SVTH: Nguyễn Hoài Thu VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: SÀNG LỌC, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY THÍCH HỢP CỦA CHỦNG NẤM SỢI CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP LACCSE VỚI TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM Người hướng dẫn:TS Đinh Thị Thu Hằng Sinh viên thực hiện:Nguyễn Hoài Thu Lớp: 11-04 Hà Nội - 2015 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Hoài Thu Lời Cảm Ơn ! Trước hết, xin bày tỏ biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà, TS Đinh Thị Thu Hằng tận tình bảo, quan tâm hướng dẫn dìu dắt suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, giúp có thêm nhiều kiến thức kinh nghiệm quý báu nghiên cứu khoa học Tôi xin gửi lời cảm ơn tớiKS Trần Thị Thu Hiền, Th.S Đào Thị Ngọc Ánh, Th.S Ngô Thị Huyền Trang, KS Nguyễn Hải Vân, KS Hoàng Thị Nhung, CN Nguyễn Văn Huynh anh chị phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam quan tâm, giúp đỡ dạy bảo tận tình cho trình làm khóa luận tốt nghiệp Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn thầy cô Khoa Công Nghệ Sinh Học- Viện Đại học Mở Hà Nội tận tình dạy dỗ tạo điều kiện cho hoàn thành khóa học thực khóa luận Bên cạnh đó, xin cảm ơn bố mẹ người thân yêu tạo điều kiện động viên giúp đỡ vật chất tinh thần để hoàn thành khóa luận Hà Nội, ngày 22 tháng 05 năm 2015 Nguyễn Hoài Thu Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Hoài Thu MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ENZYME LACCASE 1.1.1 Giới thiệu laccase 1.1.2 Cấu trúc phân tử laccase 1.1.3 Cơ chế xúc tác laccase 1.1.4 Tính chất hóa sinh enzyme laccase 1.1.5 Sự phân bố khả sinh laccase số VSV 1.1.6 Ứng dụng laccase 10 1.2 TỔNG QUAN VỀ NẤM SỢI 11 1.2.1 Nấm sợi 11 1.2.2 Khả sinh laccase nấm sợi 11 1.3 THUỐC NHUỘM 11 1.3.1 Khái niệm thuốc nhuộm 11 1.3.2 Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm tác hại ô nhiễm 14 1.3.2.1 Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm thuốc nhuộm 14 1.3.2.2 Tác hại ô nhiễm 15 1.3.3 Khả xử lý thuốc nhuộm phương pháp sinh học 16 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Hoài Thu 2.1 VẬT LIỆU 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2 Hóa chất môi trường nuôi cấy 18 2.1.3 Thiết bị, máy móc 19 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.2.1 Sàng lọc chủng nấm có khả sinh laccase 20 2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính laccase 20 2.2.3 Định danh chủng nấm 21 2.2.3.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống 21 2.2.3.2 Phân loại phương pháp xác định so sánh trình tự vùng ITS (ITS1 - 5,8 S - ITS2) 21 2.2.4 Nghiên cứu chọn lọc môi trường điều kiện nuôi cấy thích hợp lên khả sinh laccase chủng nấm đại diện 24 2.2.4.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 24 2.2.4.2 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy 24 2.2.4.3 Ảnh hưởng chất cảm ứng 24 2.2.4.4 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng CuSO4 24 2.2.4.5 Ảnh hưởng nguồn carbon 25 2.2.4.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ vô 25 2.2.5 Đánh giá khả loại màu dịch enzyme thô chủng nấm chọn 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 SÀNG LỌC CÁC CHỦNG NẤM CÓ KHẢ NĂNG SINH LACCASE 27 3.2 PHÂN LOẠI CHỦNG FAXS1 28 3.2.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống 28 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Hoài Thu 3.2.2 Phân loại phương pháp xác định so sánh trình tự vùng ITS (ITS1 - 5,8 S - ITS2) 29 3.3 CHỌN LỌC MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY 31 3.3.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên khả sinh laccase 31 3.3.2 Ảnh hưởng pH lên khả sinh laccase 33 3.3.3 Ảnh hưởng chất cảm ứng lên khả sinh laccase 34 3.3.4 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng CuSO4 lên khả sinh laccase 35 3.3.5 Ảnh hưởng nguồn carbon lên khả sinh laccase 37 3.3.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ vô lên khả sinh laccase 38 3.4 KHẢ NĂNG LOẠI MÀU CỦA DỊCH ENZYME THÔ TỪ CHỦNG NẤM MYROTHECIUM SP FAXS1 39 3.4.1 Khả loại màu nhóm anthraquinone dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 có mặt chất gắn kết 40 3.4.2 Khả loại màu nhóm màu azo dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 có mặt chất gắn kết 41 3.4.3 Khả loại màu thương mại dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 có mặt chất gắn kết 43 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 4.1 Kết luận 46 4.2 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Hoài Thu DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid Ace Acetosyringone bp Base pair CLS Dimaren Black CLS DDT Dichloro - Trichloroethane Diphenyl DNA Deoxyribonucleic acid Đtg Đồng tác giả HCH Hexachlorocyclohexane HOBT Hydroxybenzotriazole ITS Internal transcribed spacer Lac Laccase LF-2B Everzol Red LiP Lignin peroxidase MnP Manganese peroxidase NY1 Acid red 299 NY5 Acid red 266 NY7 Acid blue 281 PCR Polymerase Chain Reaction RBBR Remazol brilliant blue R Si Sinapic acid Syr Syringaldehyde TNT Trinitrotoluen VIO Violuric acid VSV Vi sinh vật Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Hoài Thu DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số vi sinh vật có khả sinh laccase Bảng 1.2 Một số loại thuốc nhuộm đại diện 14 Bảng 2.1 Danh sách màu sử dụng nghiên cứu 18 Bảng 2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy 19 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng xác định hoạt tính laccase 20 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng 23 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt 23 Bảng 2.6 Thành phần chất phản ứng loại màu 26 Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc chủng nấm môi trường PDA chứa guaiacol 27 Bảng 3.2 Hoạt tính laccase chủng nấm sau ngày 28 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Hoài Thu DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc không gian chiều laccase Hình 1.2 Trung tâm hoạt động laccase Hình 1.3 Cơ chế xúc tác laccase Hình 1.4 Cơ chế xúc tác laccase công nghiệp Hình 1.5 Màu Orange II (nhóm màu azo) bị phân hủy tác dụng hydrogenase 17 Hình 3.1.Hình thái chủng FAXS1 hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần 29 Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm PCR trình tự vùng ITS chủng nấm FAXS1 30 Hình 3.3 Cây phát sinh chủng loại chủng nấm sợi FASX1 31 Hình 3.4 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên khả sinh laccase chủng Myrothecium sp FAXS1 32 Hình 3.5.Ảnh hưởng pH lên hoạt tính laccase chủng Myrothecium sp FAXS133 Hình 3.6 Ảnh hưởng số chất cảm ứng lên hoạt tính laccase chủng Myrothecium sp FAXS1 34 Hình 3.7 Ảnh hưởng nồng độ CuSO4 lên hoạt tính laccase chủng Myrothecium sp FAXS1 36 Hình 3.8 Ảnh hưởng nguồn carbon lên hoạt tính laccase chủng Myrothecium sp FAXS1 37 Hình 3.9 Ảnh hưởng nguồn nitơ lên hoạt tính laccase chủng Myrothecium sp FAXS1 38 Hình 3.10 Khả loại màu thuốc nhuộm NY5 (A); RBBR (B) dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 có mặt chất gắn kết 40 Hình 3.11 Sự thay đổi màu NY5 laccase thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 có mặt chất gắn kết 41 Hình 3.12 Sự thay đổi màu RBBR laccase thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 có mặt chất gắn kết 41 Hình 3.13 Khả loại màu thuốc nhuộm NY1 (A), NY7 (B) dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 có mặt chất gắn kết 42 Hình 3.14 Sự thay đổi màu NY1 laccase thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 có mặt chất gắn kết 43 Hình 3.15 Sự thay đổi màu NY7 lacase thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 có mặt chất gắn kết 43 Hình 3.16 Khả loại màu CLS (A) LF-2B (B) dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 có mặt chất gắn kết 44 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Hoài Thu Hình 3.17 Sự thay đổi màu CLS dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 có mặt chất gắn kết 44 Hình 3.18 Sự thay đổi màu LF-2B dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 có mặt chất gắn kết 45 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Nguyễn Hoài Thu MỞ ĐẦU Ngày nay, ô nhiễm môi trường, đặc biệt ô nhiễm môi trường nước ngày tăng trở nên nghiêm trọng Ô nhiễm môi trường tác động thiên tai hoạt động người (sản xuất công nghiệp, nông nghiệp, sinh hoạt, vui chơi v.v.) Trong đó, nước thải từ hoạt động công nghiệp có ảnh hưởng nhiều đến môi trường nước tính đa dạng phức tạp Một ô nhiễm sản xuất công nghiệp gây quan tâm ô nhiễm thuốc nhuộm Việt Nam nước có tình trạng ô nhiễm môi trường thuốc nhuộm trở nên báo động,do cần phải thực nghiêm ngặt tiêu chuẩn việc thải chất thải vào môi trường Các phương pháp xử lý áp dụng phổ biến hấp phụ, keo tụ-tạo kết hợp lọc, oxy hoá hoá học, phương pháp điện hoá v.v thường không đạt hiệu cao Bên cạnh đó, loại màu phân hủy thuốc nhuộm đường sinh học quan tâm vừa mang lại hiệu kinh tế đặc biệt thân thiện với môi trường Trong đó, việc sử dụng enzyme ngoại bào vi sinh vật sinh để xử lý, loại bỏ chất ô nhiễm lựa chọncó tiềm ứng dung cao Các enzyme ngoại bào laccase, maganese peroxidase (MnP), lignin peroxidase (LiP) từ lâu sử dụng để xử lý ô nhiễm môi trường Trong đó, laccase enzyme nghiên cứu sử dụng nhiều Laccase xuất nhiều loại thực vật bậc cao nấm, hoạt động dải pH tối thích rộng có khả chịu nhiệt cao Chúng có khả phân hủy phenol dẫn xuất phenol Ngoài ra, laccase ứng dụng nhiều lĩnh vực khử độc loại màu thuốc nhuộm ngành công nghiệp dệt nhuộm thải ra, xử lý nước thải, công nghiệp giấy thực phẩm, mỹ phẩm v.v Hiện nay, nghiên cứu giới laccase, chủ yếu tập trung vào chủng nấm đảm chúng có khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cao Các nghiên cứu tìm kiếm khai thác enzyme ngoại bào thuộc nhóm oxidoreductase Khóa luận tốt nghiệp Trang SVTH: Nguyễn Hoài Thu Ở Việt Nam, Đặng Thị Thu cộng công bố chủng Pestalotiosis sp BB19_3 phân lập từ rừng quốc gia Ba Bể (Bắc Kạn) có khả sinh laccase cao môi trường có glucose[2] Chủng nấm sợi Aspergillus sp FNA1, phân lập từ đất ô nhiễm DDT- Nghệ An sinh tổng hợp laccase cao môi trường có saccharose [1] Các thí nghiêm nêu cho thấy tầm quan trọng lựa chọn nguồn carbon thích hợp sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật 3.3.6 Ảnh hưởng nguồn nitơvô lên khả sinh laccase Cũng carbon, nitơ thành phần quan trọng ảnh hưởng đến khả sinh trưởng phát triển VSV.Trong môi trường TSH3có nguồn nitơ nitơ vô (NaNO3) nitơ hữu (casein) Do hạn chế thời gian, nên khóa luận nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ vô lên khả sinh laccase chủng Myrothecium sp FAXS1 NaNO3trong môi trường nuôi cấy thay nguồn nitơvô khác như: NH4Cl, (NH4)2SO4, NH4NO3, KNO3với nồng độ g/l để đánh giá Hoạt tính laccase (U/l) ảnh hưởng đến khả sinh laccase chủng Myrothecium sp FAXS1 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 ngày ngày ngày Nguồn nitơ Hình 3.9.Ảnh hưởng nguồn nitơ lên hoạt tính laccase chủngMyrothecium sp FAXS1 Khóa luận tốt nghiệp Trang 38 SVTH: Nguyễn Hoài Thu Kết thể hình 3.9 cho thấy chủng Myrothecium sp FAXS1 sinh laccase tốt nguồn nitơ KNO3 nguồn nitơ vô cơ, với hoạt tính laccase 60.663 50.527 U/lsau ngày nuôi cấy.Các nguồn nitơ vô khác NH4Cl, (NH4)2SO4, NH4NO3làm giảm đáng kể khả sinh laccase, hoạt tính laccase dao động khoảng 2.069 –14.477 U/l, thấp hẳn so với môi trường nguồn nitơ vô nguồn KNO3 Cũng theo số nghiên cứu khác nhiều chủng nấm sinh laccase môi trường chứa nguồn nitơ hữu Pleurotus ostreatus 32[22],Trametes pubescens MB 89 [15] Penicillium simplicissimum H5[49] thích hợp với pepton hayAgaricusbisporus, Trametes versicolor[21] thích hợp với nguồn cao malt có số chủng lại thích hợp với nguồn nitơ vô (NH4)2SO4 nhưDebaryomyces polymophus[46] 3.4 KHẢ NĂNG LOẠI MÀU CỦA DỊCH ENZYME THÔ TỪ CHỦNG NẤM MYROTHECIUM SP FAXS1 Để đánh giá khả loại màu laccase thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1, nhiều màu có tính chất nguồn gốc khác sử dụng gồm màu tổng hợp có phòng thí nghiệm (nhóm màu azo (NY1, NY7), nhóm màu anthraquinone (NY5, RBBR))và màu thương mại (CLS, LF-2B) Thí nghiệm đánh giá khả loại màu tiến hành với nồng độ màu ban đầu 100ppm Chất gắn kết chất vận chuyển điện tử trung gian laccase với chất, làm tăng khả xúc tác laccase Trong năm gần đây, loại màu laccase với tham gia chất gắn kết VIO hay HOBT đưa vào thử nghiệm cho hiệu suất cao công nghiệp nhuộm dệp may Vì vậy, thí nghiệm này, chất gắn kết Ace, Si, VIO, HOBT, Syr sử dụng để nghiên cứu hiệu suất loại màu chủngMyrothecium sp FAXS1 Thí nghiệm loại màu thực điều kiện có không sử dụng chất gắn kết Khóa luận tốt nghiệp Trang 39 SVTH: Nguyễn Hoài Thu 3.4.1 Khả loại màu nhóm anthraquinone dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 có mặt chất gắn kết Các màu NY5, RBBR thuộc nhóm màu anthraquinone sử dụng nghiên cứu hiệu loại màu dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 Kết trình bày hình 3.10 E Si HOBT Ace VIO Syr 60 50 40 30 20 10 30 24 phút phút giờ giờ Thời gian RBBR Hiệu suất loại màu (%) Hiệu suất loại màu (%) NY5 40 35 30 25 20 15 10 E Si HOBT Ace VIO Syr 30 24 phút phút giờ giờ (A) Thời gian (B) Hình 3.10.Khả loại màu thuốc nhuộm NY5 (A); RBBR (B) dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 có mặt chất gắn kết Hiệu suất loại màu thuộc nhóm anthraquinone dịch enzymethô thu từ chủng nấm Myrothecium sp FAXS1 có thay đổikhi sử dung chất gắn kết khác Hiệu suất loại màu NY5 có mặt Ace, Syr, Si thấp, 15%, so với mẫu đối chứng 45% sau 24 VIO chất gắn kết làm tăng hiệu suất loại màu NY5, sau 24 loại 51% Khác với màu NY5, hiệu suất loại màu RBBR laccase từ chủng nấm Myrothecium sp FAXS1 lại thay đỏi đáng kể sử dụng chât gắn kết Laccase chủng nghiên cứu gần không loại màu RBBR Tuy nhiên, sử dụng Ace Syr, hiệu suất loại màu đạt 35% 21% sau 24 Khóa luận tốt nghiệp Trang 40 SVTH: Nguyễn n Hoài Thu Hình 3.11.Sự thay đổổi màu NY5 laccase thô từchủng Myrothecium sp FAXS1 có m mặt chất gắn kết Hình 3.12.Sự thay đổii màu RBBR b laccase thô từchủng Myrothecium sp FAXS1 có m mặt chất gắn kết Nhiều nghiên cứuu th giới cho thấy việc sử dụng chấtt g gắn kết làm tăng hiệu suất loạii màu c laccase từ nấm Bổ sung thêm ABTS (0,16%) làm tăng hiệu suất loạii màu anthraquinone SN4R ttừ 66% lên 90%củaa laccase ttừ chủng Pleurotus ostreatus 32[43 43] Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu khác lạii cho th thấy khả loại màu tốt dịch ch enzyme c trường hợp chấất gắn kết Hiệu suất loại màu RBBR củaa chủng ch Myrothecium sp IMER1 P sanguineuslần sanguineus lượt đạtt 73% 60% không sử s dụng chất gắn kết[39] 3.4.2 Khả ăng loại lo màu nhóm màu azo dịch ch enzyme thô từ t chủng Myrothecium sp FAXS1 có mặt chất gắn kết Laccase thô ch chủngMyrothecium sp.FAXS1có hiệu suấtt loại lo màu NY1 NY7tương đối tốt, kếtt qu trình bày hình 3.13 Khóa luận tốt nghiệp Trang 41 SVTH: Nguyễn Hoài Thu E Si HOBT Ace VIO Syr 80 70 60 50 40 30 20 10 30 24 phút phút giờ giờ Thời gian (A) NY7 Hiệu suất loại màu (%) Hiệu suất loại màu (%) NY1 100 80 60 40 20 E Si HOBT Ace VIO Syr 30 24 phút phút giờ giờ Thời gian (B) Hình 3.13 Khả loại màu thuốc nhuộm NY1 (A), NY7 (B) dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 có mặt chất gắn kết Cả màu khảo sátkhi có mặt chất gắn kết Ace,hiệu suất loại màu dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 cho kết tốt nhất, đạt 67% màu NY1 94% màu NY7sau 24 giờ.Kế tiếp Ace chất gắn kết Syr cho hiệu suất tốt, loại bỏ 59% màu NY1 92% NY7 sau 24 Đối với màu NY1 chất gắn kết Ace Syr chất gắn kết lại hoạt động tốt (trừ Si) loại bỏ màu NY1 khoảng từ 55-57% sau 24 Thậm chí mặt chất gắn kết dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 loại 41% màu NY1 sau 24 Tuy nhiên màu NY7 chất gắn kết trên, hiệu suất loại màu dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 với chất gắn kết khác tương đối thấp, khoảng từ 5-24% sau 24 Khóa luận tốt nghiệp Trang 42 SVTH: Nguyễn n Hoài Thu Hình 3.14.Sự thay đổ ổi màu NY1 laccase thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 có m mặt chất gắn kết Hình 3.15.Sự thay đổổi màu NY7 lacase thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 có m mặt chất gắn kết Không giống ng chủng Myrothecium sp FAXS1, theo nghiên cứu c Couto đtg đãã công bbố laccase từ Trametes hirsute loạii kho khoảng 90% màu axit đỏ 97 phút có m mặt mM mM VIO[14] Nghiên ccứu Rodriguez (2005) cho th thấy dịch enzyme từ chủng Trametes metes hirsute loại màu đỏ Sells có mặtt ccủa chất ABTS, HOBT Sau 10 phút phút, hiệu suất loại màu 88 % có mặtt chất ch gắn kết HOBT 0,12% với v chất gắn kết ABTS 0,5 µM loạii đư 58 % sau [33] Vì vậy, thấấy chủng nấm Myrothecium sp FAXS1 có ti tiềm lớn loại ng màu thuộc thu nhóm azo 3.4.3 Khả ăng loại lo màu thương mại dịch ch enzyme thô từ t chủng Myrothecium sp FAXS1 có mặt chất gắn kết Hai màu CLS LF-2B sử dụng để khảo sát khảả loại màu nhóm màu thương ương mại m dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 có mặt ch chất gắn kết Kết trình bàytrên hình 3.16 Khóa luận tốt nghiệp Trang 43 SVTH: Nguyễn n Hoài Thu E Si HOBT Ace VIO Syr 90 80 70 60 50 40 30 20 10 30 24 phút phút giờ giờ Thời ời gian LF-2B HIệu suất loại màu (%) Hiệu suất loại màu (%) CLS E Si HOBT Ace VIO Syr 100 80 60 40 20 30 24 phút phút giờ giờ Thờii gian A B Hình 3.16.Khả ng loại lo màu CLS (A) LF-2B (B)của dịch ch enzyme thô ttừ chủng Myrothecium sp FAXS1 có mặt chất gắn n kết k Đối vớii màu CLS LF-2B, có mặt chất gắn kếtt Ace Syr hiệu suất loại màu chủng ng Myrothecium sp FAXS1 tốt, lần lượtt 63 63-82% màu CLSvà 85-89% màu LF 2B sau 24 Tuy nhiên, với chất gắn n kkết lại không loại đượcc màu trên, dao động khoảng từ 0-88 % sau 24h theo dõi Kết thu đượcc m lần khẳng định chủng Myrothecium sp FAXS1 có khả loạii màu cao kkết hợp với chất gắn kết Ace Syr Hình 3.17.Sự thay đổii màu CLS b dịch enzyme thô từ chủng Myrothecium sp FAXS1 có m mặt chất gắn kết Khóa luận tốt nghiệp Trang 44 SVTH: Nguyễn n Hoài Thu Hình 3.18.Sự thay đổii màu LF-2B dịch enzyme thô từ chủng ng Myrothecium sp FAXS1 có mặt m chất gắn kết Husseiny (2008) c công bố hai loại nấm sợi A niger Penicillium spp có khả khử màu reactive dye lần lượtt 74,2% 77,87% direct dye (78,3%; 67,42%) ưng công bbố khả ng sinh enzyme chủng nấm này[24] Ngoài ra, Khelifi ccộng chứng minh chủ ủng A alliaceus 121C loại lần lượtt 98,6 98% màu Indigo Congo đỏ hoạtt tính laccase ttạo 79 U/l sau ngày nuôi cấấy[27] Khóa luận tốt nghiệp Trang 45 SVTH: Nguyễn Hoài Thu PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ chủng nấmsợi phân lập rừng Quốc gia Xuân Sơn thuộc tỉnh Phú Thọ tỉnh Bình Định lựa chọn chủng FAXS1 có khả sinh tổng hợp laccase môi trường TSH3 có hoạt tính ban đầu là12.689 U/l; Bằng phương pháp phân loại truyền thống kết hợp với xác định so sánh trình tự vùng ITS (ITS1 - 5,8 S - ITS2), chủng FAXS1 thuộcngành nấm Deuteromycotina, chi Myrotheciumvà đặt tên Myrotheciumsp FAXS1; Myrotheciumsp.FAXS1 có khả sinh tổng hợp laccase cao môi trường pH 8; mM CuSO4, 10 g/l lactose; g/l KNO3, 1g/l caseinlắc 150 v/phút, 30oC với hoạt tính 60.663 U/ml sau ngày nuôi cấy; Hiệu suất loại màu laccase thô sinh tổng hợp từ Myrotheciumsp.FAXS1 xác định 51% thuốc nhuộmNY5 với 200 µM ViOvàđối với màu RBBR, NY1, NY7, CLS, LF-2B 36, 67, 94,82 89% với 200 µMAcetosyringonesau 24 Khả loại màu thuộc nhóm azo màu thương mạicủa chủng Myrothecium sp FAXS1 cao so với nhóm màu anthraquinone; Đây chủng nấm bất toàn phân lập rừng Quốc gia Xuân Sơn tỉnh Phú Thọ với đặc tính khác với chủng công bố giới có mức tương đồng 99% với Myrothecium roridum KKF402 phân lập Thái Lan, có tiềm cao xử lý ô nhiễm môi trường đấu tranh sinh học 4.2 Kiến nghị Nghiên cứu khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào khác chủng FAXS1 lignin peroxidase, manganese peroxidase; Khóa luận tốt nghiệp Trang 46 SVTH: Nguyễn Hoài Thu Nghiên cứu số điều kiện nuôi cấy khác để tiếp tục nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp laccase chủng Myrothecium sp FAXS1; Đánh giá khả kháng VSV gây bệnh, sinh tổng hợp chất kháng nấm, chất có hoạt tính sinh học có khả kiểm soát côn trùng cỏ dại, chất diệt cỏ sinh học chủng Myrothecium sp FAXS1; Khóa luận tốt nghiệp Trang 47 SVTH: Nguyễn Hoài Thu TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Đào Thị Ngọc Ánh (2010), “Nghiên cứu phân loại, khả phân hủy DDT sinh laccase chủng nấm sợi phân lập từ đất ô nhiễm hỗn hợp thuốc trừ sâu”, Luận văn thạc sỹ sinh học Đại học Thái Nguyên- Trường Đại học Sư phạm Đặng Thị Thu, Tô Kim Hòa, Lê Quang Hòa, Lê Hồng Nga (2009), “ Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn nấm mốc sinh tổng hợp laccase từ rừng tự nhiên Việt Nam ” Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc pp 376-380 Nguyễn Lân Dũng cộng (1993), Vi sinh vật tập 1, Nxb Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, 1998, Vi sinh vật học, Nxb Giáo Dục Tr 3-40,407 Nguyễn Thị Phương Mai “ Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp laccase tái tổ hợp Aspergillus niger D15#26LCC1 khảo sát khả ứng dụng” LAST Công nghệ sinh học: 62.54.02.05 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Phạm Thị Thanh Thúy (2007) “Nghiên cứu khả phân huỷ hợp chất cacbuahydro số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ” Luận văn thạc sỹ sinh học Đại học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh Trần Thị Thu Hiền, Hoàng Thị Nhung, Nguyễn Hải Vân, Nguyễn Thị Lan Anh, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà “Nghiên cứu phân lâp ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp laccase chủng nấm thu thập từ rơm mục Ninh Bình” Tạp chí Công Nghệ Sinh học, tập 11 số 2, pp.265274 ( 2013) TÀI LIỆU TIẾNG ANH Adinarayana Kunamneni et al (2008), “Engineering and Application of fungal laccase for organic synthesis”, Microbial Cell Factories Arockiasamy, S., Krishnan, I.P.G., Anandakrishnan, N., Seenivasan, S., Sambath, A., Venkatasubramani, J.P (2008), “ Enhanced production of laccase Khóa luận tốt nghiệp Trang 48 SVTH: Nguyễn Hoài Thu from Coriolus versicolor NCIM 996 by nutrient optimization using respone surface methodology ” Appl Biochem Biotechnol, 151(2-3), pp 371-379 10 C Mutambanengwe, O Oyekola, C Togo and CG Whiteley (2011) “Production of enzymes for industrial wastewater treatment: Proof of concept and application to the textile dye industry” Rhodes University, Grahamstown 11 Cavallazzi J.R.P., Kasuya1 C.M., Soares M.A (2005) Screening of inducers for laccase production by Lentinula edodes in liquid medium Brazilian J Microb 36: 383-387 12 Chack J T., Subramaniam K (2011) “Enzymatic degradation of azo dyes: a review” Int J Environ Sci, 1:1250-60 13 Charumathi D., Das N (2012) “Packed bed column studies for the removal of synthetic dyes from textile wastwater using immobilised dead C tropicalis” Desalination 285:23-30 14 Couto, S.R and Herrera J.L.T, (2007) “Laccase production at reactor scale by filamentous fungi”, Biotech Adv., 25, 558-569 15 Couto, S.R., Gundín, M., Lorenzo, M., Sanromán, M.A (2002), ‘ Screening of supports and inducers for laccase production by Trametes versicolor in semisolid-state conditions”, Process Biochemistry, 38, pp 249-255 16 D A Wood (1980), “Production, Purification and Properties of Extracellular Laccase of Agaricus bisporus”, Journal of General Microbiology 117, pp.327-338 17 Eduardo Torres, Ismael Bustor-Jaimes, Sylvie Le Borgne (2003) “Potential use of oxidative enzymes for the detoxification of organic pollutants” Appl Catalysis B: Environ: 46: 1-15 18 Elisashvili, V., Pennickx, M., Kachlishvili, E., Asatiani, M and Kvesitadze, G.(2006), “ Use of Pleurotus dryinus for lignocellulolytic enzymes production in submerged fermentation of mandarin peels and tree leaves ” Enzyme Microbial Biotechol, 38(7), pp 998-1004 19 Gao D, Liang H, Du L, Chen J (2010), “Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) by white rot-fungusPseudotrametes gibbosaisolated from the boreal forest in Northeast China”, African Journal of Biotechnology 9(41): 6888-6893 Khóa luận tốt nghiệp Trang 49 SVTH: Nguyễn Hoài Thu 20 Harald Claus (2003), “Laccase and their occurrence in prokaryotes”, Arch Microbiol, 179, pp.145-150 21 Haught, J.C., Miracle, G.S., Convents, A.C.: WO2001060157 A2 (2001) 22 Hongman Hou, Jiti Zhou, Jing Wang, Cuihong Du, Bin Yan (2004), “Enhancement of laccase production by Pleurotus ostreatus and its use for the decolorization of anthraquinone dye”, Process Biochemistry, 39(11), pp.1415-1419 23 Hou, H., Zhou, J., Wang, J., Du, C and Yan, B (2004), “ Enhancement of laccase production by Pleurotus ostreatus and use for the decolorization of anthraquinone dye “ Process Biochemistry, 39(11),pp 1415-1419 24 Husseiny Sh M “Biodegradation of the Reactive and Direct Dyes Using Egyptian Isolates” Journal of Applied Sciences Research, 4(6): 599-606 (2008) 25 Johansen, C.: WO9606532 A1 (1996) 26 Juelich, W.D., Schauer, F., Lindequist, U., Hammer, E., Schaefer, A., Jonas, U.: WO2001098518 A2 (2001) 27 Khelifi E1, Ayed L, Bouallagui H, Touhami Y, Hamdi M.“Effect of nitrogen and carbon sources on Indigo and Congo red decolourization by Aspergillus alliaceus strain 121C” 28 Klaus Piontek, Matteo Antorini, Thomas Choinowski Crystal (2002), “Structure of a Laccase from the FungusTrametes versicolor at 1.90-Å Resolution Containing a Full Complement of Coppers”, The Journal of Biological Chemistry, 277,pp.37663-37669 29 Laura-Leena Kiiskinen (2005), “Characteration and heterologuos production of novel laccase from Melanocarpus albomyces”, Doctor Thesis, Helneski University of Technology 30 O V Morozova, G P Shumakovich, M A Gorbacheva, S V Shleev, and A I Yaropolov (2007), ““Blue” Laccases”, Biochemistry (Moscow), 72(10), pp.1136-1150 31 Orawan Piyaboon, Arm Unartngam, Jintana Unartngam “Effectiveness of Myrothecium roridum for controlling water hyacinth and species identification based on molecular data” African Journal of Microbiology Research, Vol (13), pp 1444-1452 (2014) Khóa luận tốt nghiệp Trang 50 SVTH: Nguyễn Hoài Thu 32 P Sharma, R Goel, N Capalash (2007), “Bacterial laccase”, World J Microbiol Biotechnol, 23, pp.823-832 33 PJ Collins, MJJ Kotterman, JA Field and ADW Dobson (1996), “Oxidation of Anthracene and Benzo[a]pyrene by Laccases from Trametes versicolor”, Appl Environ Microbiol.,62(12), pp.4563-4567 34 Rodriguez C.S, Sanronmán M, Gubitz G M (2005) "Infuence of redox mediators and metal ions on synthetic acid dye decolourization by crude laccase from Trametes hirsute” Chemosphere 58:417-422 35 Rubia T, Ruiz E, Pérez J, Mantínez J (2002) Properties of a laccase produced by Phannerochaete flavio-alba induced by vanillin Arch Microbiol 179: 70-73 36 S Sadhasivam, S Savitha, K Swaminathan, Feng-Huei Lin (2008), “Production, purification and characterization of mid-redox potential laccase from a newly isolated Trichoderma harzianum WL1”, Process Biochemistry 43, pp.736– 742 37 Sambrook J and Russell D W., 2001: “Molecular Cloning” A Laboratory Manual 3rd ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 38 Samson, R A & W Gams (1984) “The taxonomic situation in the fungal genera Penicillium, Aspergillus and Fusarium” Antonie van Leeuwenhoek 50: 815824 39 Saratale R.G., Saratale G.D., Chang J.S., Govindwar SP (2011) "Bacterial decolorization and degradation of azo dyes: a review" J Taiwan Inst Chem Eng, Vol 42:138-57 40 Saratale G D., Kalme S D., Govindwar S P., (2006), “Decolorization of textile dyes by Aspergillus ochraceus NCIM-1146”, Ind J Biotechnology, 5, pp 407-415 41 Sergio Riva (2006), “Laccases: Blue enzymes for green chemistry”, Trends in Biotechnology, 24(5), pp.219-226 42 Seyis I, Subasioglu T, (2009) “ Screening of different fungi for decolorization of molasses”, Brazilian Journal of Microbiology, 40:61-65: 15178382 Khóa luận tốt nghiệp Trang 51 SVTH: Nguyễn Hoài Thu 43 Shedbalkar U., Dhanve R., Jadhave J., (2008), “Biodegradation of triphenylmethane dye cotton blue by Pinicillium ochorochloron MTCC 517”, Journal of Hazardous Materials, 157, pp 472-479 44 Sulistyaningdyah W.T., Ogawa J, Tanaka H, Maeda C, Shimizu S (2004) “Characterization of alkaliphilic laccase activity in the culture supematant of Mrothecium verrucaria 24G-4 in comparison with bilirubin oxidase" Fedaration of European Microbiological Societies Microbiolog Letter, 230(2), pp.209-14 45 T J White, T Bruns, S lee, and J Taylor “Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics” Brazilian Archives of Biology and Technology, Vol 53 (2010) 46 Viswanath, B., Chandra, M.S., Pallavi, H and Reddy, B.R (2008), “ Screening and asessment of laccase producing fungi isolated from different environmental samples ” African J Biotech, 7(8), pp 1129-1133 47 Wang, J.W., Wu, J.H Huang, W.Y and Tan R.X.(2006), “ Laccase production by Monotospora sp., and endophytic fungus in Cynodon dactylon”, Bioresource Technology, 97(5), pp 786-789 48 Wang Gao-jie, Cao Fu-xiang, Long Jiang-xue, Dong Xu-jie (2009) “Growth Conditions of Myrothecium melanosporum For the Production of Laccase” Journal of Central South University of Forestry & Technology 49 Zeng, G.M., Yu, H.Y., Huang, H.L., Huang, D.L., Chen, Y.N, Huang, G.H and Li, G.B (2006), “ Laccase activities of a soil fungus Penicillium simplicissimum in relation to lignin degradation ”, W J Microb Biotech, 22(4), pp 317-324 50 Zhao D., Zhang X., Cui D., Zhao M (2012) “Characterisation of a novel white laccase from the Deuteromycete fungus Myrothecium verrucaria NF-05 and Its Decolourisation of Dyes", Plublic Library of Sience, 70, p.1 Khóa luận tốt nghiệp Trang 52 [...]... tuyển chọn và nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy thích hợp của chủng nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp laccase với tiềm năng ứng dụng trong loại màu thuốc nhuộm đã được tiến hành với một số nội dung như sau: - Sàng lọc các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp laccase từ bộ sưu tập nấm đã được phân lập từrừng Quốc gia Xuân Sơntỉnh Phú Thọ và tỉnh Bình Định; - Phân loại chủng nấm lựa chọn bằng phương pháp... dựa vào đặc điểm hình thái, nuôi cấy, một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá và phương thức sinh sản Hệ thống phân loại dựa trên các phương pháp sinh hoá và sinh học phân tử được sử dụng rất ít Khoá phân loại phổ biến hiện nay thường dùng là khoá phân loại hình thái của Robert A Samson (1984) [38] 1.2.2 Khả năng sinh laccase của nấm sợi Nấm sợi là một trong nhóm VSV có khả năng sinh nhiều loại enzym có hoạt... ảnh hưởng của chúng đến khả năng sinh laccase của chủng nấm Thí nghiệm được thực hiện ở30oC, tốc độ lắc 150v/p và kiểm tra hoạt tính laccase sau 3 ngày nuôi cấy 2.2.5 Đánh giá khả năng loại màu của dịch enzyme thô của chủng nấm được chọn Dịch enzyme có nồng độ cuối 1.000 U/l được sử dụng để đánh giá khả năng loại màu của enzyme với sự tham gia của chất gắn kết Tổng thể tích phản ứng loại màu là 5 ml... NF-05, v.v [1; 7; 36; 44; 48; 50] 1.3 THUỐC NHUỘM 1.3.1 Khái niệm thuốc nhuộm Thuốc nhuộm là những chất hữu cơ có màu, hấp thụ mạnh một phần nhất định của quang phổ ánh sáng nhìn thấy và có khả năng gắn kết vào các vật liệu dệt Thuốc nhuộm có thể có nguồn gốc thiên nhiên hoặc tổng hợp Hiện nay, chúng ta hầu như chỉ sử dụng thuốc nhuộm tổng hợp Đặc điểm nổi bật của thuốc nhuộm là Khóa luận tốt nghiệp Trang... nhuộm do thuốc nhuộm Ô nhiễm nước thải dệt nhuộm phụ thuộc vào các hóa chất, chất trợ, thuốc nhuộm và công nghệ sử dụng Trong đó ô nhiễm do thuốc nhuộm trở thành vấn đề chủ yếu đối với nước thải dệt nhuộm Thuốc nhuộm sử dụng hiện nay là các sản phẩm tổng hợp hữu cơ Nồng độ thuốc nhuộm trong môi trường nước tiếp nhận đối với công đoạn dệt -nhuộm phụ thuộc vào một số yếu tố: mức độ sử dụng hàng ngày của. .. bền màu- tính chất không bị phân hủy bởi các điều kiện, tác động khác nhau của môi trường, đây vừa là yêu cầu với thuốc nhuộm lại vừa là vấn đề với xử lý nước thải dệt nhuộm Màu sắc của thuốc nhuộm có được là do cấu trúc hóa học của nó Phân tử thuốc nhuộm bao gồm các nhóm mang màu và nhóm trợ màu Thuốc nhuộm tổng hợp rất đa dạng về thành phần hóa học, màu sắc, phạm vi sử dụng Dưới đâylà cách phân loại. .. laccase của chủng nấm đại diện 2.2.4.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy Các môi trường nuôi cấy nấm khác nhau gồm: PDB, GYMP, Czapek, Mechichi, TSH3, MEG được sử dụng trong nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh laccase của chủng FAXS1 Thí nghiệm được thực hiện ở 30oC, tốc độ lắc 150 v/p và kiểm tra hoạt tính laccase sau 3 ngày nuôi cấy 2.2.4.2 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy. .. cấu tạo của nhóm mang màu, theo đó thuốc nhuộm được phân thành 20-30 họ thuốc nhuộm khác nhau Các họ thuốc nhuộm chính bao gồm: • Thuốc nhuộm azo: nhóm mang màu là nhóm azo (-N=N-), phân tử thuốc nhuộm có một (monoazo) hay nhiều nhóm azo (diazo, triazo, polyazo) Đây là họ thuốc nhuộm quan trọng nhất và có số lượng lớn nhất, chiếm khoảng 60-70% số lượng các thuốc nhuộm tổng hợp, chiếm 2/3 các màu hữu... của thuốc nhuộm, độ gắn màu của thuốc nhuộm lên vật liệu dệt, mức độ xử lý trong các công đoạn xử lý nước thải, hệ số pha loãng trong nguồn nước tiếp nhận Mức độ gắn màu là một yếu tố quan trọng, nó phụ thuộc vào độ đậm màu, công nghệ áp dụng, tỷ lệ khối lượng hàng nhuộm và dung dịch nước dùng trong máy nhuộm, vật liệu và thuốc nhuộm sử dụng Tổn thất thuốc nhuộm đưa vào nước trung bình là 10% với màu. .. phức vớii kim loại lo làm màu sắc của thuốc nhuộm thay ay đổi Họ thuốc nhuộm này có độ bềnn màu vvới ánh sáng rất cao, chiếm khoảng ng 2% tổng t số lượng thuốc nhuộm Ngoài ra, còn các hhọ thuốc nhuộm khác ít phổ biến, n, ít có quan tr trọng hơn như: thuốc nhuộm m nitrozo, nitro, polymetyl, arylamin, azometyn, thu thuốc nhuộm lưu huỳnh… Khóa luận tốt nghiệp Trang 13 SVTH: Nguyễn Hoài Thu Bảng 1.2 .Một số