VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CứU TÁCH CHIếT VÀ PHÂN TÍCH CấU TRÚC KHÁNG SINH THU ĐƯợC Từ CHủNG Xạ KHUẩN STREPTOMYCES SP KCTC 0041BP SAU KHI ĐÃ ĐộT BIếN MấT GEN GER MIII Giáo viên hướng dẫn :Th.s Nguyễn Thị Ngọc Anh Sinh viên thực hiên :Nguyễn Hoài Linh Lớp : 11 - 02 Hà Nội - 2015 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập thực đề tài em nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ quý thầy cô, gia đình bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi tới cô giáo - ThS Nguyễn Thị Ngọc Anh - người định hướng nghiên cứu, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em suốt trình thực tập hoàn thành đề tài nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn TS Tạ Thị Thu Thủy – Chủ nhiệm khoa Công Nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội, toàn thể thầy cô giáo, anh chị kĩ thuật viên bạn sinh viên Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử bên cạnh động viên, khích lệ, ủng hộ em suốt thời gian học tập nghiên cứu Bước đầu tìm hiểu, thực đề tài với vốn kiến thức hạn chế nhiều bỡ ngỡ Mặc dù thân có nhiều cố gắng, tránh khỏi thiếu sót nên em mong nhận ý kiến đóng góp quý Thầy – Cô để khóa luận em đầy đủ hoàn chỉnh Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Hoài Linh Nguyễn Hoài Linh i Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC HÌNH v DANH MỤC CÁC BẢNG vi MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan kháng sinh 1.1.1 Lịch sử kháng sinh 1.1.2 Định nghĩa kháng sinh 1.1.3 Phân loại kháng sinh 1.1.4 Cơ chế tác dụng kháng sinh 1.1.5 Các nghiên cứu gần kháng sinh 1.2 Tổng quan xạ khuẩn Streptomyces 1.2.1 Vai trò xạ khuẩn tự nhiên 1.2.2 Giới thiệu xạ khuẩn Streptomyces 10 1.2.3 Sự hình thành chất kháng sinh xạ khuẩn 10 1.3 Xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP 11 1.3.1 Đặc điểm nuôi cấy 11 1.3.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 13 1.3.3 Khả kháng khuẩn với số vi sinh vật kiểm định 13 1.3.4 Phân loại 13 1.4 Xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC0041 bp đột biến GerMIII 13 1.5 Tổng quan kháng sinh dyhidrochalcomycin 14 1.5.1 Cấu trúc dyhidrochalcomycin 15 1.5.2 Vai trò hoạt tính sinh học 15 1.5.3 Các nghiên cứu dihydrochalcomycin 16 1.6 Đại cương gen gerMIII (2-O-methyltransferase) 21 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 Nguyễn Hoài Linh ii Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 2.1 Vật liệu hóa chất thiết bị 23 2.1.1 Vật liệu 23 2.1.2 Hóa chất 23 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 24 2.1.4 Thiết bị 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy chủng vi sinh vật 25 2.2.2 Phương pháp bảo quản giống 27 2.2.3 Phương pháp tách chiết kháng sinh thô dung môi hữu 27 2.2.4 Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh khoanh giấy lọc 29 2.2.5 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography – TLC) 30 2.2.6 Phương pháp Prep – TLC (Prepare TLC) 31 2.2.7 Phương pháp sắc ký lỏng kết hợp khối phổ (Liquid Chromatography Mass) 33 2.2.8 Phương pháp ion hóa tia điện ESI (Electrophoresis Spray Ionization) 34 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Tách chiết kháng sinh thô dung môi hữu 35 3.2 Thử hoạt tính kháng sinh phương pháp khoanh giấy lọc 36 3.3 Tthử hoạt tính kháng sinh phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC 38 3.4 Tinh kháng sinh Prep – TLC (Prepare-TLC) 40 3.5 Kết phân tích kháng sinh phương pháp sắc ký lỏng kết hợp khối phổ (LC-Mass) phương pháp ESI-Mass 41 3.6 Quy trình tách thu nhận kháng sinh thô quy mô phòng thí nghiệm 43 3.7 Qui trình tinh quy mô phòng thí nghiệm 45 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 46 4.1 Kết Luận 46 4.2.Đề Xuất 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Nguyễn Hoài Linh iii Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú thích Amp Ampicillin Bp Base paire C Carbon CKS Chất kháng sinh DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxynucleotide triphosphates RNA Ribonucleic Acid Gr+ Gram dương Gr- Gram âm Neo Neomycin VSV Vi sinh vật HPLC High Perfomance Liquid Chromatography LB Luria Bertani TLC Thin Layer Chromatography LC-Mass Liquid Chromatography Mass PKS Polyketide Synthase ESI-Mass Electrophoresis Spray Ionization Mass dvC Đơn vị Cacbon Nguyễn Hoài Linh iv Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Khuẩn lạc chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP trênmôi trường ISP2 12 Hình 1.2 Hình dạng KTKS KTCC chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP phóng đại (× 4.500-15.000) 13 Hình 1.3.Cấu trúc Dihydrochalcomycin 15 Hình 1.4 Dự đoán đường sinh tổng hợp gốc đường khử bước cuối hoàn thành cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin 19 Hình 1.5 Nhóm gen sinh tổng hợp dihyrochalcomycin phân lập từpGERI-5 cosmid 22 Hình 3.1 Phân pha chiết dịch kháng sinh 35 Hình 3.2 Sản phẩm kháng sinh chủng đột biến sau quay cô 36 Hình 3.3 Kết thử hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP đột biến 37 Hình 3.4 Kết kiểm tra chạy TLC chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP(W) chủng đột biến M3-1-10(10), M3-8-13(13) 38 Hình 3.6 Kết thử hoạt tính kháng sinh sau tinh 40 Hình 3.5 Kết thử hoạt tính kháng sinh phương pháp TLC với chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP ban đầu(W) chủng đột biến M3-1-10(10), M3-8-13(13) 39 Hình 3.7 Kết chạy TLC sau tách khỏi bột silicagel 41 Hình 3.8A hình 3.8B: Phân tích cấu trúc phân tử Dihydrochalcomycin LC-Mass 42 Hình 3.9A hình 3.9B: Phân tích cấu trúc dẫn xuất kháng sinh từ chủng đột biến gen GerMIII 43 Hình 3.10 Sơ đồ quy trình thu nhận kháng sinh thô 44 Hình 3.11 Sơ đồ quy trình tinh quy mô phòng thí nghiệm 45 Nguyễn Hoài Linh v Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Dự đoán chức gen ORFs nhóm gen sinh tổng hợp dihydrochalcomycin 17 Bảng 3.1 Kết thử hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP ban đầu chủng đột biến M3-8-13, M3-1-10 37 Bảng 3.2 Kết thử hoạt tính kháng sinh phương pháp TLC với chủng đột biến M3-1-10, M3-8-13 chủng wild type 38 Nguyễn Hoài Linh vi Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Bệnh nhiễm khuẩn nguyên nhân hàng đầu đe dọa đến an toàn người Những trận đại dịch cướp sinh mạng người mà chí dẫn đến diệt vong đế chế hùng mạng Chính điều thúc nhà khoa học giới phải tìm chất có khả phòng chống điều trị bệnh nhiễm khuẩn Ngày với phát triển vượt bậc công nghệ sinh học tìm nhiều chất kháng sinh (CKS) phục vụ đời sống người Trong số 10.000 CKS tìm có khoảng 2.000 chất thực vật tạo ra, khoảng 8.000 chất kháng sinh vi sinh vật tổng hợp, xạ khuẩn tổng hợp 80% [11] Tuy nhiên, việc sử dụng CKS không hợp lý làm xuất hiện tượng kháng kháng sinh Số lượng vi khuẩn kháng với chất kháng sinh ngày gia tăng Vì vậy, kèm với biện pháp sử dụng kháng sinh an toàn, hợp lý việc nghiên cứu sản xuất chất kháng sinh có nhiều đặc tính ưu việt thực cần thiết Xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC0041BP nghiên cứu nhiều nước Hàn Quốc, Việt Nam Đây chủng hoang dại sinh tổng hợp Dihydrochalcomycin phân lập, xác định cấu trúc hóa học nhóm nghiên cứu Hàn Quốc [19] Kháng sinh Dihydrochalcomycin (C35H58O14) kháng sinh thuộc nhóm Macrolide 16C, sử dụng điều trị nhiễm trùng đường hô hấp Kháng sinh Dihydrochalcomycin tách chiết từ chủng xạ khuẩn Streptomycessp KCTC 0041BP, có tác dụng ức chế tiêu diệt vi khuẩn Gr- (Gram âm) Gr+ (Gram dương) cách liên kết vào tiểu phần 50S ribosome, ngăn cản trình sinh tổng hợp protein vi khuẩn Nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu loại kháng sinh nhiều ưu điểm vượt trội độc, dung nạp tốt, thải trừ nhanh, có hoạt tính kháng khuẩn mạnh đặc biệt chưa xuất hiện tượng kháng thuốc Nguyễn Hoài Linh Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Các nhóm nghiên cứu giới xác định toàn nhóm gen xạ khuẩn Toàn nhóm gen tham gia sinh tổng hợp có chuỗi trình tự 75.5kb có khoảng 23 ORF chứa thông tin di truyền mã hóa gen tham gia đường tổng hợpDihydrochalcomycin: gerB, gerM1, gerN, gerR, gerP1, gerP2, gerG, gerE, gerD, gerF, gerM2, gerP3, gerH, gerK1, gerM3, gerT1, gerA, gerS1, gerS2, gerS3, gerS4, gerS5, gerY, gerT2, gerK2 Hiện nay, có số gen nghiên cứu chứng minh chức chúng là: gerT1, gerT2, gerK1, gerF, gerR, gerM2, gerM1 [1], [4], [5], [13] Trong 31 gen tham gia vào trình sinh tổng hợp kháng sinh Dihydrochalcomycin, gen gerMIII có chức mã hóa tổng hợp enzyme 2- Omethyltransferase.Enzyme2-O-methyltransferase (GerMIII) với - Omethyltransferase (GerMII) xúc tác phản ứng methyl hóa nhóm -OH vị trí C2, C3 tạo gốc đường D-mycinose Gen gerMIII có khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu tạo đột biến gen mã hóa cho enzyme - O-methyltransferaza (gen GerM3 ) phương pháp tiếp hợp xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC0041BP’’ - Ngô Văn Luân (2013) Sau đột biến gen gerMIII chứng minh sàng lọc môi trường có bổ sung kháng sinh Apramycin Neomycin tạo chủng đột biến có trao đổi chéo đơn chủng có trao đổi chéo kép Tuy nhiên bước đầu sàng lọc chủng đột biến có trao đổi kép làm gen ger MII Để chứng minh đột biến gen ger MII làm rõ chức gen ger MII, năm 2014 khóa luận tối nghiệp “Bước đầu nghiên cứu tách chiết kiếm tra sản phẩm kháng sinh chủng xạ khuẩn đột biến gen ger MII từ chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP ban đầu” - Nguyễn Thị Hà (2014) Tuy nhiên bước đầu tách chiết phân tích lượng nhỏ sản phẩm kháng sinh từ chủng xạ khuẩn đột biến.Vì nhóm nghiên cứu thực đề tài : “Nghiên cứutách chiếtvà phân tích cấu trúc kháng sinh thu từ chủng xạ khuẩn Steptomyces sp KCTC0041BP sau đột biến gen ger MIII” Mục tiêu đề tài: Nguyễn Hoài Linh Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp - Tách chiết thử hoạt tính kháng sinh thô chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP đột biến gen gerMIII - Phân tích cấu trúc kháng sinh thu từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP Nội dung thực hiện: - Tách kháng sinh thô phương pháp quay cô chân không - Xác định hoạt tính kháng sinh phương pháp khoanh giấy lọc - Xác định hoạt tính kháng sinh phương pháp chạy sắc ký mỏng TLC - Nghiên cứu tách tinh kháng sinh Prep-TLC(Preparative-TLC) - Phân tích kháng sinh phương pháp sắc ký lỏng kết hợp phối khổ ( LCMass) phương pháp ESI-Mass - Xây dựng quy trình tinh kháng sinh thô phòng thí nghiệm Nguyễn Hoài Linh Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách chiết kháng sinh thô dung môi hữu Dịch nuôi cấy xạ khuẩn đột biến sau - ngày đem ly tâm 6000 rpm o C 10 phút Phần dịch sau ly tâm bổ sung ethyl acetate với tỉ lệ 1:1 thể tích Hỗn hợp dịch nuôi dung môi lắc với tốc độ 200 rpm nhiệt độ phòng từ ÷ Kháng sinh tan ethyl acetate phân thành pha rõ rệt Pha phần dịch kháng sinh tan ethyl acetate, pha dịch ly tâm lẫn xác tế bào Dùng phễu chiết thu phần dịch kháng sinh tan ethyl acetate hình Hình 3.1 Phân pha chiết dịch kháng sinh Sau đó, dịch đem quay cô chân không 4oC, 126 mbar thu kháng sinh thô Kháng sinh thô sau quay cô hòa tan methanol bảo quản nhiệt độ -20°C Nguyễn Hoài Linh 35 Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.2 Sản phẩm kháng sinh chủng đột biến sau quay cô Mẫu M3-8-13: nuôi 1l dịch lỏng thu 20ml kháng sinh thô Mẫu M3-1-10: nuôi 500ml dịch lỏng thu 10ml kháng sinh thô 3.2 Thử hoạt tính kháng sinh phương pháp khoanh giấy lọc Các chủng Geriwild, M3 1-10, M3 8-13, nuôi cấy môi trường R2YE lỏng có bổ sung kháng sinh Neo 60µg/ml khoảng - ngày, 28oC, 200rpm Sau đó, dịch nuôi đem ly tâm thu dịch loại tế bào (sinh khối) Do chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP sản sinh kháng sinh môi trường lên men nên lựa chọn phương phương pháp chiết rút dung môi không hỗn hợp với nước Dịch ly tâm tách chiết với ethyl acetate theo tỉ lệ 1:1 Lắc hỗn hợp dung dịch với tốc độ 150-200 vòng/phút khoảng 1.5-2 Sau hỗn hợp dịch đổ vào bình chiết phân làm pha Pha dịch nuôi pha ethyl acetate chứa kháng sinh Thu nhận dịch phía sau đem quay cô chân không thu kháng sinh thô Chất kháng sinh thô hòa tan methanolvà dùng để thử hoạt tính kháng sinh phương pháp khoanh giấy lọc, với vi sinh vật kiểm định Bacillus subtilis ATCC 11778 Nguyễn Hoài Linh 36 Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.3 Kết thử hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP đột biến Theo tính toán đo đạc từ thực tế thu kết sau: Bảng 3.1 Kết thử hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP ban đầu chủng đột biến M3-8-13, M3-1-10 Chủng xạ khuẩn Đường kính vòng vô khuẩn D (mm) Streptomyces sp KCTC 25,5 0041BP M3-1-10 10,5 M3-8-13 11 Từ kết cho thấy chủng xạ khuẩn sau đột biến gen gerMIII có hoạt lực kháng sinh giảm so với chủng ban đầu, điều giải thích gen gerM3 tham gia gắn gốc methyl (-CH3 ) vào cấu trúc đường khử Minocine nên không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính kháng sinh Dyhidrochacomycin Do vậy, bước đầu kết luận gen gerMIII tham gia vào trình sinh tổng hợp kháng sinh dihydrochalcomycin chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP Nguyễn Hoài Linh 37 Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 3.3 Tthử hoạt tính kháng sinh phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC Ngoài phương pháp khoanh giấy lọc, nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký mỏng TLC để kiểm tra hoạt tính kháng sinh chủng đột biến Chúng tiến hành lấy 30 µl chất kháng sinh mẫu đột biến mẫu xạ khuẩn ban đầu chấm lên mỏng silicagel GF thành chấm nhỏ có đường kính ÷ mm Mẫu sau khô triển khai mỏng hệ dung môi acetone : chloroform với tỉ lệ : 3, tới hệ dung môi chạy cách mép mỏng khoảng 0.5 ÷ 1cm nhấc mỏng Hình 3.4 Kết kiểm tra chạy TLC chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP(W) chủng đột biến M3-1-10(10), M3-8-13(13) Bảng 3.2 Kết thử hoạt tính kháng sinh phương pháp TLC với chủng đột biến M3-1-10, M3-8-13 chủng wild type Đơn vị: cm Mẫu Khoảng cách di Khoảng cách mà chuyển dung chất phân tích di môi (b) chuyển được(a) Widl type(W) 7.3 6.3 0.86 M3-1-10(10) 7.3 6.1 0.84 M3-8-13(13) 7.3 5.95 0.82 Nguyễn Hoài Linh 38 Giá trị Rf Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bản mỏng để khô tự nhiên đặt vào đĩa petri vô trùng Tiến hành đổ lên đĩa môi trường LB đặc có sẵn chủng Bacillus subtilis ATCC 11778 Cuối đĩa để nhiệt độ thường vòng 24 giờ, thu kết sau: Hình 3.5 Kết thử hoạt tính kháng sinh phương pháp TLC với chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP ban đầu(W) chủng đột biến M3-110(10), M3-8-13(13) Từ hình 3.5 cho thấy vòng vô khuẩn chủng đột biến nhỏ so với chủng ban đầu, gen gerMIII tham gia vào đường sinh tổng hợp kháng sinh dihydrochalcomycin Theo dự đoán đột biến gen gerMIII làm cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin thiếu nhóm -CH3 ảnh hưởng không nhiều tới độ phân cực kháng sinh, giá trị Rf chủng đột biến chủng ban đầu gần tương đương (Bảng 3.2) Vì vậy, để khẳng định chắn vai trò gen gerMIII mã hóa cho enzyme 2-O-methyltransferase xúc tác cho phản ứng gắn nhóm Methyl (-CH3) vào vị trí cacbon số gốc đường dTDP-mycinose cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin cần xác định công thức phân tử kháng sinh chủng đột biến gen gerMIII sinh phương pháp LC-mass hay HPLC Nguyễn Hoài Linh 39 Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 3.4 Tinh kháng sinh Prep – TLC (Prepare-TLC) Ta tiến hành chấm 500µl mẫu kháng sinh Geri Wild chủng đột biến GerMIII thành vệt TLC dài 12cm, rộng 7cm, điểm chấm cách mép 1cm – 1.5cm chạy hệ dung môi Acetone : Chloroform (7:3) Soi tia UV xác định phân đoạn kháng sinh với Rf = 0.84 Tiến hành cạo bột mỏng khoảng phân đoạn kháng sinh 5mm sau hòa tan methanol Tiến hành ly tâm sau thu kháng sinh tan methanol Lấy sản phẩm tinh thử hoạt tinh kháng sinh khoanh giấy lọc với Bacillus subtilis ATCC 11778 thu kết Hình 3.6 Kết thử hoạt tính kháng sinh sau tinh Quan sát vòng kháng khuẩn thấy đường kính vòng kháng khuẩn tăng sáng so với thử hoạt tính kháng sinh thô Tiếp tục lấy kháng sinh chạy TLC kết tia UV Nguyễn Hoài Linh 40 Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.7 Kết chạy TLC sau tách khỏi bột silicagel Quan sát hình thấy vạch sáng chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP(W) chủng đột biến(M3) Như kháng sinh tinh 3.5 Kết phân tích kháng sinh phương pháp sắc ký lỏng kết hợp khối phổ (LC-Mass) phương pháp ESI-Mass Để xác định công thức phân tử kháng sinh dẫn xuất đột biến sinh ra, ta sử dụng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp khối phổ( LC-Mass) hay ESI-Mass Hình ảnh phân tích mẫu kháng sinh từ chủng tự nhiên cho thấy giá trị HPLC với thời gian cột kháng sinh 10 phút Khi đo phổ khối kháng sinh cho thấy khối lượng phân tử dạng Proton ion hóa với ion Na ( m + Na+ ) = 725 dvC (Hình 3.8A 3.8B) Đối với chủng đột biến phân tích cấu trúc cho thấy thời gian lưu cột 11,2 phút dẫn xuất kháng sinh xuất Đo phổ khối dẫn xuất cho thấy khối lượng phân tử 549 dvC, khối lượng phân tử sau ion hóa có đính kèm nguyên tử NH4+ ( m + NH4+ ) = 549 dvC (Hình 3.9A 3.9B) Nguyễn Hoài Linh 41 Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.8A Hình 3.8B Hình 3.8A hình 3.8B: Phân tích cấu trúc phân tử Dihydrochalcomycin LC-Mass Nguyễn Hoài Linh 42 Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.9A Hình 3.9B Hình 3.9A hình 3.9B: Phân tích cấu trúc dẫn xuất kháng sinh từ chủng đột biến gen GerMIII Với phân tích chứng tỏ kháng sinh Dihydrochalcomycin dẫn xuất đột biến phân tử tinh với qui mô phòng thí nghiệm 3.6 Quy trình tách thu nhận kháng sinh thô quy mô phòng thí nghiệm Do chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP sản sinh kháng sinh môi trường lên men nên lựa chọn phương pháp chiết rút dung môi không hỗn hợp với nước Trước chiết rút kháng sinh từ dịch nuôi cấy, phải loại tế bào (sinh khối) chủng sản xuất phương pháp ly tâm Sau tiến hành tách chiết sản phẩm kháng sinh theo quy trình sau: Bước 1: Thu dịch nuôi môi trường R2YE Bước 2: Ly tâm nhiệt độ phòng 10 phút với tốc độ 6000 v/p, 4ºC để loại bỏ xác tế bào Bước 3:Thu dịch nuôi bổ sung dung môi Ethyl acetat : dịch nuôi theo tỉ lệ : Bước 4: Lắc hỗn hợp với tốc độ 150 ÷ 200 vòng/phút vòng ÷ 2.5 28ºC Nguyễn Hoài Linh 43 Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bước 5: Tách pha Bước 6: Thu dịch chiết chứa dung môi Bước 7: Quay cô chân không để thu kháng sinh thô Bước 8:Hòa tan kháng sinh Methanol bảo quản -20ºC Hình 3.10 Sơ đồ quy trình thu nhận kháng sinh thô Nguyễn Hoài Linh 44 Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 3.7 Qui trình tinh quy mô phòng thí nghiệm Hình 3.11 Sơ đồ quy trình tinh quy mô phòng thí nghiệm Từ kháng sinh Dihydrochalcomycin thô từ chủng Streptomyces sp KCTC 0041BP chủng đột biến gen GerMIII tiến hành chạy TLC với hệ dung môi Acetone : Cloroform : Sau xác đinh khoảng Rf, tiến hành chạy Prep TLC cách chấm 500µl mẫu mỏng kích thước dài 12cm, rộng 7cm, điểm cách chấm mép 1cm Ở phân đoạn Rf = 0.84 tiến hành cạo 5mm, hòa tan sản phẩm methanol, ly tâm loại bột Silicagel thu kháng sinh tinh sạch, kiểm tra sản phẩm phương pháp thử hoạt tính kháng sinh( thử hoạt kháng sinh khoanh giấy lọc, thử hoạt tính kháng sinh phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC), HPLC, LC-mass Nguyễn Hoài Linh 45 Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết Luận Sau thời gian nghiên cứu nhóm thực mục tiêu đề tài thu kết sau: Đã tách chiết 20ml kháng sinh thô của chủng đột biến M3-8-13 10ml kháng sinh thô chủng đột biến M3-1-10 Thử hoạt tính kháng sinh khoanh giấy lọc cho kết chủng xạ khuẩn đột biến M3-1-10 có đường kính vòng kháng khuẩn D = 10,5 mm, chủng xạ khuẩn khuẩn đột biến M3-8-13 có đường kính vòng kháng khuẩn D = 11 mm, bé chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP ban đầu có đường kính vòng kháng khuẩn D = 25,5 mm Tinh kháng sinh mỏng TLC cho kết Rf = 0,84 Sau tinh kháng sinh Prep – TLC nhận thấy đường kính vòng kháng khuẩn tăng sáng so với thử hoạt tính kháng sinh thô Tiếp tục lấy kháng sinh sau tinh chạy TLC thấy có vạch sáng nhất, kháng sinh tinh Phân tích kháng sinh LC-Mass ESI-Mass cho kết quả: - Chủng đột biến phân tích cấu trúc cho thấy thời gian lưu cột 11,2 phút dẫn xuất kháng sinh xuất - Đo khổ phối dẫn xuất cho thấy khối lượng phân tử 530,6 dvC Xây dựng quy trình thu kháng sinh thô quy mô phòng thí nghiệm Xây dựng quy trình tinh kháng sinh quy mô phòng thí nghiệm 4.2.Đề Xuất Sau trình nghiên cứu thực đề tài, đưa số đề xuất sau: Thực nghiên cứu tách chiết kháng sinh quy mô lớn Tinh kháng sinh quy mô lớn Sử dụng sản phẩm tinh kháng sinh đời sống (y học) Nguyễn Hoài Linh 46 Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Hồ Đức Duy (2012), Nghiên cứu khả sinh tổng hợp tách chiết kháng sinh Dihydrochalcomycin từ xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP, Luận văn thạc sỹ, Hà Nội Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh kháng sinh chống nấm gây bệnh chè Thái Nguyên, Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trường đại học sư phạm Thái Nguyên Bùi Thị Thanh Tịnh (2006), Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α, luận văn kỹ sư sinh học, Đại học Nông Lâm TP HCM Lê Đỗ Huyền Trang (2012), Nghiên cứu biểu gen GerF nhóm gen sinh tổng hợp gốc đường dTDP-6-deoxy-D-allose cấu trúc kháng sinh dihydrochalcomycin, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Công nghệ sinh học-Viện đại học Mở Hà Nội Phạm Chí Công (2010), Nghiên cứu vai trò gen gerK nhóm gen sinhtổng hợp gốc đường khử cấu trúc kháng sinh Dihydrochalcomycin, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa công nghệ sinh học- Viện dại học mở Hà Nội Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men chất kháng sinh, NXB Khoa học kĩ thuật Hà Nội, 2004 Lê Mai Hương, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh phân lập Hà Nội vùng phụ cận, Luận văn phó tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, 1993 Nguyễn Lân Dũng (1993), Thực tập vi sinh vật học NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học – Tập III NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội 10 Vi Thị Đoan Chính (2000), Nghiên cứu khả nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng Streptomyces rimosus R77 Streptomyces hygroscopicus 5820 Nguyễn Hoài Linh 47 Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp kỹ thuật dung hợp tế bào trần, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội 11 Vi Thị Đoan Chính, Tuyển chọn nghiên cứu xạ khuẩn có khả đối kháng với số chủng vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học công nghệ cấp Bộ Mã số B2009 – TN07 – 02 12 Nguyễn Hoàng Chiến (2000), Nghiên cứu chủng xạ khuẩn Streptomyces V6 sinh chất kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua, Luận văn thạc sĩ sinh học, Hà Nội 13 Ngô Văn Luân (2013), Nghiên cứu tạo đột biến gen mã hóa cho enzyme 2O-methyltransferaza (gen GerM3 ) phương pháp tiếp hợp xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC0041BP, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa Công nghệ sinh họcViện đại học Mở Hà Nội 14 Nguyễn Thị Thu Hà (2014), Bước đầu nghiên cứu tách chiết kiểm tra sản phẩm kháng sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP sau đột biến gen gerMIII, Khóa luận tốt nghiệp, Khoa công nghệ sinh học – Viện đại học Mở Hà nội Tài liệu tiếng anh 15 Ta Thi Thu Thuy, Biosynthesis pathway of dihydrochalcomycin produced by Streptomyces sp KCTC 0041BP: deoxysugar and glycosyltransferase, 2006 16 Poehlsgaard, J., Douthwait, S., The macrolide binding site on the bacterial ribosome Current drug targets Infectious disorders, 2002, 2(1), 67-78 17 Bate N, Cundliffe E The mycinose-biosynthetic genes of Streptomyces fradiae, producer of tylosin, 1999, J Ind.Microbiol Biotechnol 23, 118-122 18 Jaishy, Bharat Prasad, Si Kyu Lim, Ick Dong Yoo, Jin Cheol Yoo, Jae Kyung Sohng, and Doo Hyun Nam, Cloning and Characterization of a Gene Cluster for the Production of Polyketide Macrolide Dihydrochalcomycin in Streptomyces sp KCTC 0041BP, 2006, J Microbiol Biotechnol., 16, 764-770 19 Goo, Y M., Y Y Lee, and B T Kim, A new 16-membered chalcomycin type macrolide antibiotic, 1997, J Antibiot 50, 85-88 Nguyễn Hoài Linh 48 Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 20 Hansen, J L., Ippolito, J A., Ban, N., Nissen, P., Moore, P B., Steitz, T A., The Structures of Four Macrolide Antibiotics Bound to the Large Ribosomal Subunit , 2002, Mol Cell., 10, 117-128 21 Kim, S.D., IJ Ryoo., CJ Kim., WG Kim., JP.Kim., JY Kong., H Koshino.,M Uramoto and ID Yoo, GERI-155 a new macrolide antibiotic related to chalcomycin, 1996, J Antibiot 49, 55-957 22 Kirst HA, Sides GD, New directions for macrolide antibiotics: structural modifications and in vitro activity Antimicrob Agents Chemother, 1989 Sep, 33(9), 1413–1418 23 Waksman, S A (1961) The Actinomycetes Classification, identification and descriptions of genera and species, vol 2, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA Nguyễn Hoài Linh 49 Lớp 11-02 [...]... kháng sinh thô, thử hoạt tính kháng sinh được tách chiết từ chủng xạ khuẩn đột biến này và xác định cấu trúc kháng sinh thu được từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP đã đột biến mất gen ger MIII Nguyễn Hoài Linh 22 Lớp 11-02 Viện đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu hóa chất và thiết bị 2.1.1 Vật liệu - Xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP. .. kết quả nghiên cứu, hoạt tính và chức năng của gen GerMIII đã được chứng minh bằng phương pháp đột biến gen (tiếp hợp gen) để tạo chủng xạ khuẩn đột biến không có chứa gen GerMIII Tiếp tục phân tích đánh giá sản phẩm trung gian từ chủng xạ khuẩn đột biến gen GerMIII, tách chiết và tinh sạch hợp chất có hoạt tính sinh học mới 1.5 Tổng quan về kháng sinh dyhidrochalcomycin Macrolide là kháng sinh được sử... kháng sinh Apramycin và tạo chủng đột biến có trao đổi chéo đơn và chủng có trao đổi chéo kép (Khóa luận tốt nghiệp – Ngô Văn Luân,2013) Sau đó, tiếp tục nghiên cứu tách chiết và kiểm tra thành công sản phẩm kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP sau khi đột biến gen gerMIII (Khóa luận tốt nghiệp – Nguyễn Thị Thu Hà, 2014) Vì vậy, quyết định thực hiện đề tài để nghiên cứu tách chiết kháng. .. lọc được các chủng xạ khuẩn trên môi trường R2YE có bổ sung kháng sinh Neo và Apr để tạo chủng có trao đổi chéo đơn và trao đổi chéo kép Kết quả tạo được vector đột biến gen gerMIII trong vector pKC1139 và biến nạp thành công vào tế bào E coli ET 12567/pUZ8002[13] 1.5.3.8 Bước đầu nghiên cứu tách chiết và kiểm tra sản phẩm kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP Nhóm đã bước đầu tách. .. KCTC 0041BP Chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP được phân lập tại Hàn Quốc do khoa Hóa học trường Đại học Sun Moon – Hàn Quốc cung cấp Đây là chủng tự nhiên sản sinh ra kháng sinh dihydrochalcomycin và cũng là chủng vi sinh vật đối chứng trong nghiên cứu Chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP đột biến mất gen gerMIII (kế thừa từ đề tài khóa luận của Nguyễn Thị Hà, 2014) - Vi khuẩn Bacillus... bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR – Nuclear Magnetic Resonance) và được phân loại thu c nhóm kháng sinh PKS loại I Nhóm nghiên cứu đã tách và lập được thư viện gen, tách được nhóm gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp dihydrochalcomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. KCTC 0041BP Toàn bộ nhóm gen tham gia sinh tổng hợp có chuỗi trình tự là 75,5kb đã được xác định trong đó có chứa... tạo được vector đột biến gen gerMI trong vector pKC1139 và biến nạp thành công vào tế bào E coli ET 12567/pUZ8002[14] 1.5.3.7 Nghiên cứu tạo đột biến gen mã hóa cho enzyme 2-O-methyltransferaza (gen gerMIII) bằng phương pháp tiếp hợp trên xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP Kết quả đã tiếp hợp chuyển gen Plasmid pKC 1139 chứa đoạn gen đột biến UM3 – NeoR – DM3 vào tế bào xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC. .. minh được chức năng của gen ger MIII trong con đường sinh tổng hợp kháng sinh dihydrochalcomycin của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP 1.6 Đại cương về gen gerMIII (2-O-methyltransferase) Gen gerMIII thu c nhóm gen tham gia vào con đường sinh tổng hợp kháng sinh dihydrochalcomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP Toàn bộ nhóm gen sinh tổng hợp có chuỗi trình tự là 75,5kb , trong... mạnh có thể ức chế và tiêu diệt cả vi khuẩn Gr- và Gr+ Đã phân lập thành công chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP tạo ra chất kháng sinh này, đồng thời cấu trúc hóa học của kháng sinh này cũng được xác định bởi nhóm nghiên cứu tại Hàn Quốc, kháng sinh này được xác định là chất dẫn xuất của kháng sinh chalcomycin đã được xác định trước đó bởi nhóm nghiên cứu khác [15],[20] Mặc dù toàn bộ cơ chế... đầu tách chiết thành công AND tổng số của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp KCTC 0041BP sau đột biến Đã sàng lọc được các chủng M3-110, M3-8-21, M3-3-13 có xảy ra quá trình trao đổi chéo kép làm mất gen gerMIII bằng phản ứng nhân gen PCR thành công với các cặp mồi đặc hiệu Giải trình tự gen chứng minh chủng xạ khuẩn đã đột biến gen ger MII thành công Bước đầu chứng minh được chức năng của gen ger MIII trong