1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX - PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BỊ Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : Sinh viên thực : ĐỒN THỊ TUYẾT LÊ Thành phố Hồ Chí Minh BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX - PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ Giáo viên hướng dẫn: PGS TS NGUYỄN NGỌC TUÂN BSTY BÙI THỊ THU TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Sinh viên thực hiện: ĐỒN THỊ TUYẾT LÊ LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành gởi lời cảm tạ với lòng biết ơn sâu sắc đến: * Gia đình tạo cho tơi chỗ dựa vững vật chất lẫn tinh thần Ba mẹ sát cánh bên tôi, nuôi dưỡng chăm sóc tơi nên người, động viên tơi học tập * Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hố Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học, tất quý thầy cô truyền đạt kiết thức cho tơi suốt q trình học trường * PGS TS Nguyễn Ngọc Tuân hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn hỗ trợ thiết thực cho tơi suốt q trình thực đề tài, giúp tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp nâng cao kiến thức * BSTY Bùi Thị Thu Trang nhiệt tình hướng dẫn, động viên giúp đỡ tơi hồn thành tốt khóa luận * Quý thầy cô, cán công chức Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa sinh Trường Đại học Nông Lâm TP HCM * BSTY Lê Hữu Ngọc, phịng thực hành Kiểm nghiệm Thú sản Mơi trường, Khoa CNTY Trường Đại học Nông Lâm TP HCM * Các bạn bè thân yêu lớp CNSH K27 chia sẻ vui buồn thời gian học hết lịng hỗ trợ, giúp đỡ tơi thời gian thực tập Chân thành cảm ơn Đoàn Thị Tuyết Lê TĨM TẮT ĐỒN THỊ TUYẾT LÊ, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, Tháng 8/2005 “ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ” Hội đồng hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Ngọc Tuân BSTY Bùi Thị Thu Trang Đề tài thực nhằm xác định gen độc lực stx1, stx2, eae, hly, lt-I, sta, stb, vt2e vi khuẩn E coli phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy bò, heo, bê mẫu bề mặt thịt bò kỹ thuật multiplex – PCR Ghi nhận khuẩn lạc hồng mơi trường MAC; SMAC có loại: khuẩn lạc hồng khuẩn lạc trắng; khuẩn lạc trắng CT-SMAC Mỗi nhóm chọn khoảng – 10 khuẩn lạc riêng lẻ Ly trích DNA theo nhóm khuẩn lạc khuẩn lạc riêng lẻ theo phương pháp nhiệt Kết multiplex - PCR ghi nhận sau: (1) Nhóm khuẩn lạc có mang gen độc lực chưa khuẩn lạc riêng lẻ có mang gen độc lực (2) Tần số phát gen độc lực E coli từ mẫu phân tiêu chảy là: 25% phân bò tiêu chảy (stx2, hly), 30% phân bê tiêu chảy (stx1, stx2, hly, eae), 88,89% phân heo tiêu chảy (stb, lt, vt2e, hly, stx1, eae) Điều chứng tỏ nhóm đối tượng trên, E coli mang gen độc lực nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy (3) mẫu bề mặt thịt bò chưa phát gen độc lực E coli (4) Chưa phát gen sta E coli phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy bò, bê heo SUMMARY “Apply multiplex – PCR to detect some virulence genes of Escherichia coli isolated from diarrhea cattle and swine faeces, beef” The study was carried out to detect stx1, stx2, eae, hly, lt-I, sta, stb, vt2e genes of isolated E coli from 27 diarrhea stools samples of cattles, calves, piglets, and swabs of the beef surface by multiplex – PCR Observation had one group of pink colony on MAC, white colony on SMAC, pink colony on SMAC, white colony on CT-SMAC Each colony group was chosen about – 10 separate colonies DNA of the colony groups and each separate colony were extracted by heat method The results of multiplex – PCR were showed that: (1) The colony group has virulence genes, the separate colony does or doesn’t have the genes (2) Frequency of virulence genes of isolated E coli from diarrhea stools samples was 25% from cattles (stx2, hly), 30% from calves (stx1, stx2, eae, hly), 88,89% from piglets (stb, lt-I, vt2e, hly, stx1, eae) (3) swabs of the beef surface were detected that non virulence genes of E coli (4) Sta gene of E coli isolated from 27 diarrhea cattle, calf, piglet stools samples weren’t detected MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Summary v Mục lục .vi Danh sách chữ viết tắt .viii Danh sách hình x Danh sách bảng xi ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN 2.1 Vi khuẩn E coli 2.1.1 Định nghĩa 2.1.2 Nuôi cấy đặc điểm sinh hóa 2.1.3 Yếu tố kháng nguyên 2.1.4 Cơ chế chung khả gây tiêu chảy E coli 2.1.5 Phân loại E coli 2.1.5.1 Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC 2.1.5.2 Nhóm EPEC .7 2.1.53 Nhóm ETEC 2.2 Kỹ thuật PCR 11 2.2.1 Nguyên tắc 11 2.2.2 Các giai đoạn phản ứng PCR .12 2.2.3 Các thành phần phản ứng PCR 14 2.2.4 Phân tích kết PCR 15 2.2.5 Những ứng dụng PCR 15 2.2.5.1 PCR sử dụng để nghiên cứu lượng DNA nhỏ 15 2.2.5.2 PCR sử dụng chẩn đoán lâm sàng 16 2.2.5.3 PCR dùng để khuếch đại RNA .16 2.2.5.4 PCR sử dụng để so sánh genome khác 17 2.2.6 Các hạn chế PCR 17 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 Thời gian địa điểm thực 19 3.2 Nội dung .19 3.3 Phương pháp nghiên cứu 19 3.3.1 Lấy mẫu .19 3.3.2 Nuôi cấy, phân lập ly trích DNA vi khuẩn E coli 20 3.3.3 Xác định gen stx1, stx2, eae, hly, stx2e, sta, stb, lt-I E coli phân lập 3.3.4 Điện di gel aragose đọc kết điện di 25 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Kết phân nhóm khuẩn lạc xác định E coli từ khuẩn lạc phân lập 27 4.1.1 Các loại khuẩn lạc môi trường thạch MAC, SMAC, CT-SMAC 27 4.1.2 Xác định E coli cho khuẩn lạc chọn 27 4.2 Kết phát gen độc lực E coli phân lập từ phân bò tiêu chảy 28 4.3 Kết phát gen độc lực E coli phân lập từ phân heo tiêu chảy 32 4.4 Kết phát gen độc lực E coli phân lập từ phân bê tiêu chảy 36 4.5 Kết phát gen độc lực E coli phân lập từ mẫu bề mặt thịt bò 38 4.6 Tổng kết kết phát gen độc lực E coli mẫu khảo sát 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .41 5.1 Kết luận 41 5.2 Đề nghị .41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 46 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A/A : Aggregative adhesion A/E : Attaching and effacing CF : Colonization factor CFA : Colonization factor antigen CT : Cholera toxin CT-SMAC :Cefixime Tellurite Sorbitol MacConkey agar DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate eae : E coli attaching and effacing EaggEC = EAEC : Enteroaggregative E coli EHEC : Enterohaemorrhagic E coli EIEC : Enteroinvasive E coli EMB : Eosin methylen blue agar EPEC : Enterophathogenic E coli ETEC : Enterotoxigenic E coli FAO : Food and Agriculture Organization HC : Haemorrhagic colitis Hly : Haemolysin HM : Khuẩn lạc hồng môi trường MAC HS : Khuẩn lạc hồng môi trường SMAC HUS : Haemolytic uraemic syndrome IMViC : Indol, Methyl Red, Voges - Proskauer, Simmon Citrate LEE : Locus of enterocyte effacement LT : Heat labile toxin MAC : MacConkey agar NA : Nutrient agar PCR : Polymerase chain reaction SMAC : Sorbitol MacConkey agar ST : Heat stable toxin STEC : Shiga toxin-producing E coli Stx : Shiga toxin TBE : Tris borate EDTA TC : Khuẩn lạc trắng môi trường CT-SMAC TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam Tir : Translocated intimin receptor Tm : Melting temperature TS : Khuẩn lạc trắng môi trường SMAC UV : Ultra violet VT : Verotoxin VTEC : Verotoxigenic E coli 10 DANH SÁCH CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ HÌNH TRANG Hình 2.1 Ngun lý phản ứng PCR 13 Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt độ phản ứng PCR .14 Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm multiplex - PCR1 26 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm multiplex - PCR2 26 SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1 Phân lập, xác định E coli phát gen độc lực 22 BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 Tổng kết kết phát gen độc lực E coli mẫu khảo sát 40 49 Bảng 4.6 Kết phát gen độc lực nhóm khuẩn lạc đại diện cho E coli mẫu bề mặt thịt bò Mẫu stx1 Tổng Tỷ lệ (%) stx2 0 Gen độc lực hly lt 0 0 eae 0 sta 0 stb 0 vt2e 0 Qua bảng 4.6, kết phát gen độc lực stx1, stx2, eae, hly, lt, sta, stb, vt2e từ nhóm khuẩn lạc TC phân lập từ mẫu bề mặt thịt bị âm tính Kết giải thích sau: - Có thể số mẫu xét nghiệm - Do quy trình giết mổ đảm bảo vệ sinh - Do mẫu xét nghiệm âm tính thật bị lấy mẫu khơng mang dịng E coli gây độc 4.6 Tổng kết kết phát gen độc lực E coli mẫu khảo sát Với 36 mẫu khảo sát gồm mẫu phân bò tiêu chảy, mẫu phân heo tiêu chảy, 10 mẫu phân bê tiêu chảy, mẫu bề mặt thịt bò, tổng kết kết phát gen độc lực E coli mẫu khảo sát trình bày bảng 4.7 biểu đồ 4.1 Bảng 4.7 Tổng kết kết phát gen độc lực E coli mẫu khảo sát Gen độc lực Mẫu Phân bò tiêu chảy Phân heo N (% ) n stx1 stx eae hly lt-I sta stb vt2e 2 0 0 25 25 12,5 0 0 1 50 tiêu chảy (%) 88,89 11,1 11,1 22,2 55,5 1 0 66,6 33,3 0 10 3 tiêu chảy (%) Bề mặt 30 30 10 10 10 0 0 0 0 (%) 36 13 11,1 13,8 0 16,6 36,1 8,3 % 11,1 Phân bê thịt bò Tổng 5,56 N: Số lượng mẫu khảo sát n: Số lượng mẫu phát E coli có mang gen độc lực 8,33 51 Biểu đồ 4.1 Tổng kết kết phát gen độc lực E coli mẫu khảo sát Như vậy, qua bảng 4.7 biểu đồ 4.1, 36 mẫu khảo sát gồm 27 mẫu có nguồn gốc từ bò (8 mẫu phân bò tiêu chảy, 10 mẫu phân bê tiêu chảy, mẫu bề mặt thịt bò), mẫu phân heo tiêu chảy Ở phân bò tiêu chảy phát E coli mang gen stx2 (25%) hly (12,5%) Ở phân bê tiêu chảy, phát E coli mang gen stx1 (30%), stx2 (10%), eae (10%), hly (10%) Như mẫu khảo sát có nguồn gốc từ bị phát nhóm STEC Điều hợp lí so với kết nghiên cứu Beutin ctv (1993) Ông cho phân bò nguồn lưu cữu chủ yếu nhóm STEC Ở phân heo tiêu chảy, phát E coli mang gen stb (66,67%), lt-I (55,56%), vt2e (33,33%), hly (22,22%), stx1 (11,11%), eae (11,11%) Như vậy, phân heo tiêu chảy phát E coli nhóm STEC ETEC 52 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thu nhận trình thực đề tài, rút kết luận sau: (1) E coli môi trường thạch MAC xuất loại khuẩn lạc hồng (HM), môi trường thạch SMAC xuất loại khuẩn lạc trắng (TS) hồng (HS), môi trường thạch CT-SMAC xuất loại khuẩn lạc trắng (2) Nhóm khuẩn lạc có mang gen độc lực chưa khuẩn lạc riêng lẻ có mang gen độc lực (3) Tần số phát gen độc lực E coli từ mẫu phân tiêu chảy là: 25% phân bò tiêu chảy (stx2, hly), 30% phân bê tiêu chảy (stx1, stx2, hly, eae), 88,89% phân heo tiêu chảy (stb, lt, vt2e, hly, stx1, eae) (4) Điều chứng tỏ nhóm đối tượng trên, E coli mang gen độc lực nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy (5) mẫu bề mặt thịt bò chưa phát vi khuẩn E coli mang gen độc lực (6) Chưa phát gen sta E coli phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy bò, bê heo 5.2 Đề nghị (1) Có thể ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát gen độc lực dòng E coli gây bệnh, góp phần chẩn đốn bệnh cho gia súc người, kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm (2) Tăng số lượng mẫu khảo sát, định serotype kháng huyết chuẩn (antisera) 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998 Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo dục Thành phố Hồ Chí Minh Lê Thị Mai Khanh, 2004 Phát số gen độc lực Escherichia coli phân lâp từ phân thịt bò, heo kỹ thuật multiplex – PCR Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp Trường đại học Nông Lâm TP HCM Trần Thanh Phong, 1996 Bệnh truyền nhiễm vi trùng heo Tủ sách Trường Đại học Nơng Lâm TP HCM TIẾNG NƯỚC NGỒI Barrett T J., Kaper L B., Jerse A E., and Wachsmuth I K., 1992 Virulence factors in Shiga-like toxin producing Escherichia coli isolated from humans and cattle J Infect Dis 165: 970-980 Bertschinger H U and Fairbrother J M.,1999 Escherichia coli infections In Diseases of swine (Eds B E Straw, S D’ Allaire, W L Mengeling, and D J Taylor) Iowa State University Press, Iowa, USA Beutin L., Montenegro M A., Orskov I., Orskov F., Prada J., Zimmermann S., and Stephan R., 1989 Close association of verotoxin (shiga-like toxin) producing Escherichia coli J Clin Microbiol 27:2559-2564 Beutin L., Geier D., Steinruck S., Zimmermann S., and Scheutz F., 1993 Prevalence and some properties of verotoxin (Shiga-like-toxin)-producing Escherichia coli in seven different species of healthy domestic animals J Clin Microbiol 31:2483-2488 Beutin L., Aleksic S., Zimmermann S., and Scheutz F., 1994 Virulence factors and phenotypic traits of verotoxigenic Escherichia coli isolated from human patients in Germany Med Microbiol Immunol (Berlin) 183:13-21 Beutin L., Geier D., Zimmermann S., and Karch H., 1995 Virulence markers of Shiga like toxin producing Escherichia coli strains originating from healthy domestic animals of different species J Clin Microbiol 33:631-635 10 Black R E., Merson H M., Huq I., Aleim A R M., and Yunus N., 1981 Incidence and severity of rotavius and Echerichia coli in rural Banglades Lancet I:141-143 54 11 Blanco M., Blanco J E., Gonzalez E A., Mora A., Jansen W., Gomes T A T., Zerbini L F., Yano T., de Castro A F P., and Blanco J., 1997 Gene coding for enterotoxins and Verotoxins in Porcine Escherichia coli strains belonging to different O:K:H serotype: relationship with phenotype J Clin Microbiol 35:2958-2963 12 Botteldoorn N., Heydrick M., Rijpens N., Herman L., 2003 Detection and characterization of verotoxigenic Escherichia coli by a VTEC/EHEC multiplex – PCR in porcine faeces in pig carcass swabs Res Microbiol 154:97-104 13 Brown T A., 1994 Gene cloning and introduction 3rd edition UMIST, Manchester, UK 14 Butler D., 1996 Novel pathogens beat food safety check Nature 384:397 15 Calderwood S B., Acheson D W K., Keuch G T., Barrett T J., Griffin P M., Strockbine N A., 1997 Proposed new nomenclature for SLT (VT) family ASM News 1997:118-119 16 Cebula T A., Payne W L., and Fegn P., 1995 Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype 0157:H7 and their Shiga-like toxin type by Mismatch amplification mutation assay multiplex – PCR J Clin Microbiol 33:28-250 17 Cerna J F., Nataro J P, and Garcia T E., 2003 Multiplex – PCR for detection of three plasmid borne genes of enteroaggregative Escherichia coli strains J Clin Microbiol 42:2138-2140 18 Chalmers R M., Salmon R L., Willshaw G A., Cheasty T., Looker N., Davies I., and Wray C., 1997 Verocytotoxin-producing Escherichia coli O157 in a famer handling horses Lancet 349:1816 19 Chapman P A., and Siddons C A., Cerdan Malo A T., and Harkin M A., 1997 A – year study of Escherichia coli in cattle, sheep, pigs and poultry Epidemiol Infect 119:245-250 20 Cocolin L., Manzano M., Cantoni C., Comi G., 2000 A multiplex-PCR method to detect enterohemorrhagic (EHEC) and enteropathogenic (EPEC) Escherichia coli in arttificially contaminated foods Int J Hyg Environ Health 203:159-164 21 DesRosiers A., Fairbrother J M., Johnson R P., Desautels C., Letellier A Qeessy S., 2001 Phenotypic and genotypic characterization of Escherichia coli verotoxin-producing isolates from humans and pigs J Food Protect 64:1904-1911 55 22 Donnenberg M S., Tzipori S., McKee M L., O Brien A D., Alroy J., and Kaper J B., 1993 The role of the eae gene of enterohemorrhagic Escherichia coli in intimate attachment in vitro and in a porcine model J Clin Invest 92:1418-1424 23 FAO, 1992 Microbiological analysis in the food control laboratory 24 FDA, 2002 “Diarrheagenic Escherichia coli”, Bacteriological Analytical manual Online, CFSAN September 2002