ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -o0o - NGUYỄN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG KHÁNG NGUYÊN TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN CÚM LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG KHÁNG NGUYÊN TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN CÚM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đỗ Tuấn Đạt PGS.TS Bùi Thị Việt Hà Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến: - TS Đỗ Tuấn Đạt, Công ty TNHH MTV Vắcxin Sinh phẩm số - PGS TS Bùi Thị Việt Hà, Bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội Là người Thầy tận tình quan tâm dạy bảo kinh nghiệm quý báu tạo điều kiện giúp tơi hồn thành khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn đến thầy cô khoa Sinh học - trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, giảng dạy dìu dắt tơi suốt q trình học tập vừa qua Nhân dịp tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, đồng nghiệp, bạn bè động viên, giúp đỡ chia sẻ để tơi có đủ nghị lực hồn thành nhiệm vụ học tập Tơi xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày 18 tháng 11 năm 2015 Học viên Nguyễn Thị Kim Dung MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU Bệnh cúm đe dọa toàn cầu Trong ba kỷ qua, khoảng 10 đến 40 năm, giới lại chứng kiến đại dịch cúm Trước có vắcxin, đợt dịch có hàng triệu người chết Năm 1918 chứng kiến đại dịch cúm nghiêm trọng lịch sử giới, chí cịn cho đại dịch kinh hồng loại bệnh dịch Tác nhân gây dịch vi rút cúm A/H1N1 gây tổn thất chưa thấy Dịch cúm gia cầm A/H5N1 xuất từ tháng 12/2003 Hàn Quốc, sau lan rộng số nước châu Á có Việt Nam Từ đầu tháng 4/2009, Mexico thông báo trường hợp nhiễm cúm A/H1N1 Vi rút nhanh chóng lan nhiều quốc gia giới có thời điểm Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) phải đưa cảnh báo coi đại dịch cúm Gần nhất, vào năm 2013, trường hợp nhiễm cúm A/H7N9 thông báo Trung Quốc tiếp tục dấy lên mối lo ngại cho châu Á nói riêng tồn Thế giới nói chung ngun cúm nguy hiểm sức khoẻ người Bệnh cúm bệnh nhiễm trùng đường hô hấp tạo nên gánh nặng lớn sức khỏe cộng đồng, TCYTTG 40% quốc gia Thế giới khuyến cáo sử dụng vắcxin phòng vi rút cúm Do vậy, phát triển vắcxin cúm cho người đặt yêu cầu cấp bách Là sở nghiên cứu sản xuất vắcxin cho người Việt Nam, Công ty TNHH MTV Vắcxin sinh phẩm số tiến hành xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H5N1, cúm A/H1N1 tiến tới vắcxin cúm A/H7N9 nuôi cấy tế bào Một thông số quan trọng để đánh giá chất lượng vắcxin phịng thí nghiệm đặc tính kháng nguyên vi rút cúm có mặt sản phẩm trình sản xuất vắcxin Xây dựng phương pháp để đánh giá, từ đưa tiêu chuẩn chất lượng kháng nguyên việc làm cần thiết Điều giúp cho việc đánh giá chất lượng vắcxin kiểm tra độ ổn định quy trình sản xuất Do vậy, tiến hành thực đề tài : “Nghiên cứu xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm” sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cúm A/H1N1, với mục tiêu : Nghiên cứu xây dựng áp dụng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm Chương - TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm chung vi rút cúm Vi rút cúm thuộc họ Othomyxoviridae họ vi rút đa hình thái, có vỏ ngồi, genom ARN đơn, (-), phân đoạn, bao gồm nhóm vi rút: vi rút cúm A, vi rút cúm B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto vi rút Isa Trong đó, vi rút cúm A lưu hành phổ biến gia cầm, người động vật khác lợn, ngựa…là nguyên gây nên đại dịch lớn toàn cầu Vi rút cúm B C lưu hành người thường gây nên vụ dịch vừa nhỏ Các vi rút cúm A, B C giống cấu trúc Thể vi rút có chiều ngang từ 80-120 nm, thường có hình gần trịn, ngồi vi rút diện số dạng hình sợi Thể vi rút cúm cấu tạo từ vỏ vi rút bao gồm loại glycoprotein, quấn quanh phần nhân trung tâm Phần nhân trung tâm chứa gene RNA protein khác có chức đóng gói bảo vệ thể RNA Đối với vi rút, thơng thường gene khơng có mảnh nucleic acid; thay vào đấy, chứa mảnh RNA có chiều âm phân đoạn Vi rút cúm A có gene mã hố cho 11 protein đoạn RNA: hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), nucleoprotein (NP), M1, M2, NS1, NS2 (NEP), PA, PB1, PB1-F2 PB2 1.2 Hình thái cấu trúc hạt vi rút cúm Hạt vi rút cúm có hình dáng đa dạng: hình cầu, hình trứng đơi có hình sợi kéo dài tới 2000 nm, đường kính trung bình từ 80-120 nm Các hạt virion vi rút A B có vỏ bao bọc Vỏ vi rút có chất protein có nguồn gốc từ màng tế bào vật chủ, bao gồm số protein glycosyl hóa số protein dạng trần khơng glycosyl hóa Vi rút cúm có genom nhiều đoạn, typ A B có đoạn ARN(-) với tổng khối lượng 5x106, cịn typ C có đoạn Trong virion có chứa enzyme ARN- polymeraza phụ thuộc ARN, enzyme cần cho trình phiên mã genom ARN chuỗi (-) Protein capsit kết hợp với ARN tạo nucleocapsit đối xứng xoắn 10 KẾT LUẬN Nghiên cứu xây dựng áp dụng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm: Tìm điều kiện tối ưu cho phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm - CCID50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào) là: + Nhiệt độ nuôi cấy vi rút: 32oC + Môi trường nuôi cấy vi rút: môi trường MEM + Thời gian nuôi cấy vi rút: ngày - Đã áp dụng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên cúm phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID 50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào), phương pháp chuẩn độ kháng nguyên HA kỹ thuật ngưng kết hồng cầu, phương pháp xác định hàm lượng kháng nguyên HA SRID, phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số, phương pháp điện di gel SDS-PAGE, phương pháp kính hiển vi điện tử cho loạt vắcxin cúm A/H5N1 10 loạt vắcxin cúm A/H1N1 Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên quy trình sản xuất vắcxin cúm nhằm đảm bảo tính ổn định chất lượng sản phẩm - Hiệu giá vi rút quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 10 6,5 CCID50/ml trở lên - Hiệu giá kháng nguyên HA phương pháp ngưng kết hồng cầu quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 128 HAU/50µl trở lên - Hàm lượng kháng nguyên HA SRID quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 100 µg/ml trở lên 70 - Hàm lượng Protein tổng số quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 200 µg/ml đến 600 µg/ml - Bán thành phẩm sau siêu ly tâm tinh nhiều so với trước siêu ly tâm, khơng cịn lẫn tạp chất, sản phẩm băng protein vi rút cúm - Vi rút cúm sau siêu ly tâm nguyên vẹn với kháng nguyên bề mặt đặc hiệu vi rút - 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thanh Thủy, Trần Quang Huy (2010) Atlas vi rút gây bệnh cho người, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên công nghệ Nguyễn Văn Ty (2005) Vi rút học, Nhà xuất Giáo dục Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương (2014).Báo cáo tổng kết giám sát cúm mùa năm 2014, Location Tiếng Anh Banjac, M., E Roethl, F Gelhart, P Kramberger, B L Jarc, M Jarc, A Strancar, T Muster, M Peterka (2014) "Purification of Vero cell derived live replication deficient influenza A and B virus by ion exchange monolith chromatography", Vaccine, 32(21): pp 2487-92 Belshe, R B., K M Edwards, T Vesikari, S V Black, R E Walker, M Hultquist, G Kemble, E M Connor, Caiv- T Comparative Efficacy Study Group (2007) "Live attenuated versus inactivated influenza vaccine in infants and young children", N Engl J Med, 356(7): pp 685-96 Berger, Stephen (2015) GIDEON Guide to Vaccines 119 Centers for Disease Control and Prevention, CDC (2004) "Cases of influenza A (H5N1) Thailand, 2004 MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2004; 53:100." Centers for Disease Control and Prevention, CDC (2012) "Prevention and control of influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP) – United States, 2012–13 influenza season.", MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 61(32): pp 613-8 Chen, H., H Yuan, R Gao, J Zhang, D Wang, Y Xiong, G Fan, F Yang, X Li, J Zhou, S Zou, L Yang, T Chen, L Dong, H Bo, X Zhao, Y Zhang, Y Lan, T Bai, J Dong, Q Li, S Wang, Y Zhang, H Li, T 72 Gong, Y Shi, X Ni, J Li, J Zhou, J Fan, J Wu, X Zhou, M Hu, J Wan, W Yang, D Li, G Wu, Z Feng, G F Gao, Y Wang, Q Jin, M Liu, Y Shu (2014) "Clinical and epidemiological characteristics of a fatal case of avian influenza A H10N8 virus infection: a descriptive study", Lancet, 383(9918): pp 714-21 10 Clancy, S (2008) "Genetics of the influenza virus", Nature Education, 1(1): pp 83 11 Collin, N., X de Radigues, H N Vaccine Task Force World Health Organization (2009) "Vaccine production capacity for seasonal and pandemic (H1N1) 2009 influenza", Vaccine, 27(38): pp 5184-6 12 Cowling, B J., L Jin, E H Lau, Q Liao, P Wu, H Jiang, T K Tsang, J Zheng, V J Fang, Z Chang, M Y Ni, Q Zhang, D K Ip, J Yu, Y Li, L Wang, W Tu, L Meng, J T Wu, H Luo, Q Li, Y Shu, Z Li, Z Feng, W Yang, Y Wang, G M Leung, H Yu (2013) "Comparative epidemiology of human infections with avian influenza A H7N9 and H5N1 viruses in China: a population-based study of laboratory-confirmed cases", Lancet, 382(9887): pp 129-37 13 Eisfeld, A J., G Neumann, Y Kawaoka (2015) "At the centre: influenza A virus ribonucleoproteins", Nat Rev Microbiol, 13(1): pp 28-41 14 Gilleland, H E., Jr., L B Gilleland, J Staczek, R N Harty, A GarciaSastre, O G Engelhardt, P Palese (1997) "Chimeric influenza viruses incorporating epitopes of outer membrane protein F as a vaccine against pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa", Behring Inst Mitt(98): pp 291-301 15 Hamilton, S B., D E Wyatt, B T Wahlgren, M K O'Dowd, J M Morrissey, D E Daniels, J A Lednicky (2011) "Higher titers of some H5N1 and recent human H1N1 and H3N2 influenza viruses in Mv1 Lu vs MDCK cells", Virol J, 8: pp 66 73 16 Hay, A J., A J Wolstenholme, J J Skehel, M H Smith (1985) "The molecular basis of the specific anti-influenza action of amantadine", EMBO J, 4(11): pp 3021-4 17 He, C., Z Yang, K Tong (2011) "Downstream processing of Vero cellderived human influenza A virus (H1N1) grown in serum-free medium", J Chromatogr A, 1218(31): pp 5279-85 18 Ito, T., J N Couceiro, S Kelm, L G Baum, S Krauss, M R Castrucci, I Donatelli, H Kida, J C Paulson, R G Webster, Y Kawaoka (1998) "Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential", J Virol, 72(9): pp 7367-73 19 J., Hickling, E’Hondt E (2006) "A review of production technologies for influenza virus vaccines, and their suitability for deployment in developing countries for influenza pandemic preparedness Geneva, Switzerland: World Health Organization; 2006 " 20 Kandun, I N., H Wibisono, E R Sedyaningsih, Yusharmen, W Hadisoedarsuno, W Purba, H Santoso, C Septiawati, E Tresnaningsih, B Heriyanto, D Yuwono, S Harun, S Soeroso, S Giriputra, P J Blair, A Jeremijenko, H Kosasih, S D Putnam, G Samaan, M Silitonga, K H Chan, L L Poon, W Lim, A Klimov, S Lindstrom, Y Guan, R Donis, J Katz, N Cox, M Peiris, T M Uyeki (2006) "Three Indonesian clusters of H5N1 virus infection in 2005", N Engl J Med, 355(21): pp 218694 21 Kawaoka, Y., C W Naeve, R G Webster (1984) "Is virulence of H5N2 influenza viruses in chickens associated with loss of carbohydrate from the hemagglutinin?", Virology, 139(2): pp 303-16 22 Kawaoka, Y., R G Webster (1988) "Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells", Proc Natl Acad Sci U S A, 85(2): pp 324-8 74 23 Kistner, O., P N Barrett, W Mundt, M Reiter, S Schober-Bendixen, F Dorner (1998) "Development of a mammalian cell (Vero) derived candidate influenza virus vaccine", Vaccine, 16(9-10): pp 960-8 24 Kistner, O., M K Howard, M Spruth, W Wodal, P Bruhl, M Gerencer, B A Crowe, H Savidis-Dacho, I Livey, M Reiter, I Mayerhofer, C Tauer, L Grillberger, W Mundt, F G Falkner, P N Barrett (2007) "Cell culture (Vero) derived whole virus (H5N1) vaccine based on wild-type virus strain induces cross-protective immune responses", Vaccine, 25(32): pp 6028-36 25 Klenk, H D., W Garten (1994) "Host cell proteases controlling virus pathogenicity", Trends Microbiol, 2(2): pp 39-43 26 Knipe D.M., et al, Fields Virology, Volume 1, Lippincott William & Wilkins, London 2001 27 L., Rudenko (2013) " Live Attenuated Influenza Vaccine in Russia 2nd WHO meeting on influenza vaccines that induce broad spectrum and longlasting immune responses 6–7 December 2005 Geneva Available from: http://www.who.int/vaccine_research/diseases/influenza/Roudenko.pdf (accessed 12 February 2013)." 28 Lamb, R A (1989) "Genes and Proteins of the Influenza Viruses," The Influenza Viruses, Springer US p 1-87 29 Lamb, R A., C J Lai (1981) "Conservation of the influenza virus membrane protein (M1) amino acid sequence and an open reading frame of RNA segment encoding a second protein (M2) in H1N1 and H3N2 strains", Virology, 112(2): pp 746-51 30 Lancet (2013) "From SARS to H7N9: will history repeat itself?", Lancet, 381(9875): pp 1333 31 Le J., Manojkumar R., Pokorny B.A., Silverman J (2012) Preparation of high growth reassortants by “classical” reassortment method , Humana Press 75 32 Liu, M., J M Wood, T Ellis, S Krauss, P Seiler, C Johnson, E Hoffmann, J Humberd, D Hulse, Y Zhang, R G Webster, D R Perez (2003) "Preparation of a standardized, efficacious agricultural H5N3 vaccine by reverse genetics", Virology, 314(2): pp 580-90 33 Luytjes, W., M Krystal, M Enami, J D Parvin, P Palese (1989) "Amplification, expression, and packaging of foreign gene by influenza virus", Cell, 59(6): pp 1107-13 34 McKinsey, & Company (2013) "Preliminary findings for the technical studies under resolution WHA63.1, 10 December 2010 Available from: http://apps.who.int/gb/pip/pdf_files/OEWG2/PIP_OEWG_Preliminaryfindings-en.pdf (accessed 12 February 2013)." 35 Neumann, G., T Watanabe, H Ito, S Watanabe, H Goto, P Gao, M Hughes, D R Perez, R Donis, E Hoffmann, G Hobom, Y Kawaoka (1999) "Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs", Proc Natl Acad Sci U S A, 96(16): pp 9345-50 36 Neumann, G., A Zobel, G Hobom (1994) "RNA polymerase I-mediated expression of influenza viral RNA molecules", Virology, 202(1): pp 477-9 37 Nicolson, C., D Major, J M Wood, J S Robertson (2005) "Generation of influenza vaccine viruses on Vero cells by reverse genetics: an H5N1 candidate vaccine strain produced under a quality system", Vaccine, 23(22): pp 2943-52 38 Oner, A F., A Bay, S Arslan, H Akdeniz, H A Sahin, Y Cesur, S Epcacan, N Yilmaz, I Deger, B Kizilyildiz, H Karsen, M Ceyhan (2006) "Avian influenza A (H5N1) infection in eastern Turkey in 2006", N Engl J Med, 355(21): pp 2179-85 39 Palache, A (2011) "Seasonal influenza vaccine provision in 157 countries (2004-2009) and the potential influence of national public health policies", Vaccine, 29(51): pp 9459-66 76 40 Rodrigues, M., S Li, K Murata, D Rodriguez, J R Rodriguez, I Bacik, J R Bennink, J W Yewdell, A Garcia-Sastre, R S Nussenzweig, et al (1994) "Influenza and vaccinia viruses expressing malaria CD8+ T and B cell epitopes Comparison of their immunogenicity and capacity to induce protective immunity", J Immunol, 153(10): pp 4636-48 41 Skehel, J J., D C Wiley (2000) "Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin", Annu Rev Biochem, 69: pp 53169 42 Steinhauer, D A (1999) "Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus", Virology, 258(1): pp 1-20 43 Stieneke-Grober, A., M Vey, H Angliker, E Shaw, G Thomas, C Roberts, H D Klenk, W Garten (1992) "Influenza virus hemagglutinin with multibasic cleavage site is activated by furin, a subtilisin-like endoprotease", EMBO J, 11(7): pp 2407-14 44 Stoeckle, M Y., M W Shaw, P W Choppin (1987) "Segment-specific and common nucleotide sequences in the noncoding regions of influenza B virus genome RNAs", Proc Natl Acad Sci U S A, 84(9): pp 2703-7 45 Stöhr, Klaus (2013) Influenza vaccine production 520 46 Tian, G., S Zhang, Y Li, Z Bu, P Liu, J Zhou, C Li, J Shi, K Yu, H Chen (2005) "Protective efficacy in chickens, geese and ducks of an H5N1inactivated vaccine developed by reverse genetics", Virology, 341(1): pp 153-62 47 WHO, Requirements for influenza vaccine (live) 1998 48 WHO (2005) WHO guidance on development of influenza vaccine reference viruses by reverse genetics WHO/CDS/CSR/GIP/2005.6 49 WHO (2006) "WHO Collaborating Centres and Essential Laboratories 2006 Available from: http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/collaborating_centres/en/ (accessed 12 February 2013)." 77 50 WHO (2013) "Influenza (Seasonal) Fact sheet 211 Available from http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/ (accessed February 2013)." 51 WHO (2014) "Human infection with avian influenza A(H5N1) virus update http://www.who.int/csr/don/2014_01_09_h5n1/en/index.html (Accessed on January 13, 2014)." 52 WHO (2014) "WHO Risk Assessment Human infections with avian influenza A(H7N9) virus http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/RiskAssessment_H7 N9_21Jan14.pdf (Accessed on January 23, 2014)." 53 WHO (2015) "Avian influenza A (H5N1) in Egypt update, 21 March 2015 http://www.emro.who.int/surveillance-forecasting-response/surveillancenews/avian-influenza-a-h5n1-in-egypt-update-21-march-2015.html (Accessed on March 27, 2015)." 54 WHO (2015) "Cumulative number of confirmed human cases for avian influenza A(H5N1) reported to WHO, 2003-2015 Available at: http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/EN_GIP_20150126C umulativeNumberH5N1cases.pdf?ua=1" 55 WHO (2015) "Influenza at the human-animal interface - Summary and assessment as of March 2015 http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/Influenza_Summary_ IRA_HA_interface_3_March_2015.pdf?ua=1 (Accessed on March 27, 2015)." 56 WHO (2015) " Influenza at the human-animal interface http://www.who.int.scihub.org/influenza/human_animal_interface/HAI_Risk_Assessment/en/ (Accessed on March 27, 2015)." 78 57 WHO (2015) "Influenza Update N° 245 Available at: http://www.who.int/influenza/surveillance_monitoring/updates/2015_09_07_ surveillance_update_245.pdf" 58 WHO (2015).Influenza Update N° 246, Location, 59 WHO (2015) "WHO risk assessment of human infections with avian influenza A(H7N9) virus - 23 February 2015 http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/influenza_h7n9/Risk Assessment_H7N9_23Feb20115.pdf?ua=1 (Accessed on March 31, 2015)." 60 WHO (20013) "Avian influenza A (H10N8) http://www.wpro.who.int/china/mediacentre/factsheets/h10n8/en/index.html (Accessed on December 20, 2013)." 61 Wiley, D C., I A Wilson, J J Skehel (1981) "Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation", Nature, 289(5796): pp 373-8 62 Williams, M.S., J.M Wood (1993) A brief history of inactivated influenza virus vaccine, Elsevier, Amsterdam 63 Wilson, I A., J J Skehel, D C Wiley (1981) "Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at A resolution", Nature, 289(5796): pp 366-73 64 Winter, G., S Fields (1981) "The structure of the gene encoding the nucleoprotein of human influenza virus A/PR/8/34", Virology, 114(2): pp 423-8 65 Wood, J M., D Major, R W Newman, U Dunleavy, C Nicolson, J S Robertson, G C Schild (2002) "Preparation of vaccines against H5N1 influenza", Vaccine, 20 Suppl 2: pp S84-7 66 Yamashita, M., M Krystal, P Palese (1988) "Evidence that the matrix protein of influenza C virus is coded for by a spliced mRNA", J Virol, 62(9): pp 3348-55 79 80