VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: PHÂN TÍCH SỰ BIẾN ĐỔI ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA RONG BIỂN BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ BƯỚC ĐẦU LỰA CHỌN DÒNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH VÀ CHỊU NHIỆT CAO CỦA BA CHI RONG SỤN, RONG NHO VÀ RONG CÂU Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: Lớp: PGS.TS Đặng Diễm Hồng Bùi Thị Thân KS CNSH 11-04 Hà Nội – 2015 VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: PHÂN TÍCH SỰ BIẾN ĐỔI ĐA DANG DI TRUYỀN CỦA RONG BIỂN BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ BƯỚC ĐẦU LỰA CHỌN DÒNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH VÀ CHỊU NHIỆT CAO CỦA BA CHI RONG SỤN, RONG NHO VÀ RONG CÂU Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Đặng Diễm Hồng Sinh viên thực hiện: Bùi Thị Thân Lớp: KS CNSH 11-04 Hà Nội – 2015 Luận văn tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Lời xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Đặng Diễm Hồng, Trưởng phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện cho thực tập phòng thí nghiệm Tôi vô cảm ơn TS Ngô Thị Hoài Thu, phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp Chị dành nhiều thời gian, tâm huyết, tận tình dẫn cho nhiều kiến thức đề tài mới, cho lỗi sai, giúp không bị lệch hướng biển kiến thức mênh mông Để định hướng tốt làm luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể phòng Công nghệ Tảo giúp đỡ nhiệt tình chia sẻ khó khăn với suốt trình thực tập phòng Những ngày làm thí nghiệm bữa ăn trưa anh chị phòng kỉ niệm đẹp đáng nhớ đời Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất thầy, cô Viện Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội giúp đỡ dạy bảo thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, gia đình bạn bè tạo điều kiện tốt động viên suốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2015 Sinh viên Bùi Thị Thân Bùi Thị Thân i Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v MỞ ĐẦU PHẦN Ι: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu rong biển giới 1.1.1 Giới thiệu chung rong biển 1.1.2 Rong Sụn 1.1.2.1 Giới thiệu rong Sụn 1.1.2.2 Đặc điểm sinh học rong Sụn 1.1.2.3 Nguồn gốc rong Sụn Việt Nam 1.1.2.4 Giá trị dinh dưỡng, nuôi trồng nguồn lợi khai thác rong Sụn 1.1.3 Rong Nho 10 1.1.3.1 Đặc điểm sinh học 10 1.1.3.2 Giá trị dinh dưỡng, nuôi trồng nguồn lợi khai thác rong Nho 11 1.1.4 Rong Câu 13 1.1.4.1 Đặc điểm sinh học 14 1.1.4.2.Giá trị dinh dưỡng, nuôi trông khai thác rong Câu 15 1.2.Tình hình nghiên cứu rong biển việt nam 16 1.2.1 Đa dạng rong biển sử dụng sinh khối rong biển Việt Nam 16 1.2.2 Hiện trạng khai thác nuôi trồng rong biển Việt Nam 17 1.3 Nghiên cứu quan hệ di truyền thực vật 18 1.3.1 Kĩ thuật RAPD 18 1.3.2 Nghiên cứu đánh giá tính chống chịu với điều kiện nhiệt độ cao, hạn, độ mặn cao số gen đặc trưng 19 Bùi Thị Thân ii Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học PHẦN ΙΙ: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.2 Hóa chất 24 2.3 Thiết bị 24 2.4 Phương pháp nghiên cứu 25 2.4.1 Tách chiết ADN tổng số 25 2.4.2 Phản ứng RAPD-PCR với mồi ngẫu nhiên 26 2.4.3 Điện di gel agarose 27 2.5 Xử lý số liệu 28 PHẦN ΙΙΙ: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Tách chiết AND tổng số 31 3.2 Phân tích tính đa hình ADN kỹ thuật RAPD-PCR 32 3.3 Bước đầu đánh giá sơ tính chống chịu 12 mẫu rong sử dụng nghiên cứu 42 KẾT LUẬN 44 KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 Bùi Thị Thân iii Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ bp Số cặp base PCR Polymerase Chain Reaction ADN Axít Deoxyribonucleic RAPD Random amplified polymorphic DNA dNTP Deoxynucleotide EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid kb Kilobase HSĐDDT Hệ số đồng dạng di truyền Bùi Thị Thân iv Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Danh sách 10 mẫu rong Sụn, rong Nho rong Câu sử dụng 24 nghiên cứu Bảng 2.2 Trình tự mồi ngẫu nhiên sử dụng nghiên cứu 26 Bảng 3.1 Các đoạn ADN nhân phản ứng RAPD-PCR với 35 mồi ngẫu nhiên cặp mồi DREB2 Bảng 3.2 Hệ số đồng dạng di truyền 10 mẫu rong thuộc loài K alvarezii, K 40 striatum, Eucheuma denticulatum, Gracilaria tenuistipitata, G bailinae C lentillifera dựa vào kết RAPD-PCR với mồi ngẫu nhiên cặp mồi DERB2F-R Bùi Thị Thân v Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Hình ảnh hai loài Rong Sụn A: K alvarezii; B: K striatum Hình 1.2 Sơ đồ vòng đời rong Sụn Hình 1.3 Hình thái rong Sụn Hình 1.4 Hình thái rong Nho (Caulerpa lentillifera J Agracilarh, 1873) 11 Hình 1.5 Hình thái rong Câu (Gracilaria) 15 Hình 3.1 Ảnh hình thái 10 mẫu rong Sụn, rong Nho rong Câu 32 Hình 3.2 ADN tổng số 10 mẫu rong nghiên cứu 32 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPH08, 34 OPR08, RA143, OPN15, OPN04, OPE14, OPC19, OPV11 Hình 3.4 Sản phẩm PCR 10 mẫu rong với mồi DREB2 38 Hình 3.5 Cây phát sinh chủng loại 10 mẫu rong biển thuộc loài K 40 alvarezii, K striatum, Eucheuma denticulatum, Gracilaria tenuistipitata, G bailinae C lentillifera Bùi Thị Thân vi Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học MỞ ĐẦU Một số loài rong biển có tầm quan trọng kinh tế Việt Nam Rong biển sử dụng làm thực phẩm cho người động vật nuôi; nguyên liệu cho ngành công nghiệp, ngành Y-học, sản xuất phân bón gần dùng để sản xuất nhiên liệu sinh học Chính vậy, quốc gia có biển trọng phát triển việc nuôi trồng- khai thác chế biến rong biển Việt Nam đất nước nhiệt đới gió mùa, với 3260 km đường bờ biển nhiều đảo quần đảo Đây điều kiện thuận lợi để hệ rong biển phát triển đa dạng Tổng số loài rong biển dọc theo bờ biển Việt Nam, bao gồm hải đảo, ước tính gần 1000 loài Theo truyền thống, ngư dân Việt biết nuôi trồng, thu hoạch sử dụng rong biển trăm năm nay, nhóm rong kinh tế phổ biến Việt Nam gồm rong Sụn (Kappaphycus), rong Câu (Gracilaria), rong Nho (Caulerpa), rong Mơ (Sargassum) Tuy nhiên, việc nuôi trồng - khai thác rong biển nhiều hạn chế, chưa mang lại hiệu kinh tế cao Do đặc điểm khí hậu nhiệt đới gió mùa có ảnh hưởng nhiều đến phân bố đa dạng, sinh trưởng phát triển, chất lượng rong biển Các yếu tố sâu bệnh, nhiệt độ, lượng mưa độ mặn vùng ven biển có ảnh hưởng lớn tới phát triển rong biển Vì yêu cầu đặt cần phải nghiên cứu tìm dòng có khả chống chịu tốt với thay đổi điều kiện ngoại cảnh Từ giúp nâng cao sản lượng chất lượng loài Để nuôi trồng rong biển trở thành ngành công nghiệp mang lại nguồn thu nhập cho người dân góp phần ổn định kinh tế nước nhà Chính yêu cầu cấp thiết nêu mà tiến hành thực đề tài nghiên cứu “Phân tích biến đổi đa dạng di truyền rong biển kỹ thuật sinh học phân tử bước đầu lựa chọn dòng có khả kháng bệnh chịu nhiệt cao ba chi rong Sụn, rong Nho rong Câu” với mục tiêu nghiên cứu sau: • Phân tích biến đổi di truyền loài rong biển Việt Nam kỹ thuật sinh học phân tử nhờ sử dụng mồi đa hình ngẫu nhiên (RAPD-PCR) Bùi Thị Thân Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học • Bước đầu lựa chọn dòng có khả kháng bệnh, chịu nhiệt, chịu hạn cao loài thuộc ba chi rong Sụn, rong Nho rong Câu Công việc nghiên cứu thực phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Bùi Thị Thân Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 200 0 0 0 0 10 100 1 0 1 0 OPN15 2000 1 1 1 1 1 1300 0 1 0 850 1 1 1 1 500 0 0 0 1 200 0 0 0 0 OPN04 2000 0 0 0 1 1300 1 1 1 1000 1 1 1 1 870 0 0 1 1 600 0 1 0 0 400 1 0 0 0 0 OPE14 1500 1 1 0 1300 1 1 0 1000 1 0 1 0 0 870 1 1 1 1 600 1 1 1 1 400 1 1 0 OPC19 4000 0 0 0 0 2000 0 0 0 1300 0 0 1 1 1000 1 1 1 1 850 1 1 1 1 700 1 1 1 1 550 0 0 0 0 400 0 0 0 OPV11 Bùi Thị Thân 36 Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 4000 1 1 0 0 1500 0 0 0 1 1300 1 1 1 1 1 1000 1 1 1 1 1 870 1 1 1 1 1 700 0 0 0 1 0 500 0 1 0 1 400 1 0 0 0 350 0 0 1 10 300 0 0 0 0 DERB2 1500 0 0 0 1 1350 0 0 0 0 1000 0 0 1 0 700 0 0 0 0 500 1 1 1 1 1 400 0 1 1 1 Kết điện di sản phẩm PCR trình bày hình 3.3 Các băng ADN nhân phản ứng RAPD - PCR với mồi ngẫu nhiên tổng kết bảng 3.1 Kết nghiên cứu thu cho thấy có 69 băng ADN nhân rõ nét, có kích thước khác nhau, có băng chung cho 10 mẫu rong (chiếm 8,6%) băng lại 63 đa hình (chiếm 91,4%) Các băng chung cho 10 mẫu sau: mồi OPR08-1000bp, mồi OPN15-2000, mồi OPV111300, 1000 870bp, mồi DREB2- 500pb Trong đó, mồi OPH08, RA143, OPV11 nhân 10 băng; mồi OPR08, OPC19 nhân băng; mồi OPN04, OPE14, DREB2 nhân 6; mồi OPN15 nhân băng Kích thước băng thay đổi từ 100bp (OPA4) đến 4000bp (OPC19) Điều chứng tỏ 10 mẫu rong nghiên cứu có sai khác di truyền lớn Khi phân tích tính đa hình mẫu dòng với nhận thấy rằng: Bùi Thị Thân 37 Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học Đối với mẫu K alvarezii có màu xanh nâu (mẫu 2): có tổng số 33 băng với kích thước từ 100 bp 4000 bp Trong đó, 26 băng chung cho hai dòng chiếm 78,78% băng đa hình chiếm tỉ lệ 21,21% mẫu C lentillifera: có tổng số 43 băng với kích thước dao động từ 100 bp đến khoảng 4000bp Trong có 14 băng chung cho mẫu, chiếm 32,55% 29 băng đa hình chiếm tỉ lệ 67,44% Có 14 maker chung cho mẫu thuộc chi Caulerpa bao gồm mồi OPH08- 1300, 870, 600bp; mồi OPR08- 1000bp; mồi RA143-500bp; mồi OPN15- 2000, 850bp; mồi OPN04- 870; mồi OPE14- 870, 600bp; mồi OPV111300, 1000, 870bp, mồi DREB2 – 500 bp mẫu Gracilaria tenuistipitata, G bailinae G bailinae Cam Ranh: có tổng số 52 băng với kích thước dao động từ 100 bp đến khoảng 4000bp nhân Trong có 17 băng chung cho mẫu chiếm 32,69% 35 băng đa hình chiếm 67,31% 17 maker chung gồm mồi OPR08-1300, 1000bp; RA143- 1500, 850, 600, 500; OPN15-2000bp, OPN04 - 1300, 1000bp; OPC19 - 850, 700bp; OPV11- 1300, 1000, 870bp; DREB2 - 1000, 500 ,400 bp Hình 3.4 Sản phẩm PCR 10 mẫu rong với mồi DREB2 Giếng C+: Mẫu Đối chứng (với mồi DREB2) 500 bp Giếng 2-11: Sản phẩm PCR với mồi DREB2 10 mẫu rong tương ứng với mẫu có thứ tự từ 1-10 bảng Giếng M2: Thang chuẩn φX174 RF DNA/Hae III Fragment Dựa xuất không xuất băng ADN nhân ngẫu nhiên với mồi ngẫu nhiên RAPD cặp mồi DREB2, mối liên quan di truyền học 10 mẫu rong sử dụng nghiên cứu bao gồm K alvarezii, Bùi Thị Thân 38 Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học K striatum, Eucheuma denticulatum, Gracilaria tenuistipitata G bailinae, C lentillifera mức độ phân tử thiết lập Các số liệu phân tích theo chương trình NTS 2.0 Sự khác mức độ phân tử biểu hệ số đồng dạng di truyền mẫu loài hay loài khác Hệ số đồng dạng di truyền cao mối quan hệ di truyền loài hay dòng gần Chúng ta phân chia mức độ giống (hay mức độ gần mặt di truyền) mẫu sau: - Nếu hệ số đồng dạng di truyền mẫu hay loài > 0,92 chúng coi gần mặt di truyền coi một; khó phân biệt chúng mặt di truyền - Nếu hệ số đồng dạng di truyền [...]... 7,4-8,5 Rong Câu sinh trưởng tốt nhất trong môi trường không có hoặc có lẫn rất ít một số rong Lục (rong Tóc, rong Bún), rong Đỏ (rong nhiều ống) hoặc một số cỏ dại khác hoặc bùn cát Rong Câu sinh sản với 3 hình thức sinh sản chủ yếu là sinh sản dinh dưỡng, sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính Trong vòng đời của rong Câu, cây bào tử và cây giao tử của Gracilaria xảy ra luân phiên trong vòng đời Cây bào tử. .. cận nhiệt đới, khoảng 40% tổng số loài nhiệt đới Có khoảng 60% rong biển của Việt Nam có mối quan hệ mật thiết với rong biển nhiệt đới, trong khi chỉ có 14,3% có mối quan hệ với rong biển cận nhiệt đới Các nhóm rong biển quan trọng về mặt kinh tế có thể được sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi (con người và động vật), vật liệu cho ngành công nghiệp, y học cổ truyền và làm phân bón sinh học Các... miền Trung và miền Nam Việt Nam 1.2 Tình hình nghiên cứu rong biển ở việt nam 1.2.1 Đa dạng rong biển và sử dụng sinh khối rong biển ở Việt Nam Việt Nam là nước nhiệt đới với đường bờ biển dài khoảng 3260 km Biển Việt Nam nằm ở phía Tây Bắc của Biển Đông, với khí hậu thay đổi từ cận nhiệt đới ở phần phía bắc tới khí hậu nhiệt đới ở phần phía nam của đất nước, Việt Nam có hệ rong biển rất đa dạng với... xác định kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền loài và lập bản đồ di truyền Kỹ thuật RAPD được sử dụng để nhận biết và phân loại các giống cây khác nhau, sự đa dạng di truyền của các đối tượng đó Bùi Thị Thân 18 Lớp 11-04 Luận văn tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học 1.3.2 Nghiên cứu đánh giá tính chống chịu với điều kiện nhiệt độ cao, hạn, độ mặn cao bằng một số gen đặc... mức mRNA của gen quan tâm khi chúng được biểu hiện dưới các điều kiện và xử lý khác nhau [49] Để có thể chống chịu lại với điều kiện môi trường bất lợi như hạn hán, muối và nhiệt độ quá cao đối với sinh trưởng và năng suất sinh học, thực vật có những thay đổi trong phản ứng lại với môi trường ở mức độ phân tử, tế bào, và sinh lý học Các protein chức năng và điều khiển có vai trò quan trọng trong việc... xác vỏ sinh vật, ở vùng ven biển và ven đảo Rong Nho biển mọc trên đáy mềm từ vùng triều thấp sâu đến 8m, nhưng ở vùng nước có độ trong cao như ở Bikini, rong Nho có thể phân bố sâu đến 40m Chúng có đặc tính mềm và ngon, vị nhạt và mọng nước nên rất được ưa chuộng và được sử dụng làm thức ăn truyền thống ở các nước Nhật Bản, Philippines dưới dạng rau xanh hay salad [38] 1.1.4 Rong Câu Rong Câu (Gracilaria)... Euglenophyta 9 Ngành rong Lục Chlorophyta 10 Ngành tảo Vòng Charophyta Trong đó rong Câu và rong Sụn đều thuộc ngành rong Đỏ (Rhodophyta), còn rong Nho thuộc ngành rong Lục Rong biển rất giàu protein, lipit, cacbonhydrate, giàu sắc tố, khoáng đa và vi lượng và rất giàu các chất có hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng viêm, kháng virut, chất chống oxi hóa và đặc biệt là các axit béo không bão hòa đa nối đôi... Công nghệ sinh học - Nhu cầu muối dinh dưỡng chỉ thể hiện rõ trong điều kiện nhiệt độ cao và ánh sáng mạnh Trong điều kiện nước biển tự nhiên và trao đổi thường xuyên, hàm lượng các muối đã đủ cho rong sinh trưởng và phát triển [8] 1.1.2.3 Nguồn gốc của rong Sụn ở Việt Nam Rong Sụn ở Việt Nam là loài rong biển nhiệt đới có nguồn gốc từ Philippines Tháng 2 năm 1993 trong chương trình hợp tác khoa học Việt... cũng có thể có màu đỏ (hình 1.3) Trong điều kiện nhiệt độ không quá cao và nước được trao đổi thường xuyên thì rong Sụn không đòi hỏi nhiều về các chất dinh dưỡng vì trong nước biển đã cung cấp đủ để cho rong phát triển Chỉ trong điều kiện nước tĩnh ít được trao đổi và nhiệt độ nước cao, khi đó rong Sụn đòi hỏi phải được cung cấp chất dinh dưỡng cao để có thể giúp cây phát triển bình thường trong điều... rất cần thiết cho sự phát triển của rong Nho, các nhánh hình cầu cũng sẽ mọc mạnh hơn trong môi trường có dòng chảy mạnh và sẽ thưa hơn trong môi trường nước yên tĩnh hay dòng chảy yếu Sinh trưởng của rong đạt cao nhất khi có dòng chảy đạt tốc độ 20-30cm/giây Sau 2 tháng trồng theo phương pháp như trên, tăng trưởng của rong Nho có thể đạt từ 1,54% đến 3,16%/ ngày Ở Philippines, rong Nho đã được nuôi