần khu vực nơi mà DDT đƣợc sử dụng, ví dụ bờ biển Arabian ấn Độ Các khu vực mà lƣợng DDT không khí cao eo biển Malacca, bờ biển phía nam Trung Quốc, vịnh Mexico 3.3 Tình trạng ô nhiễm DDT Việt Nam DDT đƣợc dùng lần Việt Nam vào năm 1949 để phòng ngừa bệnh sốt rét Tuy nhiên, số lƣợng thuốc DDT đƣợc dùng có 315 năm 1961 giảm xuống 22 năm 1974 Từ năm 1957 đến 1990, tổng số lƣợng thuốc DDT nhập cảng có 240.422 Mặc dù việc sử dụng thuốc DDT bị cộng đồng quốc tế ngăn cấm từ năm 1992, việc nhập cảng sử dụng DDT Việt Nam tiếp tục năm 1994 Trong khoảng từ năm 1992 đến năm 1994, số lƣợng thuốc DDT nhập cảng từ Nga lên đến 423.358 Tuy số liệu xác số lƣợng DDT đƣợc sử dụng Việt Nam, nhƣng tin tức nƣớc cho biết thuốc đƣợc sử dụng rộng rãi đặc biệt vùng châu thổ sông Cửu Long vùng có nhiều sông rạch nhiều muỗi mồng [8] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Tại kho dã chiến chứa DDT năm 1967 – 1968 Hà Tĩnh lƣợng tồn dƣ lớn hóa chất Khối lƣợng thuốc DDT kho ƣớc tính khoảng 4- Hiện số thuốc DDT nằm phơi lộ mặt đất, phần thuốc bị phân hủy song phần lớn đó, chúng khuếch tán vào không khí gây ô nhiễm môi trƣờng phân rã ngấm vào đất mạch nƣớc ngầm gây ô nhiễm đất nƣớc khu vực Nghệ An tỉnh tồn lƣu lƣợng tƣơng đối lớn hóa chất bảo vệ thực vật, tỉnh có 25 điểm tồn lƣu hóa chất chất bảo vệ thực, có điểm đƣợc xử lý Phần lớn điểm tồn lƣu hóa chất chất bảo vệ thực nằm gần, nguy hiểm nằm lọt khu dân cƣ Một kết điều tra khác tỉnh Nghệ An cho thấy, DDT nhà kho từ năm 1965 đến năm 1985 Nồng độ DDT thay đổi từ 3.38 đến 960.6 mg/kg mẫu đất từ 0.00012 đến 0.00168 mg/l mẫu nƣớc Trong nhiều năm liên tiếp, mùi thuốc DDT nồng nặc bay xa đến 600 mét Đã có 25 ngƣời chết ung thƣ, 22 trƣờng hợp dị thai đƣợc ghi nhận [8] Do nguy hiểm chất POP nói chung hóa chất bảo vệ thực vật nói riêng sức khỏe ngƣời môi trƣờng, nƣớc giới nhƣ Việt Nam tích cực tiến tới loại trừ cấm sử dụng hoàn toàn chất POP Cụ thể Công ƣớc Stockholm chất hữu ô nhiễm khó phân hủy đời 172 quốc gia tham gia ký kết, có Việt Nam Ở nƣớc ta công ƣớc Stockholm thức có hiệu lực kể từ ngày 14/5/2004 Tham gia công ƣớc này, Việt Nam xây dựng hoàn thiện hệ thống pháp luật để quản lý an toàn hóa chất, giảm thiểu tiến tới loại bỏ chất ô nhiễm hữu khó phân huỷ Đồng thời, phòng ngừa, kiểm soát xử lý an toàn chất này, tiến tới kiểm soát, xử lý tiêu hủy hoàn toàn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 http://www.lrc-tnu.edu.vn Đào Thị Ngọc Ánh Luận văn Thạc sĩ Sinh học kho thuốc bảo vệ thực vật, hóa chất độc hại bị loại bỏ, tồn lƣu CÁC PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ Ô NHIỄM DDT DDT chất có tính độc hại cao, bền vững cao trình phân hủy tự nhiên Một phát thải vào môi trƣờng, chất tồn thời gian dài di chuyển xa khỏi nguồn phát thải ban đầu nhờ gió, nƣớc hay nhờ vào loài động vật di cƣ Ngoài DDT đƣợc hấp thụ dễ dàng vào mô mỡ tích tụ thể sinh vật sống, nồng độ chất trở nên cao theo chiều tăng chuỗi thức ăn, đặc biệt loài sinh vật lớn sống lâu Chính tính chất mà việc loại bỏ, tiêu hủy DDT nhƣ chất bảo vệ thực vật danh mục cấm khác ngày trở nên cần thiết cấp bách không riêng nƣớc ta mà vấn đề quan tâm nhiều nƣớc giới Tùy điều kiện địa hình, tính chất, quy mô vùng ô nhiễm; tùy điều kiện kinh phí để áp dụng quy trình xử lý khác nhau, xử dụng phƣơng pháp nhƣ phƣơng pháp hóa lý; phƣơng pháp bao vây, cô lập nguồn ô nhiễm; hay phƣơng pháp sinh học v.v 4.1 Các phƣơng pháp cơ, hóa lý Có nhiều phƣơng pháp hóa lý đƣợc sử dụng để loại bỏ chất ô nhiễm khó phân hủy Đối với ô nhiễm DDT phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng chôn lấp, cô lập; phân hủy kiềm nóng phƣơng pháp đốt có xúc tác Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn