Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (aquilaria sp ) tại hà tĩnh

72 649 1
Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng và định danh loài ở tập đoàn cây dó bầu (aquilaria sp ) tại hà tĩnh

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin chân thành cảm ơn PGS TS Chu Hoàng Hà, Trưởng Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn giúp đỡ Tôi xin cảm ơn GS TS Lê Trần Bình, TS Phạm Bích Ngọc, TS Vũ Huyền Trang, NCS Đỗ Tiến Phát tập thể Phòng Công nghệ tế bào thực vật giúp đỡ suốt trình thực tập Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy, cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình học tập Cuối xin bày tỏ lòng cảm ơn tới gia đình bạn bè luôn động viên tinh thần để hoàn thành luận văn Hà Nội, tháng 01 năm 2012 Học viên Hoàng Đăng Hiếu i Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan dó bầu 1.1.1 Đặc điểm phân loại vị trí phân bố dó bầu 1.1.2 Đặc điểm sinh trưởng dó bầu 1.1.3 Giá trị kinh tế sinh thái dó bầu .5 1.1.4 Thực trạng trồng khai thác dó bầu nước giới 1.1.5 Các nhân tố ảnh hưởng tới khả tạo trầm nhân tạo 1.2 Một số phương pháp sử dụng việc định danh loài xác định quan hệ di truyền 10 1.3 DNA barcode - quan điểm phân loại 12 1.3.1 Giới thiệu DNA barcode 12 1.3.2 Các đặc điểm trình tự barcode .13 1.4 Một số locus sử dụng phương pháp DNA barcode thực vật 14 1.4.1 Trình tự gen nhân 14 1.4.2 Vùng gen mã hóa ribosome 15 1.4.3 Trình tự gen luc lạp 15 Bảng 1.1 Thông tin số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp .16 1.4.4 Trình tự gen rbcL 17 1.4.5 Trình tự gen matK 17 1.4.6 Trình tự gen rpoB rpoC1 17 1.4.7 Trình tự gen ycf5 18 1.4.8 Trình tự hai gen trnH-psbA 18 1.4.9 Trình tự hai gen trnL(UAA)-trnF(GAA) .19 1.5 Tình hình nghiên cứu DNA barcode thực vật 19 1.6 Một số kết nghiên cứu dó bầu Việt Nam giới 21 ii Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22 2.1.Vật liệu 22 2.1.1 Thực vật 22 Bảng 2.1 Thông tin mẫu dó bầu dùng nghiên cứu .22 2.1.2 Chủng vi khuẩn .23 2.1.3 Hóa chất 23 2.1.4 Máy móc thiết bị .23 2.1.5 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 2.2.Trình tự cặp mồi nhân gen barcode .24 2.2 Phương pháp nghiên cứu .24 2.2.1 Các bước nghiên cứu 24 2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu 24 Bảng 2.3 Thành phần dung dịch đệm rửa .25 Bảng 2.4 Thành phần dung dịch đệm tách 25 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 2.6 Chu kỳ phản ứng PCR .26 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng ligase 28 Bảng 2.8 Thành phần môi trường chọn lọc tế bào vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp 29 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc .30 Bảng 2.10 Chu kỳ phản ứng PCR- clony 30 Bảng 2.11 Thành phần hóa chất tách plasmid 30 Bảng 2.12 Thành phần hóa chất dùng phản ứng cắt enzyme 31 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .33 3.1 Kết tách chiết tinh DNA tổng số .33 3.2 Tìm nhiệt độ gắn mồi đăc hiệu phản ứng PCR 34 Bảng 3.1 Nhiệt độ bắt mồi kích thước gen cặp mồi nghiên cứu 34 3.3 Kết nhân gen với cặp mồi nghiên cứu 36 3.3.1 Kết nhân gen rbcL 36 3.3.2 Kết nhân gen rpoB 36 iii Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu 3.3.3 Kế nhân gen psbA-trnH .37 3.3.4 Kết nhân gen ITS 37 3.4 Kết tách dòng gen 38 3.4.1 Kết tinh sản phẩm PCR (thôi gel) 38 3.4.2 Kết chuyển gen vào vector tách dòng .39 3.4.3 Kêt biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E coli 39 3.4.4 Kết chọn lọc dòng tế bào mang gen tái tổ hợp 40 3.4.5 Kết tách chiết plasmid tái tổ hợp .41 3.4.6 Kết cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp 42 3.5 Xác định phân tích trình tự nucleotide đoạn DNA thị 43 3.5.1 Kết xác định phân tích trình tự gen trn-psbA .44 Bảng 3.2 So sánh trình tự vùng trnH-psbA intergenic lục lạp .45 3.5.2 Kết xác định phân tích trình tự gen rpoB 47 Bảng 3.3 So sánh trình tự vùng gen lục lạp rpoB 48 3.5.3 Kết xác định phân tích trình tự vùng gen lục lạp rbcL 50 Bảng 3.4 So sánh trình tự vùng gen lục lạp rbcL 52 Bảng 3.5 Vị trí sai khác dùng để phân loại đoạn gen vùng rbcL 53 3.5.4 Kết xác định phân tích trình tự gen ITS .54 Bảng 3.6 So sánh trình tự vùng gen ribosom ITS 56 Bảng 3.7 Các vị trí sai khác dùng để phân loại đoạn gen vùng ITS 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 iv Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Thông tin số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp 16 Bảng 2.1 Thông tin mẫu dó bầu dùng nghiên cứu .22 Bảng 2.2.Trình tự cặp mồi nhân gen barcode .24 Bảng 2.3 Thành phần dung dịch đệm rửa .25 Bảng 2.4 Thành phần dung dịch đệm tách 25 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 2.6 Chu kỳ phản ứng PCR .26 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng ligase 28 Bảng 2.8 Thành phần môi trường chọn lọc tế bào vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp 29 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc .30 Bảng 2.10 Chu kỳ phản ứng PCR- clony 30 Bảng 2.11 Thành phần hóa chất tách plasmid 30 Bảng 2.12 Thành phần hóa chất dùng phản ứng cắt enzyme 31 Bảng 3.1 Nhiệt độ bắt mồi kích thước gen cặp mồi nghiên cứu 34 Bảng 3.2 So sánh trình tự vùng trnH-psbA intergenic lục lạp .45 Bảng 3.3 So sánh trình tự vùng gen lục lạp rpoB 48 Bảng 3.4 So sánh trình tự vùng gen lục lạp rbcL 52 Bảng 3.5 Vị trí sai khác dùng để phân loại đoạn gen vùng rbcL 53 Bảng 3.6 So sánh trình tự vùng gen ribosom ITS 56 Bảng 3.7 Các vị trí sai khác dùng để phân loại đoạn gen vùng ITS 57 v Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Lá dó bầu Hình 1.2 Hoa dó bầu .5 Hình 2.1 Sơ đồ vector pBT 27 Hình 3.1 Kết điện di DNA tổng số số mẫu dó bầu nghiên cứu 33 Hình 3.2 Kết chạy PCR - gradient thị rpoB ngưỡng nhiệt độ từ 49oC tới 58oC 35 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR gen rbcLcủa mẫu dó bầu nghiên cứu36 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR gen rpoB mẫu dó bầu nghiên cứu .37 Hình 3.5.Kết điện di sản phẩm PCR gen psbA-trnH mẫu dó bầu nghiên cứu .37 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR gen ITS mẫu dó bầu nghiên cứu 38 Hình 3.7 Kết tinh sản phẩm PCR gen rpoB .38 Hình 3.8 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 40 Hình 3.9 Kết điện di sản phẩm PCR - clony khuẩn lạc mồi rbcL 41 Hình 3.10 Kết điện di plasmid tách chiết 42 Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm cắt enzyme BamHI mồi rbcL 43 Hình 3.12 Cây phân loại kết mồi ITS .58 vi Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu BẢNG CHỮ VIẾT TẮT bp CBOL CTAB DNA dNTP E coli EDTA IPTG ITS-rDNA Kb LB PCR RNA rDNA RAPD RFLP Rnase SDS Sol STS TAE Taq polymerase TE X-gal Base pair Consortium for the Barcode of Life Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleotide triphosphate Escherichia coli Ethylenediaminetetraacetic acid Isopropylthio-beta-D-galactoside Internal Transcribed Spacer-rDNA Kilobase Luria Bertani Polymerase Chain Reaction Ribonucleic acid Ribosome deoxyribonucleic acid Random Amplyfied Polymorphism DNA Restriction Fragment Length Polymorphism Ribonuclease Sodium dodecyl sulphate Solution Sequence-Tagged Site Tris - Acetic acid - EDTA Thermus aquaticus polymerase Tris - Ethylenediaminetetraacetic acid X - - brom - - chloro3 - indolyl - β - D - galactosidase vii Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu MỞ ĐẦU Cây dó bầu (Aquilaria sp) loài thực vật đặc hữu nước ta, phân bố rải rác từ Bắc tới Nam, tập trung nhiều tỉnh miền Trung đặc biệt Hà Tĩnh Quảng Nam Cây dó bầu mang lại giá trị kinh tế lớn với mục đích chủ yếu khai thác trầm hương, mặt hàng có giá trị kinh tế cao sử dụng công nghiệp mỹ phẩm, dược liệu, tôn giáo, chế tác đồ thủ công mỹ nghệ Ở nước ta phát loài dó bầu phân bố rải rác rừng rậm nhiệt đới thường xanh, ẩm nguyên sinh: A crassna (Dó bầu, Dó tía, Dó trắng), A baillonii (Dó Gạch), A rugosa (Dó Quả Nhăn), A malaccensis (Dó Mã Lai), A sinensis (Dó Trung Quốc), A banaensis (Dó Bà Nà) Trong A crassna loài trồng phổ biến có khả tạo loại trầm Kỳ tốt giới Tuy nhiên, loài dó bầu Việt Nam bị lai tạp nhiều, công tác lựa chọn giống đưa vào trồng dựa chủ yếu vào quan sát hình thái, theo kinh nghiệm cá nhân, dẫn đến suất chất lượng trầm thu không ổn định Do vậy, việc chọn lọc giống ban đầu để đưa vào triển khai quan trọng nhiệm vụ cấp thiết công tác bảo tồn, khai thác phát triển nguồn gen quý Hiện phương pháp DNA barcode công cụ phục vụ định danh loài xác, nhanh chóng, tự động hóa cách sử dụng vùng DNA chuẩn hay gọi thị DNA hay mã vạch DNA (DNA barcode) Việc xác định loài DNA thị có hiệu cao việc phân biệt loài thực vật [16] có dó bầu Việt Nam [18] quan sát hình thái, sinh trưởng phát triển chưa đủ sở để định danh phân biệt loài Xuất phát từ yêu cầu đặt định thực đề tài “Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích đa dạng định danh loài tập đoàn dó bầu (Aquilaria sp.) Hà Tĩnh.” Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan dó bầu 1.1.1 Đặc điểm phân loại vị trí phân bố dó bầu Cây dó bầu (Aquilaria sp.) loài thực vật có giá trị kinh tế cao Ở Việt Nam, dó bầu phân bố rải rác từ Bắc tới Nam, có nhiều tỉnh miền Trung Cây dó bầu có nhiều tên gọi tùy theo địa phương như: Trầm Hương, Dó Trầm, Dó Bầu Hương, Tóc [43] Cây dó bầu thuộc chi trầm Aquilaria, họ Thymeleaceae, Thymelaeales, lớp gỗ lớn Magnoliopsida, ngành Mộc Lan Magnoliophyta [41], [42] Hình 1.1 Lá dó bầu Chi Trầm Aquilaria gồm 24 loài khác nhau, nhiên có 15 loài có khả cho trầm hương gồm: Aquilaria crassna; A baillonii; A sinensis A chinesis; A borneensis; A Malaccensi; A gollocha; A hirta; A rostrata; A beccariana; A cummingiana; A filaria; A khasiana; A microcarpa; A grandiflora; A bancana; A Rugosa Trong loài A rugosa TS Lê Công Kiệt TS Paul Kessler người Hà Lan phát năm 2005 [18] Trên giới, chi trầm phân bố chủ yếu khu vực nhiệt đới từ Ấn Độ đến Đông Nam Á miền Nam Trung Quốc Ở nước ta, dó bầu phân bố rải rác rừng rậm nhiệt đới thường xanh, rừng ẩm nguyên sinh thuộc tỉnh Tuyên Quang, Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, đặc biệt từ Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quãng Ngãi, Bình Định, Ninh Thuận, Bình Thuận đến Tây Nguyên, An Giang, Kiên Giang đảo Phú Quốc [42] Trong số loài có khả tạo trầm Aquilaria crassna loài tiếng có khả tạo loại trầm kỳ tốt giới [5] 1.1.2 Đặc điểm sinh trưởng dó bầu Dó bầu loại gỗ thường xanh, cao 20 - 30 m, đường kính thân đạt 60 - 80 cm, thân thường thẳng, có rãnh dạng lòng máng, vỏ nhẵn, màu nâu xám, thịt vỏ màu trắng có nhiều chất xơ (cellulose), nứt dọc lăn tăn, dễ bóc tước ngược từ gốc lên, cành mảnh, cong queo, màu nâu nhạt, có lông nhẵn, tán thưa Lá đơn, mọc cách (so le), cuống dài - mm, phiến hình trứng, bầu dục thuôn đến mác thuôn, kích thước - 15 x 2,5 - cm, mặt màu lục bóng, mặt nhạt có lông mịn, gốc thon nhọn dần hay tù; chóp nhọn, thuôn nhọn, tận có mũi, gân bên 15 - 18 đôi, thay đổi thất thường, rõ mặt Cụm hoa hình tán chùm tán, mọc nách đầu cành, cuống cụm hoa mảnh, dài - cm Hoa nhỏ, mẫu 5, đài hợp phần dưới, hình chuông, màu vàng lục, trắng nhạt vàng xám, phía có lông thưa; mặt gần nhẵn, có 10 đường gân rõ, tồn quả, thùy dài hình trứng thuôn, dài 12 - 15 mm Phần phụ dạng cánh hoa, gốc bầu có tuyến mật Quả nang gần hình trứng ngược hình lê, dài cm, đường kính 2,5 - cm, có lông mềm, ngắn, có mang dài tồn tại, khô nứt làm mảnh, thường có hạt Mùa hoa vào tháng 8, chín vào tháng - 10 [3], [43] Dó bầu sinh trưởng rải rác rừng thường xanh ẩm nhiệt đới, nguyên sinh thứ sinh, sườn núi đất độ cao 50 - 1.000 m có lên tới 1.200 m so với mặt biển Ở nước ta, dó bầu thường phân bố rải rác sườn núi có độ dốc nhỏ, thoát nước Trong quần xã dó bầu thường gặp gỗ lớn: Táu, Huỳnh , Gụ mật … Đôi gặp dó bầu mọc rừng thứ sinh loài Thánh thất, Mò lưng bạc, Bưởi bung, Mít nài Ràng ràng Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu 51 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu Bảng 3.4 So sánh trình tự vùng gen lục lạp rbcL Đoạn gen phân tích có kích thước 734 bp phù hợp với kích thước ban đầu, kết phân tích trình tự thấy xuất vị trí sai khác 18 mẫu dó bầu nghiên cứu đặc biệt vị trí 43 có thay đổi nucleotit A G với mẫu Dó bầu nghiên cứu AL2, AL6, AL8, M1, Qx, PQ64 so với 12 loài dó bầu lại Đây hai nhóm có xuất xứ cách xa mặt địa lý, mẫu AL2, AL6, AL8, M1, Qx, PQ64 có xuất xứ từ Lào Phú Quốc, mẫu lại có xuất xứ từ Hà Tĩnh Đây coi dấu hiệu để bước đầu phân biệt 18 cá thể dó bầu mà nghiên cứu dù hệ số tương đồng 18 mẫu cao ( 99,0 - 100% ) 52 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu Bảng 3.5 Vị trí sai khác dùng để phân loại đoạn gen vùng rbcL Vị trí sai khác STT Tên mẫu AL 02 G AL 06 G AL 08 G G1 A T1 A T2 A T3 A T4 A T6 A 10 T7 A 11 T8 A 12 T9 A 13 T 10 A 14 T 11 A 15 T 14 A 16 PQ64 G 17 Qx G 18 M1 G 43 53 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu 3.5.4 Kết xác định phân tích trình tự gen ITS 54 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu 55 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu Bảng 3.6 So sánh trình tự vùng gen ribosom ITS 56 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu Kết phân tích trình tự cho thấy gen ITS có kích thước 655 bp, hệ số tương đồng di truyền mẫu cao ( 91,1 - 100%) nhiên trình tự xác định xuất nhiều sai khác có giá trị sử dụng để phân loại đặc biệt vị trí 196, 455, 536, 596 611, 612 Một số sai khác liệt kê bảng 3.3 Bảng 3.7 Các vị trí sai khác dùng để phân loại đoạn gen vùng ITS STT Tên mẫu Vị trí dùng để phân loại 113 131 196 217 239 455 536 596 616 617 AL 02 C T T C C G A A G T AL 06 C T T C C G A A G T AL 08 C T T C C G A A G T G1 C T T C C G A A G T T1 T T C T T C G G A C T2 C T T C C G G G A C T3 T T C T T C G G A C T4 T C C T T C G G A C T6 C T T C C G A A G T 10 T7 C T T C C G A A G T 11 T8 C T T C C G A A G T 12 T9 C C T C C C A A G T 13 T 10 C T T C C G A A G T 14 T 11 C T T C C G A A G T 15 T 14 T C C T T C G G A C 16 PQ64 C T T C C G A A G T 17 Qx C T T C C G A A G T 18 M1 C T T C C G A A G T Với sai khác vị trí bổ xung thêm sở để xác định phân loại 18 mẫu dó bầu nghiên cứu 57 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu 82 51 40 100 51 T7 QX A crassna AY920326 M1 Al8 A crassna AY920327 25 T11 T8 A sinensis FJ980392 38 A sinensis EF645836 G1 PQ64 47 Al6 Al2 83 A sinensis GQ891956 94 A sinensis EF645834 A sinensis EF645833 T6 64 86 T10 T9 T2 A yunnanensis EF645835 A rugosa AY920328 99 99 A rugosa AY920330 T1 T4 T3 T14 0.005 Hình 3.12 Cây phân loại kết mồi ITS Nhìn phân loại ta nhận thấy 18 mẫu dó bầu nghiên cứu chia thành nhóm lớn, với số bootstrap 80,5 Nhóm thứ nhât bao gồm mẫu AL2, AL6, AL8, G1, Qx, PQ64, M1, T6, T7, T8, T9, T10, T11 với A.crassna A sinensis, nhóm thứ hai bao gồm mẫu lại Các mẫu T1, T2, T3, T4, T14 phân thành nhóm phân loại riêng với so với loài A.crassna, A.sinensis, A.rugosa, A.yunasensis với số bootstrap 99,9%, kết luận mẫu không thuộc loài Ở Việt Nam loài có loài Dó Bà Nà (A.banacensis) Dó Mã Lai (A malacensis), nhiên trình tự hai loại chưa nghiên cứu Nhiều khả mẫu hai loài cần sử dụng thêm thị khác mồi barcode khác để có kết luận xác Trình tự đoạn ITS mẫu T6, T7, T8, T9, T10, T11, mẫu M1, QX, PQ64, G1 thu thập Phú Quốc mẫu thu thập Lào khác biệt tin cậy (25-47%) so với trình tự loài A crassna A sinensis Từ kết phân tích nhận thấy mối tương quan di truyền 18 mẫu dó bầu nghiên cứu tương đối cao, Chỉ số tương đồng di truyền 58 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu khoảng (91,1-100%) Các mẫu dó bầu có mức độ đa dạng di truyền thấp, tính bảo thủ cao điều chứng minh rõ ràng tiến hành nghiên cứu số thị hệ gen lục lạp 59 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Đã tách chiết tinh DNA tổng số 18 mẫu dó bầu có loài Lào, mẫu thu Phú Quốc 11 mẫu thu Hà Tĩnh - Đã nhân thành công đoạn gen trnH-psbA, rbcL, rpoB, ITS phương pháp PCR từ DNA tổng số 18 mẫu dó bầu - Đã xác định trình tự nucleotide đoạn gen trnH-psbA, rbcL, rpoB, trnL 18 mẫu dó bầu - Xuất sai khác gen nhiên gen trnH-psbA rpoB khó sử dụng để phân loại sai khác trình nhân - Với rbcL gen ITS tìm sai khác có tính hệ thống có giá trị việc sử dụng để phân loại Kiến nghị - Tiếp tục sử dụng phương pháp DNA bacode phân loại xác định loài Việt Nam - Sử dụng gen rbcL ITS vào việc xác định loài dó bầu Việt Nam đồng thời tiến hành nghiên cứu với mồi barcode khác để tìm dấu hiệu xác định loài khác nhằm phân loại cách xác cụ thể 60 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt `1 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2002), Báo cáo tổng kết đề tài: “Nghiên cứu xác định phương pháp tạo trầm tác nhân vi sinh dó bầu Aquilaria crassna”, Nha Trang Hoàng Cảnh (2006), Trầm hương loại tạo trầm hương, lợi ích, thách thức triển vọng Hội trầm hương Việt Nam Danh lục loài thực vật Việt Nam, tập II, Viện sinh thái tài nguyên sinh vật, Trung tâm nghiên cứu tài nguyên môi trường, NXB Nông nghiệp Bùi Công Khánh (2007), Bước đầu tìm hiểu chất tạo trầm nhân tạo dó bầu Aquilaria crassnatại Việt Nam, Nha Trang Thái Thành Lượm (2000), “Bảo vệ nguồn gen khai thác kết qủa tạo trầm nhân tạo trầm hương”, Tạp chí khoa học phổ thông - Liên hiệp hội khoa học kỹ thuật TP HCM, số 518 Đào Sỹ Sành, Nguyễn Huy Sơn, Cao Văn, “Báo cáo kết ánh giá sơ tiềm sản xuất bột giấy dó bầu”, Trung tâm nghiên cứu Lâm đặc sản, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Viện Công nghiệp giấy Cenlulose Phạm Hồng Sơn (2006), Giáo trình kỹ thuật sinh học phân tử , Nhà xuất Đại học Huế, Huế Lê Duy Thành, Tạ Toàn, Đỗ Lê Thăng, Đinh Đoàn Long (2005), Di truyền học, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Tài liệu tiếng Anh Anton L (2007), Investigation of seed longevity and viability and cutting propagation for Aquilaria crassna, School of Marine and Tropical Biology James Cook University, Cairns 10 Aron J F., Kevin S B., Prasad R K., Sean W G., Steven G N., Brian C H., 61 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu Diana M P., Mehrdad Hajibabaei, Spencer C H B (2008), “Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well” PLoS ONE, 3(7), pp 2802 11 Barden A., Awang A.N., Mulliken T., Song M (2000),“Heart of the matter: agarwood use and trade and CITES implementation for Aquilaria malaccensis” 12 Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W (2003), “Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms”, J Evol Biol, (6), pp 558-576 13 Chakrabarty K., Kumar A., Menon V (1994) “Trade in Agarwood TRAFFICIndia Publications, New Delhi”, published by Avenash Dutta 14 Chase M W., Nicolas S., Mike W., James M D., Rao P K., Nadia H., and Vincent S (2005), “Land plants and DNA barcodes: short-term and longterm goals”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462), pp 1889-1895 15 CITES (2004), “Thirteenth Meeting of the Conference of the Parties Amendments to Appendices I and II of CITES” Bangkok, Thailand, 3-14 October 2004 unpublished 16 Gonzalez M A., Baraloto C., Engel J., Mori S A., Pe´tronelli P (2009), “Identification of Amazonian trees with DNA barcodes”, PLoS ONE 4(10), pp 7483 17 Harvey M., Botha F.C., (1996), “Use of PCR-based methodologies for the determination of DNA diversity between Saccharum varieties”, Euphytica, (89), pp 257-265 18 Kiet L., Kessler PJA and Eurlings M (2005), “A new species of Aquilaria (Thymelaceaceae) from Vietnam”, Blumea, (50), pp 135-141 19 Kress W J., Erickson D L (2008), “DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp 2761-2762 20 Michiho I., Ken I O., Toru Y., Gisho H., Fumiyuki K., Yasuo S (2005) ,“Induction of sesquiterpenoid production by methyl jasmonate in 62 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu Aquilaria sinensis cell suspension culture”, Journal of Essential Oil Research, 17(2), pp 175-180 21 Nurita T M., Dewi R., Anidah (2009), “ Genetic variations among aquilaria species and gyrinops vetseegii using amplified fragment length polymorphism markers” Biotropia, Vol 16 (No.2), pp 88 - 95 22 Ole S and Gitte P (2009), “How many loci does it take to DNA barcode a crocus?”, PLoS ONE, 4(2), pp 4598 23 Qi S H., He M L., Lin D L., Zhang C H., Hu L J., and Zhang H Z (2005).” Production of 2-(2-phenylethyl) chromones in cell suspension cultures of Aquilaria sinensis” Biomedical and Life Science , 83(2), pp.217-221 24 Roman B., Alfaro C., Torres A M., Moreno M T., Satovic Z., Pujadas A., Rubiales D (2003) , “Genetic relationships among Orabache species as revealed by RAPD analysis”, Annals of Botany, (91), pp 637-642 25 Savolainen V., and Chase M W (2003), “A decade of progress in plant molecular phylogenetics”, Trends Genet, (19), pp 717-724 26 Shaw J., Lickey E.B., Schilling E E., Small R.L (2007),” Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms”, The tortoise and the hare III Amer J Bot, (94), pp 275-288 27 Shiou Y L., Jean W., Rozi M (2011), “Genetic variation and molecular authentication of slected Aquilaria species from natural population in Malaysia using RAPD and SCAR markers”, Asian journal of Plant Sciences, 10(3), pp 204 - 210 28 Storchova H., M S Olson (2007), “The architecture of the chloroplast psbAtrnH non coding region in angiosperms” Plant systematic and evolution Biomedical and life sciences, Vol 268, No 1-4, pp 235-256 29 Taberlet P., Eric C., François P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., and Eske W (2007),” Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 63 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu 35(3), pp14 30 Taberlet P., Gielly L., Pautou G., Bouvet J (1991), “Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA”, Plant Molecular Biology (17), pp 1105-1109 31 TRP Agarwood Projectinformationand conference Website- http://wwwtherainforestproject.net 2007 32 Van den Berg C., Higgins W E., Dressler R L., Whitten W M., Soto Arenas M A., Culham A., Chase M W (2000), “A phylogenetic analysis of Laeliinae (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed spacers (ITS) of ribosomal DNA”, Lindleyana (15), pp.96114 33 Valentini A., Miquel C., Nawaz M A., Bellemain E V A., Coissac E., (2009), “New perspectives in diet analysis based on DNA barcoding and parallel pyrosequencing: the trnL approach”, Molecular Ecology Resources (9), pp 51-60 34 Valentini A, Miquel C, Taberlet P (2010) “DNA barcoding for honeybiodiversity”, Diversity 2, pp 610-617 35 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources (9), pp.1086-1091 36 Vijayan K and Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, vol 99, pp 1530 - 1540 37 Wang W., Wu Y., Yan Y., Ermakova M., Kerstetter R (2010) “DNA barcoding of the Lemnaceae, a family of aquatic monocots”, BMC Plant Biology (10), pp.205 38 Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S D (2006), “Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of singlecopy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: A test case in the euasterid plant clade”, Genetics (174), 64 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu pp 1407-1420 39 Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J (2010), “Use of ITS2 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals”, PLoS ONE (5), pp.13102 40 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L and Hui Y (18 December, 2010) “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research Vol 4(24), pp 2706-2709 Tài liệu Internet 41 http://nonglamdong.com/dobau.htm 42 http://www.ioop.org.vn/vn/NCTK/Thanh-Tuu-Cua-Vien/Ban-Tin-Khoa-HocCong-Nghe/Cay-Do-Bau/ 43 http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/ky-thuat-trong-cay-do-bau-tao-tram huong 44 http://www.tramhuongvietnam.com 45 http://www.barcoding.si.eu) 65 [...]... Hà Tĩnh 6 T2 Aquiaria sp Hã Tĩnh 7 T3 Aquiaria sp Hà Tĩnh 8 T4 Aquiaria sp Hà Tĩnh 9 T6 Aquiaria sp Hà Tĩnh 10 T7 Aquiaria sp Hà Tĩnh 11 T8 Aquiaria sp Hà Tình 12 T9 Aquiaria sp Hà Tĩnh 13 T 10 Aquiaria sp Hà Tĩnh 14 T 11 Aquiaria sp Hà Tĩnh 15 T 14 Aquiaria sp Hà Tĩnh 16 PQ64 Aquiaria sp Phú Quốc 17 Qx Aquiaria sp Phú Quốc 18 M1 Aquiaria sp Phú quốc 22 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu 2.1.2... được sử dụng vào năm 1993 (Arnon, 199 3), trong một bài báo mà không nhận được sự chú ý nhiều từ cộng đồng khoa học, và gần đây thuật ngữ này được sử dụng lại trong nhiều nghiên cứu Về cơ bản, kỹ thuật này dựa vào việc sử dụng một khu vực DNA (400-800 bp) như là một tiêu chuẩn để nhận dạng các loài một cách nhanh chóng và chính xác Kỹ thuật DNA mã vạch giúp các nhà phân loại học trong công tác phân. .. dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại Các phương pháp phân loại học phân tử và xác định loài là hướng nghiên cứu được phát triển mạnh trên thế giới hiện nay, được xây dựng dựa trên việc nhận 10 Luận văn thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu biết thành phần và cấu trúc của các gen đặc hữu của các taxon sinh vật Hiện nay, các kỹ thuật dựa trên phân tích DNA là phương pháp có hiệu quả cao trong việc định. .. giá đa dạng sinh học của các khu vực này nhằm bảo vệ các loài đặc hữu quý hiếm và nguy cấp Tuy nhiên cần lưu ý rằng DNA barcode không thể thay thế phân loại nhưng nó là công cụ hữu ích để tạo ra thông tin về đơn vị phân loại chưa biết Hiện nay, trên thế giới, kỹ thuật này đang được sử dụng chủ yếu bởi các nhà phân loại học và nhiều nhà khoa học ở các lĩnh vực khác như khảo cổ học, công nghiệp sinh học. .. trạng nào đó của các cá thể, loài hay các nhóm loài Gần đây, việc sử dụng các DNA mã vạch (DNA barcode) để định danh loài đang được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và có những đóng góp đáng kể trong việc phân loại loài Để nhận dạng gen hay đánh giá mức độ tiến hoá loài thì các nhóm gen chính thường được sử dụng là gen ribosome rRNA, gen ty thể, và gen lục lạp (thực vật) trong đó gen... loại và xác định loài, Nâng cao năng lực kiểm soát, hiểu biết và tận dụng sự đa dạng sinh học Ngoài ra, kỹ thuật này có triển vọng nghiên cứu và ứng dụng trong khoa học cuộc sống, trong khoa học pháp y, y tế, nghiên cứu y dược, sản xuất và kiểm soát chất lượng thực phẩm Phương pháp này vô cùng có ý nghĩa trong các trường hợp các mẫu vật sinh học cần giám định loài đã được qua xử lý, chế biến như các dạng. .. thạc sĩ Sinh học Hoàng Đăng Hiếu Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1.Vật liệu 2.1.1 Thực vật Gồm 18 mẫu lá cây dó bầu được thu thập tại Hà Tĩnh, Phú Quốc và tại Lào được thống kê qua bảng sau Bảng 2.1 Thông tin về các mẫu dó bầu dùng trong nghiên cứu STT Tên mẫu Loài Xuất xứ 1 AL 02 Aquiaria sp Lào 2 AL 06 Aquiaria sp Lào 3 AL 08 Aquiaria sp Lào 4 G1 Aquiaria sp Hà Tĩnh 5 T1 Aquiaria sp Hà Tĩnh 6 T2... cho các nghiên cứu như là điều tra tương tác thực vật động vật, xác định các loài cây được bảo vệ, các cuộc khảo sát đa dạng sinh học quy mô lớn và phân biệt cây giống trong các chương trình tái sinh rừng phân biệt và cho mục đích xác định loài và phân loại [36] Spooner sau khi xem xét hiệu quả của psbA - trnH, matK, nrITS trên 63 loài khoai tây dại đã chỉ ra rằng trình tự của psbA - trnH, matK và nrITS... thường được sử dụng bao gồm: kỹ thuật isozym (đồng enzyme), các kỹ thuật phân tích so sánh trình tự nucleotide các đoạn DNA như phương pháp đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP), các kỹ thuật trên cơ sở phản ứng PCR như SSR (Simple Sequence Repeats), đa hình các đoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên - RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA) [17], [24], đa hình... cao và mang tính đặc thù của từng loài do vậy việc sử dụng các kết quả phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật được các nhà khoa học rất quan tâm Dựa trên những thông tin có sẵn từ các nghiên cứu về phát sinh loài và các nghiên cứu gần đây, một số locus là đoạn gen hay các gen được chọn để nghiên cứu làm chỉ thị barcode tiềm năng cho 16 Luận văn thạc sĩ Sinh học

Ngày đăng: 18/06/2016, 14:36

Từ khóa liên quan

Mục lục

  • MỞ ĐẦU

  • Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

    • 1.1. Tổng quan về cây dó bầu

      • 1.1.1. Đặc điểm phân loại và vị trí phân bố của cây dó bầu

      • 1.1.2. Đặc điểm sinh trưởng của cây dó bầu

      • 1.1.3. Giá trị kinh tế và sinh thái của cây dó bầu

      • 1.1.4. Thực trạng trồng và khai thác cây dó bầu trong nước và trên thế giới

      • 1.1.5. Các nhân tố ảnh hưởng tới khả năng tạo trầm nhân tạo

    • 1.2. Một số phương pháp sử dụng trong việc định danh loài và xác định quan hệ di truyền

    • 1.3. DNA barcode - quan điểm mới trong phân loại

      • 1.3.1. Giới thiệu DNA barcode

      • 1.3.2. Các đặc điểm cơ bản của trình tự barcode

    • 1.4. Một số locus được sử dụng trong phương pháp DNA barcode ở thực vật

      • 1.4.1. Trình tự gen nhân

      • 1.4.2. Vùng gen mã hóa ribosome

      • 1.4.3. Trình tự gen luc lạp

      • Bảng 1.1. Thông tin của một số mồi DNA Barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp

      • 1.4.4. Trình tự gen rbcL

      • 1.4.5. Trình tự gen matK

      • 1.4.6. Trình tự gen rpoB và rpoC1

      • 1.4.7. Trình tự gen ycf5

      • 1.4.8. Trình tự hai gen trnH-psbA

      • 1.4.9. Trình tự hai gen trnL(UAA)-trnF(GAA)

    • 1.5. Tình hình nghiên cứu DNA barcode ở thực vật

    • 1.6. Một số kết quả trong nghiên cứu về cây dó bầu tại Việt Nam và trên thế giới

  • Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

    • 2.1.Vật liệu

      • 2.1.1. Thực vật

      • Bảng 2.1. Thông tin về các mẫu dó bầu dùng trong nghiên cứu

      • 2.1.2. Chủng vi khuẩn

      • 2.1.3. Hóa chất

      • 2.1.4. Máy móc thiết bị

      • 2.1.5. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

      • Bảng 2.2.Trình tự các cặp mồi nhân bản gen barcode

    • 2.2. Phương pháp nghiên cứu

      • 2.2.1. Các bước nghiên cứu

      • 2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu

      • Bảng 2.3. Thành phần dung dịch đệm rửa

      • Bảng 2.4. Thành phần dung dịch đệm tách

      • Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR

      • Bảng 2.6. Chu kỳ phản ứng PCR

      • Bảng 2.7. Thành phần phản ứng ligase

      • Bảng 2.8. Thành phần môi trường chọn lọc tế bào vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp

      • Bảng 2.9. Thành phần phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc

      • Bảng 2.10. Chu kỳ phản ứng PCR- clony

      • Bảng 2.11. Thành phần hóa chất tách plasmid

      • Bảng 2.12. Thành phần hóa chất dùng trong phản ứng cắt enzyme

  • Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

    • 3.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA tổng số

    • 3.2. Tìm nhiệt độ gắn mồi đăc hiệu của phản ứng PCR

      • Bảng 3.1 Nhiệt độ bắt mồi và kích thước gen của các cặp mồi nghiên cứu

    • 3.3. Kết quả nhân bản gen với các cặp mồi nghiên cứu

      • 3.3.1. Kết quả nhân bản gen rbcL

      • 3.3.2. Kết quả nhân bản gen rpoB

      • 3.3.3 Kế quả nhân bản gen psbA-trnH

      • 3.3.4. Kết quả nhân bản gen ITS

    • 3.4. Kết quả tách dòng gen

      • 3.4.1 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel)

      • 3.4.2. Kết quả chuyển gen vào vector tách dòng

      • 3.4.3. Kêt quả biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E. coli

      • 3.4.4 Kết quả chọn lọc dòng tế bào mang gen tái tổ hợp

      • 3.4.5. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp

      • 3.4.6. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp

    • 3.5. Xác định và phân tích trình tự nucleotide của các đoạn DNA chỉ thị

      • 3.5.1. Kết quả xác định và phân tích trình tự gen trn-psbA

      • Bảng 3.2. So sánh trình tự vùng trnH-psbA intergenic lục lạp

      • 3.5.2. Kết quả xác định và phân tích trình tự gen rpoB

      • Bảng 3.3. So sánh trình tự vùng gen lục lạp rpoB

      • 3.5.3. Kết quả xác định và phân tích trình tự vùng gen lục lạp rbcL

      • Bảng 3.4. So sánh trình tự vùng gen lục lạp rbcL

      • Bảng 3.5. Vị trí sai có thể khác dùng để phân loại của đoạn gen vùng rbcL

      • 3.5.4. Kết quả xác định và phân tích trình tự gen ITS

      • Bảng 3.6. So sánh trình tự vùng gen ribosom ITS

      • Bảng 3.7. Các vị trí sai khác dùng để phân loại của đoạn gen vùng ITS

  • KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

  • TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan