ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Nguyễn Minh Quế ĐÁNH GIÁ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU DẺ VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN DẺ TRÙNG KHÁNH - CAO BẰNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ - TẾ BÀO THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Nguyễn Minh Quế ĐÁNH GIÁ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ MẪU DẺ VÀ NGHIÊN CỨU BẢO TỒN NGUỒN GEN DẺ TRÙNG KHÁNH - CAO BẰNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ - TẾ BÀO THỰC VẬT Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN THỊ TÂM Thái Nguyên, năm 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Để có kết này, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, chân thành đến cô giáo - TS Nguyễn Thị Tâm tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành công trình nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn kỹ thuật viên phòng Công nghệ tế bào thực vật, phòng Di truyền - Khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên nhiệt tình giúp đỡ trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể thầy cô giáo khoa Sinh - KTNN khoa Sau đại học trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ gia đình bạn bè đồng nghiệp Mặc dù có nhiều cố gắng, song không tránh khỏi sai sót Tôi mong đóng góp ý kiến, bảo quý thầy cô bạn Thái Nguyên, ngày 25 tháng 08 năm 2009 Tác giả Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi, số liệu công trình hoàn toàn trung thực, xác Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn kết Tác giả Nguyễn Minh Quế Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm hình thái hệ thống phân loại dẻ 1.2 Vai trò dẻ 1.3 Một số thành tựu nuôi cấy mô - tế bào thực vật nhân giống bảo tồn nguồn gen số trồng 1.4 Ứng dụng kỹ thuật RAPD đánh giá mối quan hệ di truyền 12 số loài thực vật Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu 16 2.1.1 Vật liệu thực vật 16 2.1.2 Hoá chất thiết bị 16 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu nuôi cấy mô - tế bào 19 2.2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu mối quan hệ di truyền số mẫu 22 dẻ kỹ thuật RAPD Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Kết đánh giá mối quan hệ di truyền số mẫu dẻ 26 kỹ thuật RAPD 3.1.1 Tách chiết tinh DNA từ mẫu dẻ 26 3.1.2 Kết phân tích điện di sản phẩm PCR - RAPD 27 3.1.3 Mối quan hệ di truyền mẫu dẻ nghiên cứu 31 3.2 Kết nhân giống vô tính dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng 34 kỹ thuật in vitro 3.2.1 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng cồn 70 o javen 65% đến 34 khử trùng hạt Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http:www.lrc-tnu.edu.vn 3.2.2 Ảnh hƣởng chất kích thích sinh trƣởng đến khả 35 nhân chồi dẻ Trùng Khánh ống nghiệm 3.2.3 Ảnh hƣởng NAA đến khả rễ dẻ 42 3.2.4 Kết đƣa môi trƣờng tự nhiên 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 56 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http:www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần môi trƣờng WPM 17 Bảng 2.2 Trình tự nucleotid 10 mồi RAPD sử dụng nghiên 19 cứu Bảng 3.1 Hàm lƣợng độ tinh DNA mẫu dẻ nghiên cứu 26 Bảng 3.2 Đa hình phân đoạn DNA đƣợc nhân 10 mồi ngẫu 27 nhiên Bảng 3.3 Hàm lƣợng thông tin tính đa hình (PIC) mẫu dẻ 28 Bảng 3.4 Giá trị tƣơng quan kiểu hình (r) theo cách tính hệ số tƣơng 32 đồng Bảng 3.5 Hệ số tƣơng đồng mẫu dẻ nghiên cứu 32 Bảng 3.6 Kết khử trùng hạt dẻ Trùng Khánh 34 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng BAP đến khả phát sinh chồi 36 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng tổ hợp kinetin BAP đến phát sinh chồi 39 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng tổ hợp BAP NAA đến khả tạo cụm 41 chồi Bảng 3.10 Ảnh hƣởng NAA đến khả rễ dẻ 43 Bảng 3.11 Kết đƣa môi trƣờng tự nhiên 45 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http:www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Các mẫu dẻ đƣợc sử dụng làm vật liệu nghiên cứu 16 Hình 3.1 Kết điện di DNA tổng số mẫu dẻ gel agarose 26 0,8% Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD mẫu dẻ với mồi 29 TN03 DTN2 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD mẫu dẻ với mồi 30 DTN1 OPM5 Hình 3.4 Biểu đồ hình mẫu dẻ nghiên cứu theo hệ số 33 Jaccard kiểu phân nhóm UPGMA Hình 3.5 Các giai đoạn tạo nguyên liệu khởi đầu 35 Hình 3.6 Ảnh hƣởng BAP đến tạo chồi 37 Hình 3.7 Ảnh hƣởng BAP + kinetin đến tạo chồi 40 Hình 3.8 Ảnh hƣởng BAP NAA đến khả tạo chồi dẻ 42 Hình 3.9 Cây dẻ rễ 44 Hình 3.10 Cây dẻ trồng môi trƣờng tự nhiên với giá thể 46 khác Hình 3.11 Cây dẻ trồng môi trƣờng tự nhiên sau 20 tuần Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 http:www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Việt Nam quốc gia nằm khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, thuận lợi cho phát triển thực vật nên rừng chiếm diện tích lớn Rừng cung cấp nguồn lâm sản, góp phần cân môi trường sinh thái điều hoà khí hậu Từ đầu kỉ XX, rừng bị tàn phá nặng nề phần chiến tranh phần tập quán du canh, di cư, đốt nương, làm rẫy, chặt phá rừng bừa bãi Nguồn tài nguyên rừng bị cạn kiệt gây ô nhiễm môi trường làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ người sinh vật sống trái đất Trong năm gần đây, Đảng nhà nước có nhiều sách khuyến khích trồng gây rừng, phủ xanh đất trống đồi núi trọc xoá đói giảm nghèo Dẻ loại rừng khuyến khích trồng dẻ có giá trị kinh tế cao [14] Các phận rễ, thân, lá, hoa, hạt sử dụng [4] Cây dẻ sống thích hợp điều kiện đất đồi núi khô hạn nghèo dinh dưỡng [3] Cách trồng dẻ chủ yếu phương pháp cắt cành bầu đất hệ số nhân chồi thấp nên lâu cho thu hoạch hiệu chưa cao Họ dẻ Việt Nam không lớn nên việc nhận biết không khó khăn Tuy nhiên, việc phân biệt chi họ lại khó việc định loại loài chi lớn lại khó khăn [4] Từ năm 80 kỷ XX trở lại đây, hàng loạt kỹ thuật sinh học phân tử như: PCR, AFLP, RAPD, RFLP, SSR ứng dụng vào lĩnh vực: Phân tích đánh giá hệ gen thực vật nhằm xác định thay đổi dòng chọn lọc mức độ phân tử; sử dụng thị phân tử hỗ trợ cho chọn giống trồng góp phần rút ngắn thời gian chọn tạo giống; đánh giá đa dạng di truyền loài; phân lập chuyển gen có giá trị kinh tế để nâng cao chất lượng khả chống chịu với -1Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tn.edu.vn điều kiện bất lợi cuả môi trường Thành công sinh học phân tử đại góp phần nâng cao suất chất lượng giống trồng [5], [12] Để đánh giá mối quan hệ di truyền số mẫu dẻ góp phần vào việc bảo tồn nguồn gen dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng, chọn đề tài: "Đánh giá mối quan hệ di truyền số mẫu dẻ nghiên cứu bảo tồn nguồn gen dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật" Mục tiêu nghiên cứu - Phân tích mối quan hệ di truyền số mẫu dẻ kỹ thuật sinh học phân tử - Nghiên cứu môi trường quy trình nhân giống in vitro dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng nhằm mục đích bảo tồn nguồn gen Nội dung nghiên cứu 3.1 Đánh giá mối quan hệ di truyền số mẫu dẻ kỹ thuật RAPD 3.2 Nghiên cứu bảo tồn nguồn gen dẻ Trùng Khánh - Cao Bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro - Khử trùng mẫu: Thăm dò nồng độ cồn, javen thời gian thích hợp để khử trùng hạt dẻ Trùng Khánh - Nhân chồi: Tìm hiểu môi trường tạo chồi thông qua nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ tổ hợp chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin nhóm auxin - Tạo hoàn chỉnh: Tìm hiểu môi trường tạo rễ thông qua nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin - Đưa môi trường tự nhiên: Nghiên cứu giá thể điều kiện thích hợp để đưa dẻ tạo qua nuôi cấy phòng thí nghiệm trồng môi trường -2Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tn.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm hình thái hệ thống phân loại dẻ 1.1.1 Đặc điểm hình thái Các họ dẻ thường gặp dạng sống (habitus) thân gỗ thường xanh, rụng mùa khô Tuy nhiên, kích thước chúng thay đổi, tồn dạng: bụi (loài Lithocarpus chicocarpa, Lithocapus eucalyptifolius, Quercus arbutifolia), gỗ trung bình gỗ lớn (ở loài thuộc chi Lithocarpus, Quercus) với chiều cao dao động từ 5m - 50m đường kính từ 1m - 1,3m [4] Thân thường mọc thẳng đứng, phân nhiều cành, có bạnh gỗ (các loài thuộc chi Lithocarpus campylolepis, Quercus quangtriensis, v.v.) Tuy hầu hết loài họ dẻ cao, gặp dạng “cây lùn” có chiều cao khoảng 8m - 12m, đường kính thân khoảng 40cm - 50cm (ví dụ: Castanopsis scortechinii, Lithocarpus pachycarpus, Quercus thorelii, v.v) Vỏ thường vỏ dày ăn sâu vào lớp dác gỗ Cành có lỗ vỏ bì (bì khổng, bì - lenticular) đặc điểm đặc trưng loài thuộc họ dẻ [4], [27] Chồi đỉnh cấu trúc phức tạp gồm nhiều bắc dạng vảy chụm với đỉnh cành Trong họ dẻ, chồi đỉnh mọc phân tán kết cụm Lá họ dẻ đơn, phiến nguyên; phần lớn có kèm, mọc cách, xếp xoắn lại xếp thành dãy đặn cành chụm lại gần đầu cành Gân dạng lông chim Gân xếp rõ mặt Gân bên thường rõ mặt dưới, cong mép song song Lá kèm thường lớn mau rụng, có dạng hình trứng, hình lưỡi, mũi mác, đính gốc chung có hình khiên với cuống -3Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tn.edu.vn phiến Vị trí đính kèm thường cuống lá, có xen với cuống [4] Hoa họ dẻ phần lớn hoa nhỏ, đơn tính gốc, mọc thành cụm hình xim Các hoa thường chụm thành bó lưỡng phân trục riêng dài hay ngắn tạo thành cụm hoa dạng đuôi sóc Cụm hoa đơn tính, lưỡng tính hay hỗn hợp Hoa cánh thụ phấn nhờ gió sâu bọ thứ sinh Quả dẻ thuộc loại đặc biệt thường gọi kiểu “quả đấu” (trước gọi “quả kiên”) [4], [27] 1.1.2 Hệ thống phân loại 1.1.2.1 Họ dẻ (Fagaceae) Theo Heywood (1993), họ dẻ (Fagaceae) có chi với khoảng 900 1000 loài chia thành phân họ là: subfam.FAGOIDEAE (gồm chi Fagus Nothofagus), Subfam.CASTANEOIDEAE (gồm chi Castanea, castanopsis, Lythocarpus Chrysolepsis) subfam.QUERCOIDEAE (gồm chi Trigonobalanus Quercus) Trong đó, Việt Nam có chi (Castanea, Castanopsis, Fagus, Lithocarpus, Quercus Trigonobalamus) với khoảng 210 loài, xếp vào phân họ Có chi lớn là: Castanopsis (trên 50 loài), Lithocarpus (khoảng 110 loài) Quercus (trên 40 loài) Các chi khác có từ đến loài [4], [8] Họ dẻ phân bố phổ biến vùng cận nhiệt đới ôn đới bán cầu [27] Đặc điểm quan trọng để phân biệt chi họ cấu tạo cụm hoa đặc biệt cấu tạo đấu với đặc điểm cấu trúc bên vỏ đấu Trong trường hợp gặp dạng đấu trung gian, khó xác định xác chúng thuộc Lithocarpus hay Quercus chí Castanopsis Đó loại đấu có vảy (hay gai) nhỏ (đôi không nhìn rõ) Chúng tạo nên bề mặt vòng (hay quầng) đồng tâm Thêm nữa, đấu lại bao gần kín hạch [4] -4Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tn.edu.vn 1.1.2 Chi dẻ Castanea Mill, 1754 (dẻ, dẻ Trùng Khánh) Chi gồm dẻ Phansipan (Castanea phansipanensis A.camus) dẻ Trùng Khánh (Castaneae mollissima Blume) hợp thành Cây gỗ trung bình đến gỗ lớn Chồi đỉnh phân tán, vảy xếp lợp Lá điểm tuyến, xếp xoắn đặn không chụm lại đỉnh cành Mép có cưa nửa Lá kèm cuống, đính gốc Cụm hoa lưỡng tính (hoa phần dưới, hoa đực đỉnh ngọn), dạng (đuôi sóc), trục dài, gồm xim rút ngắn, xim mọc thẳng đứng Xim đực gồm - hoa, hoa đực có mảnh bao hoa, thường có nhị lép, nhị 10 - 12, bao phấn nhỏ, ngắn (cỡ 0,25mm - 0,35mm), đính lưng lắc lư, trung đới không nhọn đầu Mầm đấu (Cupule primordial) hình thành trước lúc hoa nở Hoa mẫu 6, bao gồm mảnh phát triển, có 10 - 12 nhuỵ lép, bầu (6) ô, vòi nhuỵ (6), hình nón hay trụ, núm nhuỵ đỉnh, hình chấm nhỏ Đấu bao kín quả, có gai nhọn, chứa (1) (3) hạch, chín thường tách thành đến nhiều mảnh Hạch tròn cạnh góc mặt cắt ngang [4] Dẻ Trùng Khánh trồng nhiều Sơn La, Lai Châu, Lạng Sơn chủ yếu Trùng Khánh - Cao Bằng Ở Trung Quốc có loại dẻ phân bố chủ yếu Vân Nam Quảng Tây [3] Dẻ Trùng Khánh thuộc loại gỗ lớn, cao từ 20m - 25m, đường kính tới 100cm Cây ưa sáng, phát triển đất hoang hoá vùng đá vôi chua, độ cao 500m - 2000m Ra hoa tháng - hàng năm, cho thu hoạch vào tháng 10 - 12 hàng năm [3] Trong chi có 12 loài phân bố chủ yếu vùng ôn đới Bắc Ở Việt Nam có loài, có loài nhập trồng [4] 1.1.3 Chi dẻ Castanopsis (D.don) Spach, 1841, nom Cons (dẻ gai, cà ổi, kha thụ) Là chi lớn gồm 120 loài, phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới ôn đới Châu Á Ở Việt Nam có 50 loài [3] Dẻ gai Bắc Giang thuộc chi -5Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tn.edu.vn Cây gỗ trung bình đến gỗ to, phần lớn thường xanh Chồi đỉnh phân tán (không kết cụm), hình trứng hay hình bầu dục; vảy xếp lợp có xu hướng xếp thành dãy Vỏ dai, dễ bóc, có nhiều xơ sợi dài đan chéo; tia vỏ nhỏ, cao 10mm - 40mm, lấn sâu vào dác gỗ < 1mm Lá điểm tuyến, xếp xoắn đặn không kết chụm lại đỉnh cành; mép nguyên có cưa nhỏ nửa Lá kèm cuống, đính gốc Cụm hoa gồm xim lưỡng phân dày đặc gồm hoa nhất, đơn tính (chỉ mang thứ hoa), lưỡng tính (hoa phần dưới, hoa đực phần ngọn) hay hỗn hợp, dạng (gié, đuôi sóc) trục dài, gồm xim ngắn Gié đực luôn mọc thẳng đứng Hoa đực có bao hoa hình chuông xẻ (5) (7) thuỳ, có nhuỵ lép; nhị (10) 12 (15); bao phấn ngắn (cỡ 0,25mm - 0,35mm), đính lưng lắc lư; trung đới không nhọn đầu Đấu có gai, mầm đấu hình thành trước lúc hoa nở, đơn độc, có đường nối dọc rõ, với - (8) điểm phát triển riêng biệt, bao quanh - (7) hoa Hoa có bao hoa hình chuông, xẻ (5) (7) thuỳ, có 10 - 12 nhị lép; bầu (6) ô (không bị bẹt); vòi nhuỵ - 5, hình nón hay hình trụ; núm nhuỵ đỉnh, hình chấm nhỏ Đấu có cuống ngắn cuống, có gai hay gai nhỏ có vảy, hay có đấu gần nhẵn, hoàn toàn bao kín - (7) hạch, chín nẻ van thường tách không thành nhiều mảnh Hạch tròn, cạnh góc mặt cắt ngang Lá mầm phẳng, lồi Sự nảy mầm đất [4], [27] Castanopsis boisii Hickel & Camus, 1922 (dẻ gai Yên Thế, dẻ gai Bắc Giang) Là gỗ trung bình, cao khoảng 5m - 20m Cây ưa sáng, thường mọc thành quần thụ, phát triển nhanh đất cát pha, hoa tháng 10 - 12, mang tháng - 10 (VFT) Phân bố chủ yếu Lạng Sơn, Cao Bằng, Bắc Giang, Quảng Ninh [3], [27] -6Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tn.edu.vn 1.2 Vai trò dẻ Dẻ có gỗ tốt, dùng xây dựng, làm nhà, làm nông cụ, đóng thuyền, làm bao bì Hạt dẻ có chứa nhiều tanin, nhiều loại ăn ngon [3] Dẻ Trùng Khánh có gỗ nặng, dùng xây dựng, để nuôi tằm Hoa đực khô dùng làm thuốc sát trùng Ăn hạt dẻ chữa thận hư, gối lưng yếu liệt, đứng khó khăn Hạt dẻ nướng ăn tán bột uống chữa lạnh, tả xối; hạt dẻ hầm chữa trẻ lở miệng; vỏ đen hạt dẻ sắc uống chữa nôn ói, ỉa máu; vỏ gai sắc uống chữa gân cốt đau nhức, giã đắp đơn sưng, tràng nhạc; hoa sắc uống chữa tràng nhạc, sa đì (viêm tinh hoàn) [3] Hạt dẻ loại có hương vị thơm ngon, bùi ngậy, ăn hạt dẻ có tác dụng chống oxy hoá máu, có lợi cho tim mạch [38] Theo số liệu phân tích viện rau năm 1999, hạt dẻ Trùng Khánh có tỉ lệ thành phần sau: glucose 3,3% - 5,4%; gluxit 43,36% 46,67%; lipit 1,16% - 2%; protein 3,12% - 3,62% [38] 1.3 Một số thành tựu nuôi cấy mô - tế bào thực vật nhân giống bảo tồn nguồn gen số trồng Nuôi cấy mô tế bào thực vật hình thành phát triển từ năm 80 kỉ XX ứng dụng chủ yếu lĩnh vực: Nhân giống vô tính in vitro, nuôi cấy mô phân sinh đỉnh sinh trưởng để tạo bệnh, bảo quản nguồn gen in vitro, tạo phôi vô tính hạt nhân tạo… [5] Kỹ thuật nuôi cấy mô 600 công ty lớn giới áp dụng nhân khoảng 500 triệu giống năm công ty giống trồng khác Dự kiến thị trường giống, kỹ thuật nuôi cấy mô thu khoảng 15 tỉ USD/năm tốc độ tăng trưởng thị trường hàng năm vào khoảng 15% [5] -7Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tn.edu.vn Trong năm gần đây, quy trình nhân giống kỹ thuật nuôi cấy in vitro nhiều sở khoa học nghiên cứu hoàn thiện đối tượng khác như: rừng, lương thực, thực phẩm, ăn quả, hoa, cảnh, dược liệu… Rừng Việt Nam chiếm diện tích lớn bị chặt phá nhiều nguyên nhân khác Góp phần vào cung cấp nguồn giống rừng phục vụ cho công tác phủ xanh đất trống, đồi núi trọc nhà nước ta, hàng loạt quy trình nhân giống in vitro loại rừng nghiên cứu nhằm tạo lượng lớn giống có chất lượng tốt Pơmu (Fokienia hodginsii (Dun) A Henry & H.H Thomas) xếp vào loại gỗ quý Việt Nam Gỗ pơmu bền, đẹp, thơm dùng nhiều xây dựng làm đồ thủ công mỹ nghệ Hiện nay, pơmu bị khai thác mạnh nên số lượng giảm nhanh Nguyễn Thế Anh, Trần Văn Minh (2007) sử dụng chồi đỉnh lấy từ - 1,5 tuổi nuôi cấy môi trường WPM, 1/2 WPM, 1/2 MS bổ sung BAP, IAA, NAA, IBA, kinetin, Rib nước dừa Kết cho thấy, môi trường WPM khoáng thích hợp cho nuôi cấy chồi đỉnh; tỉ lệ phát sinh chồi cao môi trường WPM bổ sung kết hợp BAP 0,1mg/l + IBA 0,3mg/l Khi bổ sung số chất hữu như: ngô, dịch chiết nấm men, glutamine vào môi trường nuôi cấy nhận thấy môi trường có nghiệm thức WPM + BAP 0,1mg/l + dịch chiết nấm men 1g/l có khả nhân chồi cao Nghiên cứu khả vươn thân rễ nhận thấy pơmu vươn thân tốt môi trường WPM + IBA 0,3mg/l + dịch chiết nấm men 1g/l, rễ nhiều dài môi trường WPM + IBA 5mg/l sau 45 ngày nuôi cấy [2] Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) loài quý dùng dược liệu Hiện nay, thông đỏ đứng trước nguy bị cạn kiệt Phục hồi lại rừng thông đỏ theo phương pháp truyền thống chủ yếu giâm -8Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tn.edu.vn cành bầu đất Tuy nhiên, thông đỏ sinh trưởng chậm nên hiệu phương pháp chưa cao để phục vụ khai thác sử dụng cho công nghiệp thời gian dài Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhằm mục tiêu bảo tồn phát triển thông đỏ, tác giả Trần Văn Định, Trần Văn Minh (2007) sử dụng chồi đỉnh chồi bên làm vật liệu nuôi cấy Chồi non sau vô trùng hypochlorite natrium nuôi cấy môi trường MS, WPM, B5, WV3 có bổ sung BAP Nghiên cứu ảnh hưởng chất chống hoá nâu, ảnh hưởng sinh lý mẫu nuôi cấy, tuổi mẫu đến phát sinh chồi in vitro, đến tỉ lệ ngã nghiêng chồi thông in vitro, ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy thông khí cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng chồi thông đỏ in vitro cho thấy: AgNO3 có hiệu việc hạn chế tiết nhựa đỏ vào môi trường nuôi cấy làm tăng phát sinh chồi; chồi thông đỏ phát sinh cao từ chính, tuổi mẫu 18 tháng Môi trường bổ sung BAP 5mg/l + kinetin 1mg/l + AgNO 150mg/l thích hợp cho nuôi cấy phát sinh chồi Điều kiện chiếu sáng thích hợp 11,4 - 22,8 µmol/m2/s đậy nắp giấy Cây thông đỏ rễ tốt sau 75 ngày nuôi cấy môi trường WPM có bổ sung NAA 1mg/l kết hợp Rhizopon 50mg/l [10] Được xếp vào loại gỗ quý thuộc nhóm 1, nay, trai Nam Bộ loại bị đe doạ nguy cấp có nguy tuyệt chủng tự nhiên cao Vi nhân giống trai Nam Bộ tác giả Khưu Hoàng Minh, Trần Văn Minh (2007) nghiên cứu nhằm mục tiêu bảo tồn nguồn gen quý bị tuyệt diệt tạo giống bệnh phục vụ công tác tái sinh rừng Mẫu trai thực sinh vô trùng tốt sử dụng kết hợp hypochlorit Ca 25% 20 - 32 phút với HgCl2 0,05% 15 phút Môi trường khoáng thích hợp với trai Nam Bộ WPM Khả tạo cụm chồi tốt môi trường bổ sung BAP 1mg/l môi trường bổ sung BAP 0,5mg/l thích hợp với nhân cụm chồi; khả vươn thân tốt -9Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tn.edu.vn môi trường có bổ sung nước dừa 10%; rễ tốt môi trường có bổ sung IBA 0,3mg/l [23] Trần văn Minh, Bùi Thị Tường Thu (2003), nhân nhanh loài gỗ quý giá ty (Tectona Grandis Linn.F.) với nguyên liệu ban đầu chồi đỉnh giá ty nhập nội, môi trường nuôi cấy chồi đỉnh MS WPM, chồi non sử dụng làm nguyên liệu cho thí nghiệm sau Các tác giả xây dựng thành công quy trình nhân giống in vitro đưa môi trường tự nhiên [25] Nhằm phục vụ công tác chuyển gen, nhóm tác giả Bùi Văn Thắng, Hà Văn Huân, Nguyễn Văn Việt, Hồ Văn Giảng (2007) xây dựng hoàn chỉnh hệ thống tái sinh xoan ta (Melia azedarach L.) Hệ thống tái sinh xoan ta đạt hiệu suất cao thông qua cảm ứng cụm chồi từ mảnh mầm với tỉ lệ cảm ứng tạo cụm chồi đạt 98% 7,3 chồi/mảnh cấy nuôi môi trường MS có bổ sung vitamin B5 + BAP 6,65µM+ kinetin 0,46µM + surcrose3% Kéo dài chồi dạt 97% với chiều cao trung bình 28,7mm cấy môi trường MS bổ sung vitamin B5 + IBA 0,88µM + surcrose 2% nuôi ngày Sau đó, xoan ta cấy sang môi trường MS + surcrose 1% chất điều hoà sinh trưởng Cây mô chuyển từ điều kiện in vitro trồng nhà lưới, sinh trưởng, phát triển bình thường [32] Trên số giống trồng rừng có suất chất lượng cao khác xây dựng thành công quy trình nhân giống in vitro [19] Việt Nam có hàng ngàn thuốc quý ghi tên danh lục đỏ Nhiều thuốc quý có nguy bị tuyệt chủng bị khai thác mạnh phục vụ cho việc sản xuất quy mô công nghiệp Để bảo tồn nguồn gen thuốc quý này, quy trình nhân giống dược liệu nhiều tác - 10 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tn.edu.vn giả nghiên cứu hoàn thiện như: nhân giống vô tính dòng Kava (Piper methysticum G Forster) có hoạt tính sinh học cao (Đinh Đoàn Long cs (2004)) [18] Nguyễn Trung Thành, Lê Văn Cần, Pack Kee Youep nuôi cấy rễ bất định Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamnenis Ha et Grush v.) môi trường MS Kết mô sẹo hình thành sau tuần nuôi cấy với nồng độ tối ưu 2,4-D 1mg/l Nuôi cấy mô sẹo môi trường có bổ sung IBA NAA thấy số rễ hình thành môi trường bổ sung IBA lớn nhiều môi trường bổ sung NAA (tỉ lệ tạo rễ môi trường bổ sung IBA 89% môi trường bổ sung NAA 76%) Nồng độ đường tối ưu cho sinh trưởng rễ bất định sâm Ngọc Linh 50g/l với trọng lượng khô đạt 1,75g [31] Với công trình dòng hoá hao (Artemisia annua L.) in vitro tác giả Nguyễn Thị Kim Uyên, Trần Văn Minh (2007) nhân giống môi trường LV nhận thấy, môi trường có bổ sung BAP 0,3mg/l chồi phát triển chiều cao số lượng Khi bổ sung BAP, NAA 2,4-D riêng rẽ không kích thích phát sinh phôi soma bổ sung NAA 2,4-D riêng rẽ lại kích thích tạo rễ Bổ sung kết hợp BAP 0,5mg/l NAA 0,5mg/l cho tế bào soma phát sinh đồng đều; BAP, NAA 2,4-D có tác dụng kích thích tăng tế bào soma môi trường thích hợp cho nuôi cấy tăng sinh tế bào soma môi trường LV có bổ sung BAP 0,5mg/l + NAA 0,5mg/l Qua nghiên cứu thấy rằng, cần thiết nuôi cấy tế bào soma điều kiện có chiếu sáng môi trường bán rắn lỏng [38] Có mạnh nằm khu vực thuận lợi cho nhiều loại hoa phát triển đặc biệt loại hoa vùng nhiệt đới, việc nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống loại hoa nhằm sản xuất quy mô công nghiệp phục vụ xuất nhiều tác giả quan tâm Trong lĩnh vực này, thu số thành tựu đáng kể như: Nghiên cứu phương thức nhân nhanh số giống hoa cúc chùm Hà Lan (Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Quang - 11 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tn.edu.vn Thạch, Từ Thị Hoài Thu (1999)) [1]; tái sinh in vitro cúc (Dandrenthema morifolium L.) bước đầu chuyển gen ipt làm chậm lão hoá (Nguyễn Hữu Hổ, Phan Tường Lộc, Lê Tấn Đức, Phạm Đức Trí, Nguyễn Thị Thanh (2007)) [15]… 1.4 Ứng dụng kĩ thuật RAPD đánh giá mối quan hệ di truyền số loài thực vật RAPD (Random Amplyfied Polymorphysm DNA) kỹ thuật ứng dụng năm gần Việt Nam RAPD có nhiều ưu điểm bật như: có khả phát hiện tượng đa hình DNA phạm vi rộng, thao tác đơn giản, nhanh gọn, tốn kém, không cần biết trước trình tự gen đối tượng cần nghiên cứu, chất lượng DNA không cần độ tinh cao… [40] Nhiều nghiên cứu cho thấy, RAPD kỹ thuật đem lại hiệu cao việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể đa dạng di truyền, nghiên cứu nguồn gốc loài lập đồ di truyền thực vật Vì vậy, kỹ thuật RAPD thường sử dụng kết hợp với nhiều kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền nhận diện thị phân tử có độ tin cậy Việt Nam nước nông nghiệp với sản lượng xuất lương thực, thực phẩm cao giới nên lương thực, thực phẩm nhiều tác giả quan tâm nghên cứu Với mục đích nghiên cứu mối quan hệ di truyền số giống lạc trồng (Archis hypogaea L.), Chu Hoàng Mậu Nguyễn Thị Hoa Lan (2003) phân tích đa dạng di truyền 12 giống lạc L02, L03, L05, L08, L12, L15, L16, LVT, Sen Nghệ An, Đỏ Bắc Giang, Phú Thọ Phân tích hệ gen 12 giống lạc với mồi phản ứng ngẫu nhiên nhận 32 phân đoạn DNA, có 15 phân đoạn đa hình chiếm 46,9%, mồi cho kết đa hình RA31, RA36 , RA46 RA142 Kết phân tích RAPD cho thấy DNA 12 giống lạc có cấu trúc khác giống lạc có sai khác di truyền với hệ số từ 0,03 - 0,13 [21] - 12 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tn.edu.vn [...]... kết hợp với nhiều kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận di n chỉ thị phân tử có độ tin cậy Việt Nam là một nước nông nghiệp với sản lượng xuất khẩu lương thực, thực phẩm cao trên thế giới nên cây lương thực, thực phẩm được nhiều tác giả quan tâm nghên cứu Với mục đích nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số giống lạc trồng (Archis hypogaea L.), Chu Hoàng Mậu và Nguyễn Thị Hoa... DNA trên một phạm vi rộng, thao tác đơn giản, nhanh gọn, ít tốn kém, không cần biết trước trình tự gen của đối tượng cần nghiên cứu, chất lượng DNA không cần độ tinh sạch cao [40] Nhiều nghiên cứu cho thấy, RAPD là kỹ thuật đem lại hiệu quả cao trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể và sự đa dạng di truyền, nghiên cứu nguồn gốc loài và lập bản đồ di truyền của thực vật Vì vậy, kỹ thuật RAPD... nguồn gen một số cây trồng Nuôi cấy mô tế bào thực vật được hình thành và phát triển từ những năm 80 của thế kỉ XX và được ứng dụng chủ yếu trong các lĩnh vực: Nhân giống vô tính in vitro, nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng để tạo cây sạch bệnh, bảo quản nguồn gen in vitro, tạo phôi vô tính và hạt nhân tạo… [5] Kỹ thuật nuôi cấy mô đã được trên 600 công ty lớn trên thế giới áp dụng và đã nhân... chưa cao để phục vụ khai thác và sử dụng cho công nghiệp trong thời gian dài Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhằm mục tiêu bảo tồn và phát triển cây thông đỏ, tác giả Trần Văn Định, Trần Văn Minh (2007) đã sử dụng chồi đỉnh và chồi bên làm vật liệu nuôi cấy Chồi non sau khi được vô trùng bằng hypochlorite natrium được nuôi cấy trên môi trường MS, WPM, B5, WV3 có bổ sung BAP Nghiên cứu. .. Hạt dẻ là loại quả có hương vị thơm ngon, bùi ngậy, ăn hạt dẻ có tác dụng chống oxy hoá trong máu, có lợi cho tim mạch [38] Theo số liệu phân tích của viện rau quả năm 1999, trong hạt dẻ Trùng Khánh có tỉ lệ các thành phần như sau: glucose 3,3% - 5,4%; gluxit 43,36% 46,67%; lipit 1,16% - 2%; protein 3,12% - 3,62% [38] 1.3 Một số thành tựu của nuôi cấy mô - tế bào thực vật trong nhân giống và bảo tồn nguồn. .. giống, kỹ thuật nuôi cấy mô thu được khoảng 15 tỉ USD/năm và tốc độ tăng trưởng của thị trường này hàng năm vào khoảng 15% [5] - 7Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tn.edu.vn Trong những năm gần đây, quy trình nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro được nhiều cơ sở khoa học nghiên cứu và hoàn thiện trên các đối tượng khác nhau như: cây rừng, cây lương thực, thực phẩm,... (1999)) [1]; tái sinh in vitro cây cúc (Dandrenthema morifolium L.) và bước đầu chuyển gen ipt làm chậm sự lão hoá (Nguyễn Hữu Hổ, Phan Tường Lộc, Lê Tấn Đức, Phạm Đức Trí, Nguyễn Thị Thanh (2007)) [15]… 1.4 Ứng dụng của kĩ thuật RAPD trong đánh giá mối quan hệ di truyền của một số loài thực vật RAPD (Random Amplyfied Polymorphysm DNA) là kỹ thuật mới được ứng dụng trong những năm gần đây ở Việt Nam RAPD... hưởng của chất chống hoá nâu, ảnh hưởng của sinh lý mẫu nuôi cấy, tuổi mẫu đến sự phát sinh chồi in vitro, đến tỉ lệ ngã nghiêng chồi thông in vitro, ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy thông khí và cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng chồi thông đỏ in vitro cho thấy: AgNO3 có hiệu quả trong việc hạn chế sự tiết nhựa đỏ vào môi trường nuôi cấy làm tăng sự phát sinh chồi; chồi thông đỏ phát sinh cao nhất... nuôi cấy rễ bất định của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamnenis Ha et Grush v.) trên môi trường MS cơ bản Kết quả mô sẹo hình thành sau 4 tuần nuôi cấy với nồng độ tối ưu là 2,4-D 1mg/l Nuôi cấy mô sẹo trên môi trường có bổ sung IBA và NAA thấy rằng số rễ con hình thành trên môi trường bổ sung IBA lớn hơn rất nhiều trên môi trường bổ sung NAA (tỉ lệ tạo rễ ở môi trường bổ sung IBA là 89% còn trên môi trường... trên môi trường LV và nhận thấy, môi trường có bổ sung BAP 0,3mg/l chồi phát triển về cả chiều cao và số lượng Khi bổ sung BAP, NAA và 2,4-D riêng rẽ không kích thích phát sinh phôi soma nhưng khi bổ sung NAA và 2,4-D riêng rẽ lại kích thích tạo rễ Bổ sung kết hợp BAP 0,5mg/l và NAA 0,5mg/l cho tế bào soma phát sinh đồng đều; cả BAP, NAA và 2,4-D đều có tác dụng kích thích tăng tế bào soma và môi trường