TRƯỜNG ĐẠI HỌC HẢI PHÒNG VIỆN SINH-NÔNG [ HỌ VÀ TÊN: NGUYỄN MẠNH TƯỜNG LỚP: Công nghệ sinh học K13 KHÓA: 2012-2016 TÊN ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN LỌC CÁ THỂ TRONG QUẦN THỂ F5 MANG QTL/GEN TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CAO SẢN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP: Ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: Ts: Trần Đăng Khánh Th.s: Vũ Thị Lan Phương Hải Phòng, năm 2015 LỜI CẢM ƠN Được trí Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhịêm Viện Sinh – Nông, Bộ môn Kỹ thuật Di truyền - Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam thời gian thực tập tốt nghiệp em thực đề tài: “Ứng dụng thị phân tử chọn lọc cá thể quần thể F5 mang QTL/gen tăng số hạt phục vụ công tác chọn tạo giống lúa cao sản” Sau thời gian tháng thực tập em hoàn thành đề tài Để đạt kết này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Trần Đăng Khánh, (Bộ môn Kỹ thuật Di truyền - Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam) nhiệt tình hướng dẫn tạo điều kiện cho em thực đề tài khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn ThS Vũ Thị Lan Phương (Giảng viên Viện Sinh- Nông trường Đại học Hải Phòng) tận tình dìu dắt hướng dẫn em suốt trình học tập hoàn thành khóa luận Trong thời gian thực tập vừa qua em nhận giúp đỡ hướng dẫn tận tình anh chị Bộ môn Kỹ thuật Di truyền - Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy giáo, cô giáo Viện Sinh - Nông - Đại học Hải Phòng những người đã trực tiếp giảng dạy, trang bị những kiến thức bổ ích suốt thời gian em học tập trường Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả người thân, bạn bè, gia đình và những người bên cạnh động viên, giúp đỡ em quá trình học tập và thực hiện đề tài Hà Nội, ngày 28 tháng 04 năm 2016 Sinh viên thực hiện đề tài: Sinh viên thực Nguyễn Mạnh Tường DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Sơ đồ chu trình nhiệt phản ứng PCR Hình 4.1 Kết kiểm tra DNA tổng số tách chiết theo phương pháp CTAB gel agarose 0,8% Hình 4.2 Hình ảnh điện di sàng lọc quần thể F5 với thị RM445 Hình 4.3 Hình ảnh điện di sàng lọc quần thể F5 với thị RM500 Hình 4.4 Hình ảnh điện di sàng lọc quần thể F5 với thị RM21615 DANH MỤC VIẾT TẮT DNA : Deoxyribonucleic Acid RNA : Ribonucleic Acid PCR : Polymerase Chain Reaction KD : Kháng Dân AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài đoạn nhân chọn lọc RAPD : Random Amplification of Polymorphic DNA - Đa hình ADN nhân ngẫu nhiên RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn SSR : Simple Sequence Repeat - Sự lặp lại trình tự đơn giản cs : Cộng dNTP : Deoxynucleotide triphosphate MAS : Marker Assisted Selection – Chọn lọc nhờ thị phân tử PCR : Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp QTL/QTLs : Quantity Trait Loci(s) - Locus kiểm soát tính trạng số lượng TBE : Tris-Boric Acid-EDTA CTAB: Cetyl trimethyl ammonium bromide SDS: Sodium dodecyl sulfate TEMED: Tetramethyl ethylene diamine APS : Amomium Persulphate (NH4)2S2O8 Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây lúa (Oryza sativa L) lương thực quan trọng, với diện tích trồng khoảng 148,4 triệu hecta toàn giới (trong châu Á chiếm 135 triệu hecta) Ở Việt Nam lúa gạo sản phẩm xuất chủ lực nông nghiệp nguồn lương thực 90 triệu dân nước [Bộ Nông nghiệp PTNT, 2014] [1] Do trình đô thị hóa, công nghiêp hóa diễn nhanh chóng, diện tích đất dành cho việc trồng lúa ngày bị thu hẹp, chịu ảnh hưởng tiêu cực từ biến đổi khí hậu làm suất lúa bị sụt giảm rõ rệt, với áp lực dân số ngày tăng đòi hỏi nguồn cung lương thực ngày lớn Vì vậy, đáp ứng sản lượng lương thực việc làm cần thiết cấp bách Việc phát triển nguồn giống cải tiến cho suất cao, chất lượng tốt yếu tố quan trọng cho việc đảm bảo hệ thống sản lượng lúa Chọn tạo giống lúa có khả năng suất cao cần thiết, cấp bách có ý nghĩa cho an toàn lương thực tăng thu nhập nông dân.Trong công tác chọn giống trồng, tính trạng khảo nghiệm tính trạng liên quan đến suất, phẩm chất sản phẩm chủ yếu liên quan tới việc tăng cường tính chống chịu sâu bệnh điều kiện ngoại cảnh bất lợi, đặc điểm mong muốn hình thái bị ảnh hưởng từ điều kiện môi trường không biểu điều kiện ngoại cảnh không phù hợp Xuất phát từ thực tế thực đề tài: “Ứng dụng thị phân tử chọn lọc cá thể quần thể F5 mang QTL/gen tăng số hạt phục vụ công tác chọn tạo giống lúa cao sản.” MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU 1.2 1.2.1 Mục đích - Chọn cá thể mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt quần thể F5 chọn giống lúa cao sản tổ hợp lai Khang Dân 18 x KC25 - Ứng dụng phương pháp chọn giống nhờ thị phân tử chọn lọc dòng lúa cao sản mang QTL/gen cho suất triển vọng 1.2.2 Yêu cầu - Xác định kiểu gen quần thể F5, khẳng định có mặt QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt quần thể - Đánh giá nhanh xác dòng lúa cao sản mang QTL/gen làm tăng suất thị phân tử Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY LÚA 2.1.1 Nguồn gốc phân loại Cây lúa thuộc họ hòa thảo (Poaceae, trước họ Gramineae) thân bụi, mềm Lúa trồng thuộc chi Oryza với nhiều loài khác Hai loài quan tâm nhiều Oryza sativa L Oryza glaberrima L có nguồn gốc vùng nhiệt đới cận nhiệt đới khu vực đông nam châu Á châu Phi Hai loài cung cấp 1/5 toàn lương thực mà người sử dụng Loài Oryza sativa L có ba loài phụ Indica, Japonica, Javanica Trong đó, Indica loại lúa trồng nhiều vùng nhiệt đới, Japonica trồng vùng ôn đới Loài Oryza sativa L có số nhiễm sắc thể đơn bội n = 12 Tám số 23 loài lúa dại có gen tứ bội, đại đa số loài lúa dại lúa trồng có gen lưỡng bội (2n) Hiện có khoảng 83.000 mẫu lúa lưu giữ ngân hàng gen quốc tế Viện nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI)[6], ngân hàng gen quốc gia Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, Indonesia, Việt Nam, Trong đó, có khoảng 9700 mẫu giống lúa đặc thù cho tính chịu hạn, úng, nóng, lạnh, sâu bệnh Cây lúa Việt Nam (Oryza sativa L) gọi lúa châu Á hóa từ lúa dại từ ba trung tâm châu Á Theo đặc điểm lúa trồng Việt Nam chủ yếu giống Indica  Đặc điểm hình thái sinh trưởng lúa Đặc điểm hình thái Bộ rễ lúa thuộc loại rễ chùm Những rễ non có màu trắng sữa, rễ trưởng thành có - màu vàng nâu nâu đậm, rễ già có màu đen Thời kỳ mạ: Nếu mạ gieo thưa, rễ mạ dài 5-6 cm Tiêu chuẩn mạ tốt - rễ ngắn,nhiều rễ trắng Thời kỳ sau cấy: Bộ rễ tăng dần số lượng chiều dài thời kỳ đẻ nhánh, làm 2.1.2 đòng - Thời kỳ trỗ bông: Bộ rễ đạt giá trị tối đa vào thời kỳ trỗ Số lượng rễ đạt tới 500 – 800 Chiều dài rễ đạt 2- km/ trồng riêng chậu Trên đồng ruộng, phạm vi rễ mắt gần lớp đất mặt (0-20 cm chính) Khi câý lúa sâu (>5 cm), lúa tạo tầng rễ, thời gian lúa chậm phát triển giống tượng lúa bị bệnh ngẹt rễ Cấy độ sâu thích hợp (3-5cm) khắc phục tượng Để tạo điều kiện cho rễ phát triển tốt, cần làm cỏ sục bùn điều chỉnh lượng nước hợp lí, tạo điều kiện cho tầng đất vùng rễ thông thoáng, rễ phát triển  * - mạnh., Cây lúa sinh trưởng tốt, chống chịu sâu bệnh, nâng xuất cao Thân lúa Hình thái Thân gồm nhiều mắt lóng Trước thời kỳ lúa trỗ, thân lúa bao bọc bẹ - Tổng số mắt thân số thân cộng thêm Chỉ vài lóng dài ra, số lại ngắn dày đặc Lóng dài Một lóng dài - + + * - mm xem lóng dài Số lóng dài: Từ 3-8 lóng Theo giải phẫu ngang lóng, lóng có khoảng trống lớn gọi xoang lỏi Chiều cao cây, thân: Chiều cao Được tính từ gốc đến mút cao Chiều cao thân Được tính từ gốc đến cổ Chiều cao thân chiều cao liên quan đến khả chống đổ giống lúa Nhánh lúa Cây lúa đẻ nhánh có 4-5 thật Ở ruộng lúa cấy, sau bén rễ hồi xanh lúa bắt đầu đẻ nhánh Lúa kết thúc đẻ nhánh vào thời kỳ làm đốt, làm đòng - Từ mẹ đẻ nhánh (cấp 1), nhánh cấp đẻ nhánh cấp , nhánh cấp đẻ nhánh cấp Những nhánh hình thành vào giai đoạn cuối thường nhánh vô - hiệu Thường giống lúa khả đẻ nhánh cao, tỷ lệ nhánh hữu hiêu - cao giống lúa cũ, cổ truyền Khả đẻ nhánh lúa phụ thuộc vào giống, điều kiện chăm sóc,  * + + + + - ngoại cảnh Cây lúa có nhiều nhánh, tỷ lệ nhánh hữu hiệu cao, suất cao Lá lúa Hình thái Lá lúa điển hình gồm: bẹ lá, phiến lá, thìa tai Bẹ lá: phần đáy kéo dài cuộn thành hình trụ bao phần non thân Phiến lá: hẹp, phẳng dài bẹ ( trừ thứ hai) Lá thìa: vảy nhỏ trắng hình tam giác Tai lá: Một cặp tai hình lưỡi liềm Lá hình thành từ mầm mắt thân Tốc độ thay đổi theo thời gian sinh trưởng điều kiện ngoại cảnh Thời kỳ mạ non: trung bình ngày Thời kỳ mạ khoẻ: từ thứ 4, tốc độ chậm lại, 7-10 ngày Thời kỳ đẻ nhánh: 5-7 ngày /1lá vụ mùa Cuối thời kỳ đẻ nhánh - làm đòng: khoảng 12 - 15 ngày / lúa trỗ lúc hoàn thành đòng Số phụ thuộc chủ yếu vào giống, thời vụ cấy, biện pháp bón phân * trình chăm sóc Thường số giống: Giống lúa ngắn ngày: 12 - 15 Giống lúa trung ngày: 16 - 18 Giống lúa dài ngày: 18 - 20 Chức Lá thời kỳ thường định đến sinh trưởng thời kỳ Ba cuối thường liên quan ảnh hưởng trực tiếp đến thời kỳ làm đòng * - hình thành hạt Chức bẹ Chống đỡ học cho toàn Dự trữ tạm thời Hydratcacbon rước lúa trỗ Lá làm nhiệm vụ quang hợp, chăm sóc hợp lí, dảm bảo cho khoẻ, tuổi thọ (nhất đòng), lúa hạt, suất cao 10 Hình 4.2 Hình ảnh điện di sàng lọc quần thể F5 với thị RM445 L: Ladder 50bp, M: KD 18, B: KC25, 1-60: dòng F5 tổ hợp KD18/KC25 Qua Hình 4.2 cho thấy, hầu hết băng điện di quần thể mang gen đồng hợp tử giống bố xuất số băng có kiểu gen dị hợp, giải thích tượng thụ phấn chéo nhầm lẫn học Trong băng có kiểu gen đồng hợp tử giống bố bao gồm số: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59 60 Các băng có kiểu gen dị hợp tử bao gồm số: 13, 15, 27 54 Chúng sử dụng băng điện di (các cá thể) đồng hợp tử giống bố thị RM445, tiếp tục kiểm tra thị RM500, thị liên kết cận biên QTL/gen yld7 quy định tính trạng tăng số hạt Kết kiểm tra thể Hình 4.3 43 Hình 4.3 Hình ảnh điện di sàng lọc quần thể F5 với thị RM500 L: Ladder 50bp, M: KD18, B: KC25, 1-60: dòng F5 đồng hợp tử với KC25 thị RM445 Khi kiểm tra băng điện di đồng hợp tử giống bố(KC25) thị RM445 thị RM500, kết cho thấy có băng dị hợp tử số 53 Các băng lại mang kiểu gen đồng hợp tử giống bố bao gồm số: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 55, 56, 57, 58, 59 số 60 Tiếp tục kiểm tra băng DNA đồng hợp tử giống bố(KC25) vị trí RM500 thị RM21615, kết kiểm tra thể Hình 4.4 44 Hình 4.4 Hình ảnh điện di sàng lọc quần thể F5 với thị RM21615 L: Ladder 50bp, M: KD18, B: KC25, 1-60: dòng F5 đồng hợp tử với KC25 RM445 Sau kiểm tra thị RM21615, xác định băng DNA có kiểu gen đồng hợp tử giống bố bao gồm số: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59 60 Xuất băng số 48 mang kiểu gen dị hợp tử (mang gen giống bố giống mẹ) Các băng có kiểu gen đồng hợp tử giống bố thị RM445, RM500 RM21615 liệt kê tóm tắt Bảng 4.1 45 Bảng 4.1 Các băng DNA có kiểu gen đồng hợp tử giống bố ba thị RM445, RM500 RM21615 Chỉ thị Các băng ADN có kiểu gen giống bố 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, RM445 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, RM500 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 55, 56, 57, 58, 59, 60 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, RM21615 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 52, 55, 56, 57, 58, 59, 60 Kết hợp thị RM445, RM21615 RM500 xác định 54 băng mang QTL/gen tăng số hạt bao gồm: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 52, 55, 56, 57, 58, 59, 60 Bảng 4.2 Cá thể thuộc Các dòng F5 có kiểu gen đồng hợp tử giống bố Tên dòng Chi tiết cá thể xuất băng điện di có kiểu gen đồng hợp tử Dòng Băng 1-10 (cá thể 1-100) Dòng Băng 11-12 (cá thể 101-120); băng 14 (cá thể 131-140); băng 16-20 (cá thể 151-200) Dòng Băng 21-26 (cá thể 201-260); băng 28-30 (cá thể 271-300) Dòng Băng 31-40 (cá thể 301-400) Dòng Băng 41-47 (cá thể 401-470); băng 49-50 (cá thể 481-500) Dòng Băng 51-52 (cá thể 501-520); băng 55-60 (cá thể 551-600) 46 Ghi chú: Dấu “()” thể số thứ tự cá thể băng điện di tương ứng với dòng 4.3 THẢO LUẬN Qua Bảng 4.1 Bảng 4.2 cho thấy: Với 600 cá thể, có 10 băng DNA thuộc dòng dòng cho kết 100% cá thể có kiểu gen đồng hợp tử giống bố Như vậy, đến hệ F5 thu dòng mang QTL/gen tăng số hạt Các dòng lại tương đối chủng, có hai dòng thụ phấn chéo nên mang gen dị hợp tử bố - mẹ, nguồn vật liệu quý phục vụ chọn tạo dòng/giống lúa năng suất Thông qua nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chọn giống nhờ thị phân tư (MAS) với mục tiêu chọn lọc cá thể lai hệ tự thụ mang gen đích kết hợp với đánh giá kiểu hình để chọn lọc cá thể đặc điểm trội sau nhân lên thành dòng triển khai mở rộng sản xuất diện rộng 47 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN 5.1 Qua trình nhiên cứu kết hợp với thị RM445, RM500 RM21615 liên kết chặt với QTL/gen tăng số hạt bông, có số nhận xét sau: - Xác định dòng 01 dòng 04 có 100% cá thể kiểm tra đồng hợp tử Xác định dòng 03 05 có 90% cá thể mang gen đồng hợp tử giống bố thị Dòng 02 06 có 80% cá thể mang gen đồng hợp tử giống bố 5.2 ĐỀ NGHỊ Để có kết luận chắn cần tiếp tục nghiên cứu, đánh giá giống lúa có gen mang tính trạng tăng số hạt qua hệ Do có giới hạn tài thời gian nên đề nghị tiếp tục nghiên cứu vấn đề hệ F6, F7 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng việt Bộ Nông Nghiệp Phát triển Nông thôn (2014), Quy hoạch sử dụng đất lúa cho vùng nước Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2000), Những nguyên tắc chọn giống trồng, Di truyền phân tử I, NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh Nguyễn Trí Hoàn (2009), Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học việc chọn tạo dòng bố, mẹ phục vụ chọn tạo giống lúa lai siêu cao sản Việt Nam Chương trình KC.04/06 – 10 2009 Trần Đăng Khánh, Đỗ Mạnh Cường (2012), Báo cáo chuyên đề 2.1: “Xác định thị phân tử đa hình vị trí QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt giống Khang Dân (recipient) dòng cho QTL tăng số hạt KC25 (donor)”, Viện Di truyền Nông nghiệp, Tháng 10, 2012 Lã Tuấn Nghĩa (2011), Chọn tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn có suất chất lượng cao thị phân tử, Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, 2+3/2011 Viện nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI, 1960), Nhóm tư vấn nghiên cứu nông nghiệp quốc tế, Los Banos Laguna, Philippines Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2005), Công nghệ sinh học Nông nghiệp, Giáo trình trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội, NXB Nông nghiệp, tr.61 49 Vương Đình Tuấn, Fukutu Y, Yano M Ban T (2000), Lập đồ xác định vị trí gen di truyền số lượng ảnh hưởng đến tính chống chịu mặn lúa (Oryza sativa), Omon Rice 8: 27 – 35 II Tài liệu tiếng anh Bai Y, Lindhout P (2007), Domestication and breeding of tomatoes: what have we gained and what can we gain in the future? Annals of Botany ;100:1085-1094 10 Bell C.J and Ecker (1994), "Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis", Genomics (19), pp.1 37-142 11 Concibido, V.C., Young, N.D., Lange, D.A., Denny, R.L., Danesh, D., and Orf, J.H (1996), Targeted comparative genome analysis and qualitative mapping of a major partial-resistance gene to the soybean cyst nematode Theor.Appl genet 93:234-241 12 Crittenden and L.B Cheng (1994), "Microsatellite markers for genetic mapping in the chicken" Poult Science (73), pp.539-546 13 Estoup A., Presa A., Krieg F., Vaiman D and Guyomard R (1993), "(CT)- n and (GT)-n microsatellite: A new class of genetic markers for Salmo Trutta L (brown trout)", Heredity (71), pp.488-496 14 Hubbel, C.R.a (1992), "Abundance and DNA sequence of two-base repeat regions in tropical tree genomes", Genome (34), pp.66 – 71 15 Kakunaga, H.H.a.T (1982), "Potential Z-DNA forming sequences are highly dispersed in the human genome", Nature (298), pp.396-398 50 16 Largercrantz U., E.H., Andersson (1993), "The abundance of various polymorphic microsatellite motifs differs between plants and vertebrates", Nucleic Acids Res (21), pp.1111 –1115 17 Li JM, Thomson M and McCouch SR (2004), Fine mapping of a grain weight quantitative trait locus in the pericentromeric region of rice chromosomes Genetics 168:2187-2195 18 Linh L.H., Jin F.X., Kang K.H., Lee Y.T., Kwon S.J., Ahn S.N.(2006), Mapping quantitative trait loci for heading date and awn length using an advanced backcross line from a cross between Oryza sativa and O.minuta Breeding Science 56: 341 – 349 19 Mackill et al (2006), “QTLs in rice breeding; examples for abiotic stresses”, Paper presented at the Fifth International Rice Genetics Symposium 20 Morgante M., O.A.M (1993), "PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics", Plant Journal (3), pp.175-182 21 Mohan, M., S Nair, A Bhagwat, TG Krishna, M Yano (1997), “Genome mapping, molecular markers and marker-assisted selection in crop plants”, Molecular Breeding, 3: 87-103 22 Renz, T.D.a (1984), "Simple sequences are ubiquitous repeatitive components of eukaryotic genomes", Nucl Acid Res (12), pp.4127- 4138 23 Roder M.S., P.J., Konig S.U., Borner A., Sorrel M.E., Tanksley S D and Gana (1995), "Abundance, variability and chromosome locations of microsatellites in wheat", Molecule Genetics Genet (246), pp.327-333 24 Septiningsih EM., Pamplona AM., Sanchez DL., Maghirang-Rodriguez R, Neeraja CN, Vergara GV, Heuer S, Ismail AM, Mackill DJ (2009), 51 “Development of submergence-tolerant rice cultivars: The Sub1 gene and beyond”, Ann Bot 103:151-160 25 Singh S, Mackill DJ, Ismail AM (2009), “Responses of SUB1 rice introgression lines to submergence in the field: Yield and grain quality” Field Crops Res, 113: 12-23 26 Thomson MJ, Ismail AM, McCouch SR, Mackill DJ (2009), Marker Assisted Breeding, In: Pareek A, Sopory SK, Bohnert HJ, Govindjee (eds); Abiotic Stress Adaptation in Plants: Physiological, Molecular and Genomic Foundation Chapter 20 Springer, Dordrecht 27 Weber, M.B.E.a (1989), "Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction Am J Hum", Genet (44), pp.388-396 28 Wang Z., W.J.L., Zhong G and Tanksley S.D (1994), "Survey of plant short tadem DNA repeats", Theory Applications Genet (88) 29 XU, Yunbi and CROUCH, Jonathan H.(2008), Marker-assisted selection in plant breeding: from publications to practice Crop Science, March 2008, vol 48, no 2, p 391-407 30 Zhang G., Bharaj., Virmani S.S and Huang N (2005), Mapping of the RFLP – nuclear fertility restoring gene for WA cytoplasmic male sterility in rice using RAPD and RFLP markers, Theor, Appl Genet 83, 1997, 495 – 499 III Webside 31 http://sonongnghiepkiengiang.gov.vn/news.php?id=1131 32 http://www.vaas.org.vn/images/caylua/10/051_nangsuat.htm 52 33.http://m.baobinhthuan.com.vn/vn/chitiettin.aspx? news_id=15935&cat_id=510.htm 34 http://www.khoahoc.com.vn/khampha/sinh-vat-hoc/thuc-vat/40228_gene- giup-tang-nang-suat-va-chat-luong-gao.aspx 53 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Danh mục hóa chất thiết bị sử dụng nghiên cứu  Hóa chất  Hóa chất tách chiết DNA STT Hóa chất Nồng độ CTAB 800µl SDS 10% 60µl Cloroform 800µl Isopropanol 400µl Cồn 70% 400ml TE(10:1) 100µl Gel agarose 0,8% Nước cất  Hóa chất dùng  Pha CTAB (2%): pha lít sinh học phân tử Hóa chất pha CTAB Thành phần CTAB NaCl (5M) Tris HCl (1M), pH=8 EDTA (0.1M), pH=8 Hàm lượng 20g 280ml 100ml 200ml  Pha EDTA 0.5M (pH=8): pha lít Hóa chất pha EDTA 54 Thành phần EDTA Nước cất Hàm lượng 186.1g 800ml Lưu ý: Vừa khuấy từ vừa bổ sung NaOH pH=8, bổ sung thêm nước cất cho đủ lít  Pha TBE 10X: pha lít Hóa chất pha TBE 10X Thành phần Tris base(121.1g) Boric acid (61.83g) EDTA (0.5M), pH=8 Nước cất Hàm lượng 108g 55g 40ml Bổ sung cho đủ lít  Pha polyacrylamide 40% Hóa chất pha Polyacrylamide 40% Thành phần Acrylamide Bis- acylamide Nước cất lần Hàm lượng 380g 20g Bổ sung cho đủ lít Khuấy từ khoảng h  - Dụng cụ thiết bị Máy nghiền mẫu Retsch Mixer mill MM200 Máy ly tâm lạnh Mikro Zentrifugen Máy khuấy từ gia nhiệt Fisher Scientific- Mỹ Máy PCR Vertiti96 wells Applied Biosystems Bộ điện di ngang Owl A2- BP Large Gel Electrophoresis System Bộ nguồn Power Supply Thermo Scientific EC 3000XL Hệ thống đen UV soi gel Tủ sấy memmert Paraffin Oven UNE 500PA Pipet loại 200µl, 100µl, 500µl, 1000µl Các loại thiết bị khác (lò vi sóng, nồi khử trùng, máy cất, máy siêu âm,…) 55 Phụ lục 2: số hình ảnh thí nghiệm Thực phản ứng PCR Đổ Gel Polyacrylamind 56 Chạy Polyacrylamind Chạy sản phẩm PCR Soi Gel 57 [...]... liệu thuộc đề tài ” Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn lọc cá thể trong quần thể F5 mang QTL/gen tăng số hạt trên bông phục vụ công tác chọn tạo giống lúa cao sản - KC25 là dòng cho gen: có nguồn gốc nhập nội, mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông - Khang dân 18 là giống nhận gen - Sử dụng chỉ thị phân tử RM500, RM21615, RM445 để xác định các cá thể trong quần thể F4 mang QTL/gen quy... quá trình chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chỉ thị phân tử, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm nhiều hơn đến vấn đề chọn giống nhờ chỉ thị phân tử Trong chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, quá trình chọn lọc được dựa trên cơ sở các chỉ thị phân tử liên kết với các gen quy định tính trạng cần quan tâm Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử trong chọn giống đã trở... Phát triển quần thể F1 và xác định sự có mặt của các alen chỉ thị để loại bỏ các cây lai không đủ điều kiện - Phát triển quần thể F2 phân ly, sàng lọc các cá thể bằng các chỉ thị và thu các cá thể mang alen chỉ thị mong muốn - Trồng cây F2:3 và sàng lọc các cá thể bằng chỉ thị Số lượng lớn cá thể F3 trong phạm vi một hàng có thể được sử dụng cho việc sàng lọc chỉ thị nhằm xác định hơn nữa trong trường... có thể được áp dụng chọn giống nhằm phân biệt giữa các cá thể trong một quần thể phân ly và xác định giống Khi so sánh với chọn giống truyền 22 thống, vai trò trợ giúp của chỉ thị phân tử có thể cải thiện hiệu quả chọn giống ở các điểm: - Phân biệt kiểu gen đồng hợp tử và dị hợp tử Để phân biệt các kiểu gen trong phương pháp chọn giống truyền thống là dựa trên chọn lọc kiểu hình Chọn lọc kiểu hình ít... nào, còn các alen của chị thị hình thái tương tác theo kiểu trội lặn, do đó bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc đánh giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối với chỉ thị phân tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp 2.2.2 Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử 13 • Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (Marker-assisted... niệm chọn lọc giống lúa dựa trên chỉ thị phân tử (MAS) là sử dụng chỉ thị DNA liên kết chặt với locus mục tiêu để thay cho chọn lọc đánh giá kiểu hình với giả định chỉ thị DNA có thể dự đoán kiểu hình một cách đáng tin cậy Hay nói cách khác, chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là việc sử dụng chỉ thị di truyền để kiểm soát khu vực chứa bộ gen mã hoá cụ thể đặc điểm của cây trồng Sử dụng chỉ thị phân tử liên... có ba loại chỉ thị hình thái, chỉ thị hoá sinh, chỉ thị phân tử Trong đó, chỉ thị phân tử được xem là công cụ rất hiệu quả để đánh giá đa dạng sinh học phục vụ công tác chọn giống cây trồng (Nguyễn 11 Quang Thạch và cs, 2005)[7] Vậy chỉ thị phân tử là gì? Chỉ thị phân tử (chỉ thị DNA) có thể được định nghĩa như một đoạn DNA đặc hiệu, biểu hiện khác biệt ở mức độ phân tử genome Chúng có thể có hoặc... việc chọn giống có hiệu quả, phải xác định được chỉ thị phân tử đa hình giữa giống bố mẹ và các cá thể trong quần thể phân tích Mức độ xác định chỉ thị phân tử đa hình phụ thuộc vào hệ thống chỉ thị được sử dụng Với chỉ thị phân 14 tử, cho phép các nhà chọn giống xác định được chính xác các gen/locus gen quy định những tính trạng mong muốn Các gen/locus gen này cũng sẽ được chuyển vào các giống mới trong. .. thông tin cao được cung cấp bởi một số lượng alen lớn trên locus • Ưu điểm của chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái Chỉ thị phân tử rõ ràng không bị ảnh hưởng tác động của môi trường và điều kiện sống của cây trong tất cả các giai đoạn sinh trưởng So với chỉ thị hình thái, chọn lọc bằng chỉ thị phân tử có các ưu thế sau: Kiểu gen của các locus chỉ thị phân tử có thể được xác định tại bất kỳ giai... thuốc lá MAS được ứng dụng hiệu quả hơn trong chọn giống khởi đầu dựa trên cơ sở thông tin từ Ils, có thể tạo những giống mang các đoạn nhiễm sắc thể cụ thể đã được biết có các alen chính liên quan đến các tính trạng số lượng như hàm lượng đường (Brix) và năng suất 2.3.2 Tình hình nguyên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử tại Việt Nam Những nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống (như kỹ thuật