Luận văn Thạc sĩ 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN O0O TRẦN THU TRANG NGHIÊN CỨU CÁC THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÂY CÔM (ELAEOCARPUS GRIFFITHI) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TSKH Phạm Văn Cường Hà Nội, Năm 2013 1 Luận văn Thạc sĩ 2013 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TSKH Phạm Văn Cường người đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành bản luận văn này Tôi cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ tại phòng Tổng hợp Hữu cơ -Viện Hóa sinh biển và ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển đã động viên và giúp đỡ tôi rất nhiều trong việc hoàn thành bản luận văn này Tôi xin gửi lời cảm ơn tới dự án Pháp – Việt, đặc biệt là Viện Hóa học các Hợp chất Tự nhiên tại Gif-sur-Yvette (Cộng hòa Pháp) đã đo mẫu và thử hoạt tính gây độc tế bào các cặn chiết và các chất phân lập được để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này Tôi xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và các thầy cô giáo Khoa Sinh học-Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên-ĐHQG Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và hoàn thành luận văn này Tôi xin chân thành cảm ơn đến gia đình và bạn bè luôn động viên và ở bên cạnh giúp đỡ tôi những lúc khó khăn trong cuộc sống để tôi có thể làm việc tốt và hoàn thành tốt luận văn này Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2013 Trần Thu Trang 2 Luận văn Thạc sĩ 2013 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN AMEM Advanced Minimum Essential Medium ATCC Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ CC Column Chromatography (Sắc ký cột) 13 Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy C-NMR (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon) d Dublet dd Dublet của dublet dt Dublet của triplet dq Dublet của quartet DMSO Dimethyl sulfoxyd DEPT Distortionless Enhancement By Polarization Transfer (Phổ DEPT) ED50 Liều tác dụng tối đa trên 50% đối tượng thử ESI-MS Electron Spray Impact Mas Spectroscopy (Phổ khối va chạm phun mù điện tử) HSQC Heteronuclear Spectroscopy Quantum Coherence (Phổ tương tác dị hạt nhân) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Phổ tương tác liên kết dị hạt nhân) 1 H-NMR Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) 1 H-1H-COSY 1 H-1H Correlated Spectroscopy (Phổ tương tác proton-proton) IR Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại) IC50 Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của cá thể nghiên cứu KB Tế bào ung thư biểu mô MCF-7 Tế bào ung thư vú m Multiplet MS Mass spectrometry 3 Luận văn Thạc sĩ 2013 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) NMR Thin Layer Chromatography (sắc ký lớp mỏng) TMS Tetramethylsilan Trypsin EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) t Triplet TLC Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) SKC Sắc ký cột S Singulet q Quartet J(Hz) Hằng số tương tác tính bằng Hz δ (ppm) Độ chuyển dịch hóa học tính bằng ppm 4 Luận văn Thạc sĩ 2013 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Cây Côm (Elaeocarpus griffithi) thuộc họ Côm (Elaeocarpaceae) 3 Hình 2 Một số hợp chất alkaloid từ loài Elaeocarpus grandis Hình 3 Một số hợp chất alkaloid từ loài Elaeocarpus fuscoides 5 Hình 4 Một số hợp chất phân lập từ loài E parvifolius và E mastersi 6 Hình 5: Một số hợp chất từ loài Elaeocarpus habbemensis 6 Hình 6: Chu kỳ tế bào 8 Hình 7: Các tác nhân alkylants 9 Hình 8: Những tác nhân chống lại quá trình trao đổi chất 10 Hình 9: Ức chế tổng hợp protein .11 Hình 10: Các chất đan xen chuỗi ADN 11 Hình11: Ức chế enzyme topoisonmerase I và II .12 Hình 12: Cấu trúc hóa học của hợp chất F1 13 Hình 13: Cấu trúc hóa học của chất F2 26 Hình 14: Cấu trúc hóa học của chất F3 27 Hình 15: Cấu trúc hóa học của chất F4 29 Hình 16: Khảo sát hoạt tính độc tế bào ung thư vú của chất F2 .30 Hình 17: Minh họa ảnh hưởng của chất F2 trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB 32 Hình 18: Minh họa ảnh hưởng của chất F2 trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 32 5 Luận văn Thạc sĩ 2013 DANH MỤC CÁC BẢNG 1 Bảng 3.1: Số liệu phổ H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) trong DMSO Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) trong DMSO Bảng 3.3: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) trong DMSO Bảng 3.4 Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) trong DMSO 6 của chất F1 của chất F2 của chất F3 của chất F4 Luận văn Thạc sĩ 2013 MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với công cuộc phát triển kinh tế thì việc chăm sóc sức khỏe ban đầu và bảo vệ sức khỏe cộng đồng trở nên cấp thiết đối với mọi quốc gia trên thế giới Do vậy, nhu cầu về sử dụng thuốc để phòng ngừa và chữa trị những căn bệnh nan y, đặc biệt là ung thư ngày càng cao Hiện nay, một trong những hướng chính để phòng ngừa và chữa trị bệnh ung thư là nghiên cứu tìm các hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên Theo đánh giá của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), 80% dân số trên toàn thế giới vẫn tin dùng các loại thảo dược cho việc chăm sóc sức khỏe ban đầu và khoảng hơn 60% các tác nhân hóa trị liệu dùng trong điều trị ung thư có nguồn gốc từ các hợp chất tự nhiên.[9,15,20] Nước ta có thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Theo các số liệu thống kê của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Thế giới (IUCN), thì thảm thực vật Việt Nam có trên 12.000 loài, trong đó có khoảng 3.200 loài được sử dụng trong dân gian làm thuốc mới có hoạt tính cao, đã được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị bệnh [34] Ví dụ nổi bật là việc phát hiện ra hai loại hoạt chất tự nhiên Vinblastine và Vincristine từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don), họ Trúc đào (Apocynaceae) [19] và Taxol từ cây thông đỏ (Taxus brevifolia), họ Thông (Pinaceae) [31], cùng với các dẫn xuất bán tổng hợp như Taxotere từ 10-deacetyl bacatin III hay gần đây hoạt chất Vinflunine từ Vinorelbine cũng đã chính thức được sử dụng để điều trị cho bệnh nhân ung thư Tuy nhiên, còn phần lớn các cây thuốc dân gian vẫn chưa được nghiên cứu một cách hệ thống Việc nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học không những giúp sử dụng các cây thuốc một cách hiệu quả mà trên cơ sở đó còn phân lập được các hoạt chất để từ đó tiến hành tổng hợp hoặc bán tổng hợp ra các hoạt chất mới có hoạt tính cao hơn và ít tác dụng phụ hơn trong điều trị Mô hình nghiên cứu “Sinh học dẫn đường” nhằm tìm kiếm những chất có hoạt tính sinh học là mô hình nghiên cứu tiên tiến, có định hướng cao, nhằm làm sáng tỏ bản chất khoa học của nguồn tài nguyên thiên nhiên, góp phần đưa nhanh các kết quả nghiên cứu vào áp dụng thực tiễn Việc nghiên cứu kế thừa và phát huy vốn quí của dân tộc đặt ra trong lúc này vừa là vận hội và cũng là thách thức đối với những nhà 7 Luận văn Thạc sĩ 2013 khoa học nói chung và cho những nhà nghiên cứu phát triển công nghiệp được nói riêng Với mong muốn đóng góp vào việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các thảo dược dân tộc, chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của cây Côm (Elaeocarpus griffithi) với nội dung nghiên cứu như sau: Nội dung - Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất trong dịch chiết etylaxetat - của cây Côm (Elaeocarpus griffithi), thuộc họ Côm (Elaeocarpaceae) Khảo sát hoạt tính độc tế bào của dịch chiết etylaxetat tổng cũng như các chất phân lập được CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây Côm 1.1.1 Mô tả về thực vật 8 Luận văn Thạc sĩ 2013 Côm (Elaeocarpus griffithii) là loại cây đại mộc cao khoảng 10-25m, thân thẳng, gốc có bạnh bè thấp, cành non màu nâu nhạt, nhánh non có lông mịn Lá có phiến mỏng hình mác dài 7-10 cm, rộng 2,5-3,5 cm, đầu có mũi nhọn, mép lượn sóng, có răng cưa mềm, hoa mọc thành từng chùm ở nách hay đầu cành, đài hoa có năm lá đài hình tam giác, nhị nhiều Quả hình thận dài 1,5 cm, đường kính 0,8 – 1cm, khi chín có màu đen Gỗ cây màu trắng vàng có thể dựng làm nhà, đóng đồ mộc thông thường xẻ ván Nhân dân nhiều nơi thường chặt hạ cây này để mục trong rừng để gây trồng nấm hương [1,2] Hình 1: Cây Côm (Elaeocarpus griffithi) thuộc họ Côm (Elaeocarpaceae) 1.1.2 Phân bố sinh thái Côm (Elaeocarpus griffithii) là loại cây nhiệt đới và cận nhiệt đới, với một ít là cây ôn đới Phần lớn các loài cây thường xanh Cây mọc rải rác trong rừng thứ sinh ở độ cao từ 400 m trở xuống Cây ưa sáng, mọc nhanh, thích hợp với đất sét pha Tái sinh hạt tốt, ra hoa vào tháng 8-9, có quả chín tháng 12 đến tháng 1 năm sau [1,2] 9 Luận văn Thạc sĩ 2013 Chúng được tìm thấy ở Madagascar, Đông Nam Á, Malaysia, miền đông Australia, New Zealand, Tây Ấn và Chile Họ này chứa khoảng 605 loài cây thân gỗ và cây bụi trong 12 chi Ở Việt Nam có 38 loài phân bố từ Tuyên Quang đến Phú Quốc Các loài trong họ Elaeocarpaceae phần lớn loài cây này có hoa lưỡng tính hoặc khác gốc và chúng mọc thành cụm [1,2] 1.2 Những nghiên cứu trước đây về cây Côm (Elaeocarpus griffithii) Cho đến nay, chưa có công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học nào được công bố về loài thực vật này Các nghiên cứu về các loài khác thuộc chi này cho thấy thành phần hóa học của các hợp chất của chi Elaeocarpus rất đa dạng Nổi bật về thành phần hóa học của các loài trong chi này là các hợp chất alkaloid Các chất đã được phân lập từ loài Elaeocarpus grandis là rudrakine (1), grandisines A (2), Isoelaeocarpiline (3), grandisines C, D, E, F, and G (4-8) cho thấy khả năng liên kết mạnh với cơ quan thụ cảm δ-opioid của người với giá trị IC50 nằm trong khoảng 9,9 - 75,4 µg/ml Các nhà khoa học đã chứng minh rằng cơ quan thụ cảm δ-opioid có liên quan chặt chẽ tới các triệu chứng đau kinh niên [6,23] Hình 2 Một số hợp chất alkaloid từ loài Elaeocarpus grandis 10 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 27: Phổ 1H-NMR của chất F3 75 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 28: Phổ 1Hex-NMR của chất F3 76 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 29: Phổ 13C-NMR của chất F3 77 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 30: Phổ 13Cex-NMR của chất F3 78 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 31: Phổ DEPT của chất F3 79 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 32: Phổ MS của chất F3 80 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 33: Phổ 1H- NMR của chất F4 81 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 34: Phổ 1Hex- NMR của chất F4 82 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 35: Phổ 13C-NMR của chất F4 83 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 36: Phổ 13Cex-NMR của chất F4 84 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 37: Phổ DEPT của chất F4 85 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 38 : Phổ MS của chất F4 86 Luận văn Thạc sĩ 2013 87 Luận văn Thạc sĩ 2013 88 Luận văn Thạc sĩ 2013 89