ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - LÝ THỊ KIM TUYẾN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT γ-AMINOBUTYRIC AXIT TỪ DỊCH CÁM GẠO BẰNG LACTOBACILLUS LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - LÝ THỊ KIM TUYẾN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT γ-AMINOBUTYRIC AXIT TỪ DỊCH CÁM GẠO BẰNG LACTOBACILLUS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRỊNH TẤT CƢỜNG Hà Nội - 2014 LỜI CẢM ƠN Trước tiên xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Trịnh Tất Cường người thầy hướng dẫn, giúp đỡ tận tình, tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô giảng dạy khoa Sinh học làm sở cho thực tốt luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu tập thể cán bộ, anh, chị bạn Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym Protein – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN Cuối xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Hà Nội ngày 27 tháng 10 năm 2014 Học viên Lý Thị Kim Tuyến i MỤC LỤC MỞ ĐẦU .9 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1.1 Gama-Aminobutyric axit (GABA) 11 1.2 Cấu trúc hình dạng GABA 11 1.3 Quá trình tổng hợp chức GABA não 12 1.4 Enzym tổng hợp GABA 13 1.5 Thụ thể GABA 14 1.6 Sản xuất GABA từ vi sinh vật .15 1.7 Cơ chất tham gia sản xuất GABA 17 1.8 Thực phẩm chức GABA 18 1.8.1 Cám gạo - nguồn nguyên liệu tạo thực phẩm chức chứa GABA 18 1.8.2 Nghiên cứu GABA Việt Nam Error! Bookmark not defined 1.9 Đánh giá hoạt tính sinh học GABA thông qua thụ thể Error! Bookmark not defined CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 2.1 NGUYÊN LIỆU Error! Bookmark not defined 2.1.1 Vi sinh vật Error! Bookmark not defined 2.1.2 Các mẫu cám gạo Error! Bookmark not defined 2.1.3 Các dòng tế bào Error! Bookmark not defined 2.1.4 Máy móc dụng cụ Error! Bookmark not defined 2.1.5 Các hóa chất, nguyên liệu khác Error! Bookmark not defined 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.2.1 Xây dựng quy trình lên men sản xuất GABA từ dịch cám gạo Error! Bookmark not defined 2.2.1.1 Nuôi cấy bảo quản chủng KC1 Error! Bookmark not defined 2.2.1.2 Kiểm tra khả sinh GABA chủng KC1 Error! Bookmark not defined ii 2.2.1.3 Đánh giá chất lƣợng cám gạo Error! Bookmark not defined 2.2.1.4 Xác định hoạt tính glutamate decacboxylase cám gạo Error! Bookmark not defined 2.2.1.5 Xác định glutamic axit phƣơng pháp sắc ký mỏng (TLC) Error! Bookmark not defined 2.2.1.6 Định lƣợng glutamic acid phƣơng pháp so màu Error! Bookmark not defined 2.2.1.7 Chiết xuất glutamic acid cám gạo phƣơng pháp nƣớc sôi Error! Bookmark not defined 2.2.1.8 Xác định GABA phƣơng pháp sắc ký mỏng (TLC) [41] Error! Bookmark not defined 2.2.1.9 Định lƣợng GABA phƣơng pháp so màu [57] Error! Bookmark not defined 2.2.1.10 Xác định nguồn vô hữu thích hợp lên men Error! Bookmark not defined 2.2.1.11 Tìm điều kiện lên men thích hợp môi trƣờng dịch cám gạo Error! Bookmark not defined 2.2.2 Tinh chế GABA [31] Error! Bookmark not defined 2.2.2.1 Khử màu Error! Bookmark not defined 2.2.2.2 Khử muối Error! Bookmark not defined 2.2.2.3 Chạy sắc ký trao đổi ion Error! Bookmark not defined 2.2.2.4 Kết tinh GABA Error! Bookmark not defined 2.2.3 Đánh giá hoạt tính GABA Error! Bookmark not defined 2.2.3.1 Nuôi tế bào WSS-1 tế bào PC12 Error! Bookmark not defined 2.2.3.2 Đánh giá khả sống chết tế bào Error! Bookmark not defined 2.2.3.3 Xác định GABA phƣơng pháp HPLC [42] Error! Bookmark not defined 2.2.3.4 Đánh giá hoạt tính GABA dựa vào thay đổi màu iot [49] Error! Bookmark not defined 2.2.3.5 Định lƣợng GABA dựa vào thay đổi màu iot Error! Bookmark not defined iii CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 3.1 Quy trình lên men sản xuất GABA từ dịch cám gạo Error! Bookmark not defined 3.1.1 Khả sinh GABA chủng KC1 Error! Bookmark not defined 3.1.2 Các tiêu chất lƣợng an toàn thực phẩm cám gạo Error! Bookmark not defined 3.1.3 Đánh giá hoạt động GAD cám gạo Error! Bookmark not defined 3.1.4 Xác định thành phần lựa chọn nguyên liệu cám gạo Error! Bookmark not defined 3.1.4.1 Xác định định tính glutamic acid hai mẫu cám gạo Error! Bookmark not defined 3.1.4.2 Định lƣợng glutamic acid hai mẫu cám gạo Error! Bookmark not defined 3.1.5 Lƣợng glutamic acid thu đƣợc phƣơng pháp nƣớc sôi Error! Bookmark not defined 3.1.6 Đƣờng chuẩn GABA xác định hàm lƣợng GABA phƣơng pháp so màu Er ror! Bookmark not defined 3.1.7 Nguồn vô hữu thích hợp lên men Error! Bookmark not defined 3.1.8 Các điều kiện lên men thích hợp môi trƣờng dịch cám gạo Error! Bookmark not defined 3.1.8.1 pH thích hợp cho lên men Error! Bookmark not defined 3.1.8.2 Nhiệt độ thích hợp cho lên men Error! Bookmark not defined 3.1.8.3 Thời gian thích hợp cho lên men Error! Bookmark not defined 3.1.8.4 Tỉ lệ ôxy thích hợp cho lên men Error! Bookmark not defined 3.1.9 Sơ đồ quy trình lên men từ dịch chiết cám gạo Error! Bookmark not defined 3.2 Đánh giá hoạt tính GABA phƣơng pháp sắc ký mỏng Error! Bookmark not defined 3.3 Đánh giá hoạt tính GABA Error! Bookmark not defined iv 3.3.1 Đánh giá khả sống chết tế bào PC12 Error! Bookmark not defined 3.3.2 Xác định GABA HPLC Error! Bookmark not defined 3.3.3 Đánh giá hoạt tính sinh học GABA thông qua thụ thể Error! Bookmark not defined 3.3.3.1 Nuôi cấy tế bào WSS-1 Error! Bookmark not defined 3.3.3.2 Đánh giá hoạt tính GABA thông qua bắt màu Iot dòng tế bào WSS1 Error! Bookmark not defined 3.3.3.3 Định lƣợng GABA dựa vào thay đổi màu iot Error! Bookmark not defined DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT GABA Axit gamma-amino butylric GABA-T GABA transaminase GAD L-glutamate decarboxylase v HTS Phƣơng pháp sàng lọc High throughput screening KC1 Chủng Lactobacillus plantarum KLEPT ml milliliter mM millimolar MRS De Man, Rogosa, Sharpe MSG Monosodium glutamate OD Mật độ quang học PLP Pyridoxalphosphate TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TLC Thin layer chromatography TPCN Thực phẩm chức DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Cấu trúc GABA .4 Hình Con đƣờng tổng hợp phân hủy GABA .5 Hình 3: Mô hình cấu trúc thụ thể GABAA vi Hình 4: Mô hình cấu trúc thụ thể GABAB Hình 5: Hoạt động thụ thể trƣớc sau gắn kết với GABA Hình 6: Kết chạy sắc ký TCL dịch lên men môi trƣờng MRS 29 Hình 7: Hoạt tính GAD cám gạo đƣợc xác định thông qua MSG 31 Hình 8: Kết xác định glutamic acid cám gạo TLC 32 Hình 9: Đƣờng chuẩn glutamic acid .33 Hình 10: Hiệu nhiệt độ thời gian trình thủy phân glutamic acid từ cám gạo 35 Hình 11: Đƣờng chuẩn GABA 36 Hình 12: Hiệu NaCl trình phát triển tế bào sản xuất GABA 37 Hình 13: Ảnh hƣởng pH tới trình sản xuất GABA trình lên men dịch chiết cám gạo 41 Hình 14: Ảnh hƣởng nhiệt độ tới trình sản xuất GABA trình lên men dịch chiết cám gạo 42 Hình 15: Ảnh hƣởng thời gian tới trình sản xuất GABA trình lên men dịch chiết cám gạo 43 Hình 16: Ảnh hƣởng ôxy tới trình sản xuất GABA trình lên men dịch chiết cám gạo 44 Hình 17: Sơ đồ quy trình lên men cám gạo .45 Hình 18: Sản phẩm GABA sau đông khô (A), sau tinh chế (B) .46 Hình 19: Kiểm tra GABA TLC 46 Hình 20: Khả bảo vệ tế bào PC12 dịch lên men chủng Lactobacillusplantarum KLEPT 48 Hình 21: Sắc ký đồ GABA chuẩn 49 Hình 22: Xây dựng đƣờng chuẩn GABA qua HPLC .49 Hình 23: Chạy sắc ký HPLC mẫu dịch lên men .50 Hình 24: Chạy phân đoạn tách chiết sắc ký cột .51 vii Hình 25: Đƣa mẫu GABA tinh vào đƣờng chuẩn để xác định độ tinh mẫu 52 Hình 26: Ảnh chụp từ máy ảnh dƣới kính soi sau 24 nuôi cấy tế bào WSS-1 (A), sau 48 (B) 53 Hình 27: Kết thay đổi OD Iot dựa vào thay đổi nồng độ GABA lên men 54 Hình 28: Đƣờng chuẩn nồng độ GABA mật độ quang bƣớc sóng 405nm 55 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Thành phần môi trƣờng MRS .15 Bảng 2: Chỉ tiêu chất lƣợng hai mẫu cám gạo 30 Bảng 4: Giá trị glutamic acid mẫu cám gạo 33 Bảng 5: Lƣợng GABA mật độ tế bào phụ thuộc vào nguồn Cacbon 38 Bảng 6: Lƣợng GABA mật độ tế bào phụ thuộc vào nguồn Nitơ .39 viii CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Gama-Aminobutyric axit (GABA) GABA axít amin có tự nhiên, thực vật bậc cao nhƣ khoai tây, đậu tƣơng, lúa, gạo lứt nguyên phôi Trong thể, GABA đƣợc phát hệ thống thần kinh trung ƣơng vào khoảng năm 1950 Eugene Roberts nhƣng đến năm 1960, GABA đƣợc đề xuất chất dẫn truyền thần kinh ức chế thể Ngoài não, GABA có mặt tế bào B tuyến tụy, buồng trứng, tinh hoàn, ống tiêu hóa GABA có chức quan trọng hệ thống thần kinh [5] Hoạt động GABA với glutamate aspartate thực phần lớn hoạt động thông qua khe xináp hệ thống thần kinh trung ƣơng [20, 51] Một số vai trò GABA với sức khỏe ngƣời: - Giảm bớt trạng thái căng thẳng bất an, giúp ngủ ngon ngủ sâu - Điều trị tự chủ tạm thời: có mối quan hệ việc thiếu GABA tƣợng tự chủ hành vi số bệnh nhân Trong trƣờng hợp này, bổ sung thêm GABA ngăn ngừa vô hiệu hóa hoạt động tế bào thần kinh não bộ, tránh khỏi tự chủ bệnh nhân - Stress – tình trạng tâm lý căng thẳng làm gia tăng đau nhức Nhƣ chất dẫn tự nhiên có chức giảm stress, GABA giảm bớt tình trạng đau nhức kéo dài giảm dấu hiệu lo lắng có liên quan đến đau nhức giúp cho bớt cảm giác đau nhức - Giảm trầm cảm - Việc sử dụng loại thuốc an thần làm giảm lƣợng GABA thể nguyên nhân gây tƣợng hoảng loạn - GABA đƣợc coi điều trị đƣợc trạng thái rối loạn tâm lý trƣớc thời kỳ kinh nguyệt (PMS - premenstrual syndrome) phụ nữ 1.2 Cấu trúc hình dạng GABA GABA có cấu trúc gồm cacbon Nhóm cacbon cho proton nhóm amin nhận proton (hình 1) Hình dạng GABA phụ thuộc nhiều vào điều kiện môi 12 trƣờng Ở trạng thái khí, GABA cuộn lại nhiều lần để tạo sức hút điện tích hai nhóm chức amin cacbon Theo tính toán hóa học để phá vỡ cấu trúc cần lƣợng khoảng 50 kcal/mol Ở trạng thái rắn, GABA có hình dạng mạch thẳng Dƣới dạng mạch thẳng, GABA có cấu trúc hình học trans nhóm amin cuối dạng cis nhóm cacbon kết thúc Cấu trúc giúp cho phân tử GABA liên kết dễ dàng với phân tử GABA khác Ở trạng thái lỏng, GABA tồn nhiều dạng cấu trúc khác bao gồm dạng gấp khúc, dạng mạch thẳng Chính nhờ khả tồn nhiều dạng cấu trúc khác tạo cho GABA có nhiều chức sinh học quan trọng [20, 22] Hình 1: Cấu trúc GABA [58] 1.3 Quá trình tổng hợp chức GABA não GABA tham gia vào nhiều trình hệ thống thần kinh trung ƣơng Chẳng hạn nhƣ liên quan đến tâm trạng lo âu, trầm cảm… Bởi vì, GABA xuyên qua đƣợc hàng rào để vào não Do vậy, GABA đƣợc tổng hợp não đƣờng trao đổi chất đƣợc biết “GABA shunt” (hình 2) Giai đoạn cuối đƣờng sinh GABA thông qua trình chuyển hóa L-glutamate phân cắt enzym glutamic acid decarboxylase (GAD) nhờ kích thích truyền tín hiệu thần kinh [20, 22] Khi lƣợng GABA đƣợc sinh vƣợt ngƣỡng từ tín hiệu tế bào thần kinh đƣợc enzym gọi gamma-aminobutyric acid transaminase (GABA-T) làm giảm bớt [20] Mặc dù, GABA-T tham gia tổng hợp GABA từ semialdehyde succinic nhƣng vai trò enzyme phá hủy GABA Ngoài ra, chất ức chế hoạt động GABA-T làm sinh lƣợng lớn GABA não [20] Hơn nữa, trình tạo GABA GAD cần có tham gia vitamin 13 B6 hay đƣợc gọi pyridoxal-5’-phophate đƣợc xem nhƣ cofactor [32] Cofactor mang semialdehyde succinic tạo thành GABA não Hình 2: Con đƣờng tổng hợp phân hủy GABA (GABA shunt) [40] GABA đảm bảo trì hoạt động bình thƣờng não đặc biệt neuron thần kinh GABA đóng vai trò việc giảm bớt hoạt động neuron thần kinh ức chế lan truyền tế bào dẫn truyền tín hiệu GABA ngăn cản tín hiệu căng thẳng bất an đến vùng thần kinh trung ƣơng việc chiếm giữ khống chế vùng tiếp nhận tin tế bào [20] Do vậy, GABA giúp cho thƣ giãn thần kinh cải thiện đƣợc tinh thần Cho tới nay, nhiều công trình nghiên cứu khoa học công bố GABA giúp cho ngƣời có giấc ngủ ngon sâu, cải thiện khả tự chủ tạm thời, đau nhức kéo dài, rối loạn tăng động thiếu ý hay bệnh trầm cảm, trạng thái tâm lý trƣớc thời kỳ kinh nguyệt [16, 33, 43, 46, 50, 55, 54] 1.4 Enzym tổng hợp GABA L-glutamate decarboxylase (GAD) enzym xúc tác phản ứng tổng hợp GABA từ Glutamate loại phân tử CO2 GAD tồn dƣới hai dạng đồng phân GAD65 GAD67 theo khối lƣợng phân tử chúng (lần lƣợt 65 67 kDa) Chúng đƣợc mã hóa hai gen độc lập nằm hai nhiễm sắc thể số số 10 ngƣời, gen GAD65 nằm NST số 10 gen GAD67 nằm NST số [20, 40] GAD67 enzym phân bố khắp tế bào thần kinh GABAergic thể Ngƣợc lại, GAD65 chủ yếu đƣợc tìm thấy tận dây thần 14 kinh đƣợc neo màng túi chất dẫn truyền thần kinh Hoạt động enzym GAD cần cofactor pyridoxal phosphate (PLP) [52] 1.5 Thụ thể GABA Thụ thể GABA bao gồm: thụ thể GABAA phần phức hệ mang kênh ion vị trí gắn kết với phối tử; thụ thể GABAB thuộc họ thụ thể protein G có nhiệm vụ mở kênh ion thông qua truyền thông tin nội bào qua protein G [20, 39] Thụ thể GABAA phân tử lớn có tiểu đơn vị protein Tất tiểu đơn vị có đoạn cuối N phần bên tế bào, tiếp đến đoạn xuyên màng, đoạn xuyên màng có đoạn loop lớn, cuối đoạn cuối C ngắn Các tiểu đơn vị protein tổ hợp đƣờng khác đƣợc xếp tạo lõi cho phép kênh Cl- qua (Hình 3) GABAA có vai trò điều khiển biểu lo âu ảnh hƣởng tới trí nhớ não Các tế bào thần kinh sản xuất GABA đƣợc gọi thần kinh GABAergic hoạt động trình ức chế động vật có xƣơng sống giai đoạn trƣởng thành [39] 17-20% neuron thần kinh GABAergic hầu hết hoạt tính sinh lý GABA đƣợc tạo thành thông qua thụ thể GABAA Trong động vật có xƣơng sống, GABA hoạt động khe xináp não liên kết với thụ thể GABA xuyên màng tế bào thần kinh Quá trình liên kết dẫn tới mở kênh ion phép kênh ion mang điện tích âm Cl- vào tế bào kênh ion mang điện tích dƣơng tế bào Quá trình tạo điện âm màng tế bào dẫn tới vị trí thƣờng xuyên trạng thái phân cực mạnh [20] Hình 3: Mô hình cấu trúc thụ thể GABAA [59] 15 Thụ thể GABAB có hai tiểu đơn vị GABAB1 GABAB2 (Hình 4) GABAB1 có vai trò nhận dạng phối tử bên tế bào GABAB2 có nhiệm vụ màng tế bào truyền tín hiệu Thụ thể GABAB đƣợc ứng dụng nhƣ đích để tìm loại thuốc điều trị dƣợc học liên quan đến vai trò truyền tín hiệu khứu giác, đồng hóa, tái sản xuất, phát triển, tăng hocmon tín hiệu trầm cảm [20] Hình 4: Mô hình cấu trúc thụ thể GABAB [59] Hình 5: Hoạt động thụ thể trƣớc sau gắn kết với GABA [52] 1.6 Sản xuất GABA từ vi sinh vật Hiện nay, trình sản xuất GABA có nhiều đƣờng khác chẳng hạn: trình khử cacbon axít glutamic nhờ phân cắt GAD [11, 8], tách chiết từ loại ngũ cốc [24, 27], tạo điều kiện tối ƣu để hạt gạo nảy mầm cho hàm lƣợng GABA gần 15,8 g/100 g gạo [36], kích thích GAD mầm gạo để 16 chuyển hóa GABA đạt hiệu suất 29 g/100 g mầm gạo [36] lên men đậu tƣơng vi sinh vật [9, 11, 37, 55] Công nghệ sử dụng vi sinh vật đặc biệt vi khuẩn lactic phƣơng pháp tốt để sản xuất GABA [11, 19, 21, 26, 28, 42, 45, 47, 53] Vi khuẩn lactic nhóm vi khuẩn đƣợc nhiều nghiên cứu gần chứng minh có khả sản xuất GABA [24] Bởi vì, vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh lý đặc biệt xem nhƣ an toàn trình sử dụng vào mục đích chăm sóc sức khỏe cho ngƣời [10, 15, 23, 29, 30, 34] Do vậy, GABA đƣợc sản xuất từ vi khuẩn lactic có chất từ tự nhiên an toàn cho sức khỏe nhƣ làm tăng lƣợng GABA nƣớc ép dâu [8] Nhiều sản phẩm đƣợc làm tăng hàm lƣợng GABA sử dụng GABA sản xuất từ vi khuẩn lactic đƣợc phân lập từ sản phẩm bơ [45], sữa đậu nành [37], kimchi [12], phophat [35] sản phẩm lên men từ cá [26] Một vài chủng sản xuất GABA đƣợc chứng minh có tiềm sản xuất GABA quy mô lên men với thể tích lớn [28] Chẳng hạn, chủng Lactobacillus brevis NCL 912 phân lập từ paocai Trung Quốc [32] thu đƣợc nồng độ GABA dịch lên men tối ƣu 1005,8 mM Leuconostoc NC5 phân lập từ sản phẩm lên men tôm Malaysia cho nồng độ GABA gần 800 mM [6] Đặc biệt, chủng Latobacillus sakei B2-16 đƣợc phân lập từ kim chi Hàn Quốc có khả lên men GABA từ dịch chiết cám gạo với nồng độ 660 mM [28] Việc sàng lọc vi khuẩn lactic dựa vào khả tổng hợp GABA mở triển vọng trình sản xuất GABA Ngoài ra, số vi sinh vật khác có khả sinh GABA đƣợc ứng dụng chẳng hạn nhƣ vi khuẩn kỵ khí sản xuất GABA loại chè nhƣ chè mầm tƣơi, chè đen, chè Gabaron, chè olong, chè xanh [5] Lactobacillus (viết tắt Lb) chi nhóm vi khuẩn lactic, trực khuẩn không sinh bào tử thuộc nhóm vi khuẩn gram dƣơng Trình tự gen GAD đƣợc tìm thấy Lactobacillus brevis [38], Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii subsp Bulgaricus [48], Lactobacillus paracasei [25], Lactococcus lactis subsp Lactis [34] 17 Trong thập kỉ qua, nghiên cứu mở lĩnh vực nghiên cứu chất có hoạt tính sinh học hợp chất hữu có nguồn gốc từ thực phẩm.Việc sử dụng chủng lên men tổng hợp GABA đƣợc nghiên cứu rộng rãi ứng dụng thực tế Hiện nay, việc lên men Lactobacillus plantarum để tổng hợp GABA từ nguồn nguyên liệu dƣ thừa nông nghiệp hƣớng đầy tiềm Hoạt động GAD Lactobacillus plantarum giúp bảo vệ vi khuẩn chống lại pH thấp môi trƣờng Sau hấp thụ L-glutamate từ transpoter đặc hiệu, GAD xúc tác phản ứng decarboxyl hóa L-glutamate tế bào chất, dẫn đến tiêu thụ proton tế bào, kết làm tăng độ pH tế bào chất tăng pH ngoại bào chuyển đổi L-glutamate thành GABA kiềm [25, 14] 1.7 Cơ chất tham gia sản xuất GABA Monosodium glutamate (MSG) đƣợc xem nhƣ chất trình sản xuất Axit gamma-aminobutyric (GABA) vi khuẩn lactic [28] MSG dạng muối glutamic axit MSG tự nhiên sinh từ amino axit mà đƣợc tìm thấy đa số thực phẩm Đặc biệt thực phẩm chứa hàm lƣợng protein cao chẳng hạn nhƣ bơ, sữa, thịt, cá nhiều loại rau khác Trong thực phẩm thƣờng sử dụng MSG để tạo vị đƣợc biết tới khoảng 1200 năm trƣớc Với vị đặc biệt MSG có tên “ Unami” ngƣời dân Nhật Bản Nó có mặt thị trƣờng cách 100 năm Nhiều loại thực phẩm tăng thêm hƣơng vị cho thêm MSG với hàm lƣợng cao Trong sữa bà mẹ hàm lƣợng MSG chiếm tỉ lệ cao so với axit amino MSG số loại thuốc cao cấp chứng minh hoạt hóa tế bào thần kinh chuột cống sinh Tuy nhiên, trình hoạt hóa tế bào thần kinh không xảy thực phẩm có MSG Ngoài ra, dựa vào vô số chứng minh khoa học công bố MSG gia vị thực phẩm không gây nguy hại đến sức khỏe ngƣời mà có vai trò nhƣ phân tử truyền tín hiệu không thần kinh mà số mô khác Tuy nhiên, trình tích lũy MSG vƣợt ngƣỡng khe xináp tế bào thần kinh liên kết tạo độc tố dẫn tới phá hỏng làm 18 tổn thƣơng tới tế bào Hơn nữa, MSG có nhiều công bố gây độc cho tế bào thần kinh trẻ em dƣới tuổi Bởi vậy, sử dụng MSG nhƣ chất cho trình chuyển hóa thành GABA điều đáng đƣợc quan tâm [60] 1.8 Thực phẩm chức GABA Hiện nay, thực phẩm chức (TPCN) GABA có mặt phổ biến thị trƣờng nƣớc với dạng sản phẩm khác chẳng hạn nhƣ: dƣới dạng đồ uống, thực phẩm, kem, dạng viên, kẹo Ở Việt Nam, thực phẩm chức GABA có bán thị trƣờng Tuy nhiên, tất sản phẩm GABA nhập [58] 1.8.1 Cám gạo - nguồn nguyên liệu tạo thực phẩm chức chứa GABA Trong cám gạo có chứa nhiều chất quan trọng nhƣ: vitamin E, vitamin B1, B3, B6, ma-giê, man-gan, sắt, GAD chất xơ mà thành phần chủ yếu polysaccharide [1, 7, 12, 13, 11] Cám gạo đƣợc chứng minh làm giảm nguy ung thƣ, giảm cholesterol tốt cho hệ tim mạch phụ nữ sau mãn kinh Đồng thời, với chất xơ cám gạo giúp chống lại bệnh xơ vữa động mạnh, giảm nguy mắc bệnh tim bệnh tiểu đƣờng Mặc dù vậy, cám gạo thực phẩm cho ngƣời không cho vị giác ngon nên ăn hàng ngày với lƣợng lớn cho mục đích tăng cƣờng hệ miễn dịch Chính vậy, có số công trình nghiên cứu cám gạo nhƣ nguồn sản xuất GABA Tuy nhiên, với điều kiện tối ƣu để làm tăng cƣờng trình hoạt động GAD cám gạo cho hàm lƣợng GABA 29 g/100 g cám gạo [36] Ngoài ra, công bố gần nhóm nghiên cứu Hàn Quốc sử dụng Lactobacillus để lên men dịch cám gạo cho hiệu suất lên men GABA 660 mM dịch lên men từ kg cám gạo đƣợc bổ sung thêm 10 lít nƣớc 12% MSG tƣơng đƣơng với 679 g/1kg cám gạo [28] 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt: Đỗ Huy Bích (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học kĩ thuật Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (2007), Hóa sinh học, NXB Giáo Dục Nguyễn Thành Đạt (2007), Cơ sở sinh học vi sinh vật, NXB Đại học Sƣ phạm Hà Nội Nguyễn Xuân Thắng (2002), Receptor màng tế bào tác dụng thuốc, NXB Y học, Hà Nội Tiếng anh: Abe Y., Umemura S., Sugimoto K.I., Hirawa N., Kato Y., Yokoyama N Yokoyama T., Junichi I., Masao I (1995), “Effect of green tea rich in γ aminobutyric acid on blood pressure of Dahl salt-sensitive rats”, American Journal of Hypertens 8(1), 74-79 Ali F.W.O., Abdulamir A.S., Mohammed A.S., Bakar F.A., Manap Y.A., Zulkifli A.H., Saari N (2009), “Novel, Practical and Cheap Source for Isolating Beneficial gamma-Aminobutyric Acid-Producing Leuconostoc NC5 Bacteria”, Research Journal of Medical Science,3(4) 146-153 Bautista G.M., Lugay J.C., Cruz L.J., Juliano B.O (1964), “Glutamic acid decarboxylase activity as a viability index of artificial dried and stored rice”, Cereal Chem, 41 188-191 Cagno R D., Mazzacane F., Rizzello C.G., Angelis M.D., Giuliani G., Meloni M., Servi B.D (2009), “Synthesis of gamma-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus plantarum DSM19463: functional grape must beverage and dermatological applications”, Appl Microbiol Biotechnol, 86 731-741 Connor M.A., Saunders R.M., Kohler G.O (1977), “Preparation and properties of protein concentrates obtained by wet alkali processing of rice bran”, Rice By-products Utilization International Conference, IACFT, Spain 20 Cross M L (2004), “Immune-signaling by orally-delivered probiotic 10 bacteria: Effects on common mucosal immunoresponses and protection at distal mucosal sites”, J Immunopathol Pharmacol, 17 127-134 11 Chin H.S., Breidt F., Fleming H.P., Shin W.C., Yoon S.S (2006), “Identification of predominant bacterial isolates from the fermenting kimchi using ITS-PCR and partial 16S rDNA sequence analyses”, J Microbiol Biotechnol,16 68-76 Cho Y.R., Chang J.Y., Chang H.C (2007), “Production of gamma- 12 aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus buchneri isolated from kimchi and its neuroprotective effect on neuronal cells”, J Microbiol Biotechnol, 17 104109 13 Choi S I., Lee J W., Park S M., Lee M Y., Ji G E., Park M S., Heo T R (2006), “Improvement of γ-aminobutyric acid (GABA) production using cell entrapment of Lactobacillus brevis”, J Microbiol Biotechnol, 16 562-568 14 Di Cagno R., Mazzacane F., Rizzello C.G., De Angelis M., Giuliani G., Meloni M., De Servi B., Gobbetti M (2009), "Synthesis of gamma- aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus plantarum DSM19463: functional grape must beverage and dermatological applications", Appl Microbiol Biotechnol, 86 41-731 Foester C.W., Foester H F (1973), “Glutamic acid decarboxylase in spores 15 of Bacillus megaterium and its possible involvement in spore germination”, J Bacteriol, 114 1090-1098 Hayakawa K., Masayuki K., Yamori Y (2005), “Role of the renal nerves in 16 γ-aminobutyric acid-induced anti-hypertensive effect in spontaneously hypertensive rats”, European Journal of Pharmacology, 524 120-125 Inglese J (2007), “High-throughput screening assays for the identification 17 of chemical probes”, Nature chemical biology, 466-479 21 18 Jannoey P., Niamsup H., Lumyong S., Tajima S., Nomura M., Chairote G (2010), “γ-Aminobutyric Acid (GABA) Accumulations in Rice During Germination”, Chiang Mai J, 37(1) 124-133 19 Jeun J.H., Kim H.D., Lee H.S., Ryu B.H (2004), “Isolation and identification of Lactobacillus sp produced γ-aminobutyric acid (GABA) from traditional salt fermented anchovy”, Kor J Food Nutr, 72-79 20 Jin Z., Mendu S.K., Birnir B (2011), GABA is an effective immunomodulatory molecule, Amino Acids, 45 87-94 21 Kang M.S., Cho S.C., Kook M.C., Pyun Y.R., Choi C.I (2006), “Novel strains of Lactobacillus spp and method for preparing γ-aminobutyric acid using the same”, Korea Patent 10-0549094 22 Kayahara H., Sugiura T (2001), “Research on physiological function of GABA in recent years-improvement function of brain function and antihypertension”, Japanese Journal of Food development, 36(6) 4-6 23 Kim S.H., Shin B.H., Kim Y.H., Nam S.W., Jeon S.J (2007), “Cloning and expression of a full-length glutamate decarboxylase gene from Lactobacillus brevis BH2”, Biotechnol Bioprocess Eng, 12 707-712 24 Kinefuchi M., Sekiya M., Yamazaki A., Yamamoto K (1999), “Accumulation of GABA in brown rice by high pressure treatment”, Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 46 323-328 25 Komatsuzake N., Kawamoto S., Momose H., Kimura T (2005), "Production of γ aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermented foods", Food Microbiol, 22 497-504 26 Komatsuzake N., Shima J., Kawamoto S., Momose H., Kimura T (2005), “Production of γ-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus paracasei isolated from traditional fermented foods”, Food Microbial, 22 497-504 27 Kono I., Himeno K (2000), “Changes in γ-aminobutyric acid content during beni-koji making”, Biosci Biotechnol Biochem, 64 617-619 22 Kook M.C (2010), “Enhanced Production of γ-Aminobutyric Acid Using 28 Rice Bran Extracts by Lactobacillus sakei B2-16”, J Microbiol Biotechnol, 20(4) 29 763-766 Lee H.Y., Park J.H., Seok S.H., Choi S.A., Baek M.W., Kim D.J., Lee Y., Park J.H (2004), “ Dietary intake of various lactic acid bacteria suppresses type helper T cell production in antigen-primed mice splenocyte”, J Microbiol Biotechnol, 14 167-170 Leroy F., De Vuyst L (2004), “Lactic acid bacteria as functional starter 30 cultures for the food fermentation industry”, Trends Food Sci Technol, 15 6778 31 Li H., Qiu T., Chen Y (2011), “Separation of gamma-aminobutyric acid from fermented broth”, J Ind Microbiol Biotechnol, 38 1955-1959 32 H.X., Gao D.D., Cao Y.S., Xu H.Y (2008), “A high γ-aminobutyric acidproducing Lactobacillus brevis isolated from Chinese traditional paocai”, Ann Microbiol, 58 649-653 33 Manyam B.V., Katz L., Hare T.A., Kaniefski K., Tremblay R.D (1981), “Isoniazid-induced elevation of cerebrospinal fluid (CSF) GABA levels and effects on chorea in Huntington’s disease”, Ann Neurol, 10 35-37 34 Nomura M., Fujita Y., Kobayashi M., Kimoto H., Suzuki I., Aso H (1999), "Lactococcus lactis contains only one glutamate decarboxylase gene", Microbiology,145 1375-1380 35 Nomura M., Kimoto H., Someya Y., Furukawa S., Suzuki I (1998), “Production of gamma-aminobutyric acid by cheese starters during cheese ripening”, J Dairy Sci, 81 1486-1491 36 Ohtsubo S., Asano S., Sato K., Matsumoto I (2000), “Enzymatic Production of v-Aminobutyric Acid Using Rice (Oryza sativa) Germ”, Food Sci Technol Res, 29 208-211 23 37 Park K.B., Oh S.H (2007), “ Production of yogurt with enhanced levels of gamma-aminobutyric acid and valuable nutrients using lactic acid bacteria and germinated soybean extract”, Bioresource Technolology, 98(8) 1675-1679 38 Park O (2007), "Cloning, sequencing and expression of a novel glutamate decarboxylase gene from a newly isolated lactic acid bacterium, Lactobacillus brevis OPK-3", Elsevier, 312-329 39 Parkash J., Kaur G (2007), “ Potential of PSA-NCAM in neuron-glial plasticity in the adult hypothalamus: Role of noradrenergic and GABAergic neurotransmitters”, Brain Research Bulletin, 74 317-328 40 Peter T Bosma., Martin A Collins., John D.D Bishop., I.G.P Guy Drouin., Kevin Docherty., Vance L Trudeau (1999), "Multiplicity of Glutamic Acid Decarboxylases (GAD) in Vertebrates: Molecular Phylogeny and Evidence for a New GAD Paralog", Soc Mol Biol Evol 397-404 41 Qui T., Li H., Cao Y (2010), “Pre-staining thin layer chromatography method for amino acid detection”, Afr J Biotechnol, 8679-8681 42 Ratanaburee A., Kantachote D., Charernjiratraku., Penjamras P., Chaiyasut C (2011), “ Enhancement of γ-aminobutyric acid in a fermented red seaweed beverage by starter culture Lactobacillus plantarum DW12”, Electronic Journal of Biotechnology,14 0717-3458 43 Roberts K.A., Wright J.W., Harding J.W (1993), “GABA and bicucullineinduced blood pressure changes in spontaneously hypertensive rats”, J Cardiovasc Pharmacol, 21 156-162 44 Sereewatthanawut I., Prapintip S., Watchiraruji., Goto M., Sasaki M., Shotipruk A (2006), “Extraction of protein and amino acids from deoiled rice bran by subcritical water hydrolysis”, Bioresource Technology, 99 555-561 45 Siragusa S., De Angelis M., Di Cagno R., Rizzello C.G., Coda R., Gobbetti M (2007), “Synthesis of gamma-Aminobutyric Acid by Lactic Acid Bacteria Isolated from a Variety of Italian Cheeses”, Applied and Environmental Microbiology, 73 7283-7290 24 46 Stanton H.C (1963), “Mode of action of gamma amino butyric acid on the cardiovascular system”, Arch Int Pharmacodyn, 143, tr 195-204 47 Sun T.S., Zhao S.P., Wang H.K., Cai C.K., Chen Y.F., Zhang H.P (2009), “ACE-inhibitory activity and gamma-aminobutyric acid content of fermented skim milk by Lactobacillus helveticus isolated from Xinjiang koumiss in China”, Eur Food Res Technol, 228 607-612 48 Sun Z., Chen X., Wang J., Zhao W., Shao Y., Guo Z., Zhang X., Zhou Z., Sun T., Wang L., Meng H., Zhang H., Chen W (2011), "Complete Genome Sequence of Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus Strain ND02", J Bacteriol, 193(13) 3426-3427 49 Tang W, Wildey M.J (2004), “Development of a colorimetric method for functional chloride channel assay”, J Biomolecular Screening, 607-613 50 Tsai J.S., Lin Y.S., Pan B.S., Chen T.J (2006), “ Antihypertensive peptides and gamma-aminobutyric acid from prozyme facilitated lactic acid bacteria fermentation of soymilk”, Process Biochem, 41 1282-1288 51 Ueda Y., Doi T., Nagatomo K., Tokumaru J., Takaki M., Willmore L.J (2007), “Effect of levetiracetam on molecular regulation of hippocampal glutamate and GABA transporters in rats with chronic seizures in-duced by amygdalar FeCl3 injection”, Brain Research, 1151 55-61 52 Waagepetersen S (2004), Gamma-aminobutyric acid (GABA), sciencedirect 53 Wang M., Hettiarchchy N.S., Qi M., Burks W., Siebenmorgen T (1999), “Preparation and functional properties of rice bran protein isolate”, J Agric Food Chem, 47 411-416 54 Wong C.G., Bottiglieri T., Snead O.C (2003), “GABA, γ-hydroxybutyric acid and neurological disease”, Ann Neurol, 54 S3-S12 55 Yamakoshi J., Fukuda S., Satoh T., Tsuji R., Salto M., Obata A., Matsuyama A., Kikuchi M., Kawasaki T (2007), “Antihypertensive and 25 natriuretic effect of less-sodium soy sauce containing gamma-aminobutyric acid in spontaneously hypertensive rats”, Biosci Biotechnol Biochem, 71 165-173 56 Yang S.Y., Lu F.X., Lu Z.X., Bie X.M., Jiao Y, Sun L.J, Yu B (2008), “Production of gamma-aminobutyric acid by Streptococcus salivariussubsp thermophilus Y2 under submerged fermentation”, Amino Acids, 34 473-478 57 Zhang G., Bown A.W (1997), “The rapid determination of γ-aminobutyric acid”, Phytochemistry, 44 1007-1009 58 59 60 61 26 [...]... hành đề tài: “ Nghiên cứu quy trình sản xuất γ- Aminobutyric axit (GABA) từ dịch cám gạo bằng Lactobacillus Nghiên cứu thực hiện nhằm các mục tiêu: + Xây dựng quy trình lên men phù hợp để sản xuất GABA từ dịch cám gạo bằng chủng Lactobacillus plantarum KLEPT đạt hiệu suất cao 10 lít/ mẻ + Đánh giá hoạt tính GABA thông qua thụ thể GABA 11 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Gama -Aminobutyric axit (GABA) GABA... đích tăng cƣờng hệ miễn dịch Chính vì vậy, đã có một số công trình nghiên cứu cám gạo nhƣ là một nguồn sản xuất GABA Tuy nhiên, với những điều kiện tối ƣu để làm tăng cƣờng quá trình hoạt động của GAD trong cám gạo thì cũng chỉ cho hàm lƣợng GABA là 29 g/100 g cám gạo [36] Ngoài ra, một công bố gần đây của nhóm nghiên cứu Hàn Quốc đã sử dụng Lactobacillus để lên men dịch cám gạo đã cho hiệu suất lên... GABA bằng sử dụng những GABA sản xuất từ vi khuẩn lactic đƣợc phân lập từ sản phẩm của bơ [45], sữa đậu nành [37], kimchi [12], phophat [35] và những sản phẩm lên men từ cá [26] Một vài chủng sản xuất GABA đã đƣợc chứng minh có tiềm năng sản xuất GABA ở quy mô lên men với thể tích lớn [28] Chẳng hạn, chủng Lactobacillus brevis NCL 912 phân lập từ paocai Trung Quốc [32] đã thu đƣợc nồng độ GABA trong dịch. .. GABA từ thực phẩm truyền thống và đã tối ƣu quá trình sản xuất GABA khi sử dụng vi khuẩn lactic axit đối với mục tiêu công nghiệp Tại Việt Nam, có thể nói chƣa có công nghệ chế biến GABA có khả năng hƣớng tới quy mô công nghiệp Mặc dù, một số công trình nghiên cứu về sản xuất GABA đã đƣợc nghiên cứu nhƣng vẫn chƣa có sản phẩm GABA bán ra thị trƣờng Ngoài ra cho tới nay vẫn chƣa có một công trình nghiên. .. trình nghiên cứu nào ứng dụng vi khuẩn Lactobacillus lên men từ dịch cám gạo để sản xuất GABA có hoạt tính kích thích miễn dịch ổn định ở Việt Nam Hiện nay, hƣớng nghiên cứu ứng dụng các chất có nguồn gốc tự nhiên để làm thực phẩm chức năng bắt đầu xuất hiện ở Việt Nam Thực tế, khi một sản phẩm có thể tiếp cận đƣợc trên thị trƣờng thì sản phẩm phải đảm bảo về chất lƣợng và giá thành Để giải quy t hai... những chức năng sinh lý quan trọng nên rất nhiều công trình nghiên cứu trọng tâm vào sự phát triển GABA thành thực phẩm chức năng Hiện nay, quá trình sản xuất GABA có rất nhiều con đƣờng khác nhau chẳng hạn: tách chiết từ các loại ngũ cốc, tạo điều kiện tối ƣu để hạt gạo nảy mầm, hoặc lên men đậu tƣơng bằng vi sinh vật Trong đó, quá trình sản xuất GABA bằng lên men vi sinh vật (vi khuẩn, nấm) đang đƣợc... 1005,8 mM Leuconostoc NC5 phân lập từ sản phẩm lên men của tôm Malaysia cho nồng độ GABA là gần 800 mM [6] Đặc biệt, chủng Latobacillus sakei B2-16 đƣợc phân lập từ kim chi Hàn Quốc đã có khả năng lên men GABA từ dịch chiết cám gạo với nồng độ 660 mM [28] Việc sàng lọc vi khuẩn lactic dựa vào khả năng tổng hợp GABA có thể mở ra một triển vọng mới về quá trình sản xuất GABA Ngoài ra, một số vi sinh... giác, đồng hóa, tái sản xuất, phát triển, tăng hocmon và tín hiệu trầm cảm [20] Hình 4: Mô hình cấu trúc của thụ thể GABAB [59] Hình 5: Hoạt động của thụ thể trƣớc và sau khi gắn kết với GABA [52] 1.6 Sản xuất GABA từ vi sinh vật Hiện nay, quá trình sản xuất GABA có rất nhiều con đƣờng khác nhau chẳng hạn: quá trình khử cacbon của axít glutamic nhờ phân cắt của GAD [11, 8], tách chiết từ các loại ngũ cốc... Lactis [34] 17 Trong các thập kỉ qua, các nghiên cứu cơ bản mở ra một lĩnh vực nghiên cứu mới đối với các chất có hoạt tính sinh học hoặc các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc từ thực phẩm.Việc sử dụng các chủng trên trong lên men tổng hợp GABA đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi và ứng dụng trong thực tế Hiện nay, việc lên men Lactobacillus plantarum để tổng hợp GABA từ các nguồn nguyên liệu dƣ thừa của nông nghiệp... thành GABA kiềm hơn [25, 14] 1.7 Cơ chất tham gia sản xuất GABA Monosodium glutamate (MSG) đƣợc xem nhƣ là một cơ chất trong quá trình sản xuất Axit gamma -aminobutyric (GABA) bằng vi khuẩn lactic [28] MSG là một dạng muối của glutamic axit MSG trong tự nhiên sinh ra từ amino axit mà đƣợc tìm thấy trong đa số các thực phẩm Đặc biệt các thực phẩm chứa hàm lƣợng protein cao chẳng hạn nhƣ bơ, sữa, thịt,