ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - NGUYỄN VĂN TUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC THÁI NGUYÊN- 2009 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - NGUYỄN VĂN TUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Quyền Đình Thi Thực tại: Viện Công nghệ Sinh họcViện Khoa học Công nghệ Việt Nam THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN! Trƣớc hết xin gửi lời cảm Sâu sắc tới TS Quyền Đình Thi, Trƣởng phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Phó viện trƣởng Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn thí nghiệm, sửa luận văn tạo điều kiện hoá chất nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học giúp đỡ tận tình suốt trình làm luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Sinh học, Khoa Sau đại học, trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên thầy cô giáo nhiệt tình giảng dạy tạo điều kiện cho hoàn thành khoá học Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ môn Hoá- Sinh học, Ban chủ nhiệm khoa Khoa học Cơ bản, Trƣờng đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện cho học Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn ngƣời thân gia đình bạn bè giúp đỡ động viên suốt thời gian học tập Thái Nguyên tháng năm 2009 Học viên Nguyễn Văn Tuân Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CÁC CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium persulphate BSA Bovine serum albumin CMC Carboxyl methyl cellulose cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid DEAE Diethylaminoethyl ĐC Đối chứng EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid IU International unit kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria and Bertani M Marker Nxb Nhà xuất OD Optical density PCR Polymerase chain reaction rRNA Ribosome ribonucleic acid SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TBE Tris base-Boric acid-EDTA TE Tris-EDTA v/v Volume/volume w/v Weight/volume Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE 1.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE 1.2.1 Nguồn gốc 1.2.2 Phân loại 1.3 CẤU TRÚC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 1.3.1 Cấu trúc bậc 1.3.2 Cấu trúc không gian 1.3.3 Cấu trúc trung tâm xúc tác vùng liên kết chất 1.4 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 11 1.5 ỨNG DỤNG CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 12 1.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm 12 1.5.2 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc 13 1.5.3 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu 15 1.5.4 Trong công nghiệp sản xuất giấy bột giấy 15 1.5.5 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa 16 1.5.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh 16 1.6 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE 17 1.7 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 20 1.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN Ở VIỆT NAM 22 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 25 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 25 2.1.1 Chủng nấm 25 2.1.2 Thiết bị thí nghiệm 25 2.1.3 Hóa chất 26 2.1.4 Môi trƣờng 26 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.1.5 Dung dịch đệm 27 2.2 PHƢƠNG PHÁP 28 2.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật 28 2.2.2 Xác định hoạt tính endoglucanase 28 2.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng số yếu tố lên khả sinh tổng hợp endoglucanase 30 2.2.4 Tinh enzyme 32 2.2.5 Điện di SDS-PAGE 33 2.2.6 Xác định tính chất lý hóa endoglucanase 34 2.2.7 Xác định hàm lƣợng protein tổng số 35 2.2.8 Các phƣơng pháp sinh học phân tử 36 2.2.9 Xử lý số liệu 41 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE CAO 42 3.1.1 Tuyển chọn 42 3.1.2 Phân loại chủng nấm sợi dựa vào phân đoạn gene 28S rRNA 43 3.2 TỐI ƢU CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE 45 3.2.1 Khả sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian 45 3.2.2 Nhiệt độ nuôi cấy 47 3.2.3 Ảnh hƣởng nồng độ chất cảm ứng 48 3.2.4 Ảnh hƣởng nguồn carbon nồng độ nguồn carbon 50 3.2.5 Ảnh hƣởng nguồn nitrogen nồng độ nguồn nitrogen 52 3.2.6 pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu 54 3.3 TINH SẠCH ENDOGLUCANASE 55 3.3.1 Tinh qua cột sắc ký lọc gel sephadex G-100 55 3.3.2 Tinh qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE 56 3.4 NHỮNG TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDOGLUCANASE 57 3.4.1 Ảnh hƣởng nồng độ chất 57 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.4.2 Nhiệt độ phản ứng tối ƣu 58 3.4.3 pH phản ứng tối ƣu 60 3.4.4 Độ bền nhiệt độ 61 3.4.5 Độ bền pH 63 3.4.6 Ảnh hƣởng dung môi hữu 64 3.4.7 Ảnh hƣởng ion kim loại 65 3.4.8 Ảnh hƣởng số chất tẩy rửa 67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHỤ LỤC 79 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các thiết bị đƣợc sử dụng thí nghiệm 25 Bảng 2.2 Danh sách hóa chất đƣợc sử dụng thí nghiệm 26 Bảng 2.3 Danh sách dung dịch đệm sử dụng thí nghiệm 27 Bảng 2.4 Thành phần gel điện di biến tính protein 33 Bảng 3.1 Hoạt tính endoglucanase 26 chủng A awamori 43 Bảng 3.2 Trình tự nucleotide đoạn gene 28S rRNA chủng A awamori VTCC-F-099 79 Bảng 3.3 Khả sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian 79 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy 80 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng nồng độ chất cảm ứng 80 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng nguồn carbon 50 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng nồng độ lõi ngô 80 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng nguồn nitrogen 52 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng nồng độ ammonium acetate 81 Bảng 3.10 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu 81 Bảng 3.11 Hoạt tính endoglucanase phân đoạn qua cột Sephadex G-100 81 Bảng 3.12 Hoạt tính endoglucanase phân đoạn qua cột sắc ký DEAE 82 Bảng 3.13 Tóm tắt trình tinh endoglucanase từ chủng A awamori VTCC-F-099 57 Bảng 3.14 Ảnh hƣởng nồng độ chất đến hoạt tính endoglucanase 82 Bảng 3.15 Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính endoglucanase 82 Bảng 3.16 Ảnh hƣởng pH hỗn hợp phản ứng đến hoạt tính endoglucanase 83 Bảng 3.17 Độ bền nhiệt độ endoglucanase 83 Bảng 3.18 Độ bền pH endoglucanase 84 Bảng 3.19 Độ bền pH theo thời gian endoglucanase 85 Bảng 3.20 Ảnh hƣởng dung môi hữu đến hoạt tính endoglucanase 86 Bảng 3.21 Ảnh hƣởng ion kim loại 66 Bảng 3.22 Ảnh hƣởng số chất tẩy rửa đến hoạt tính endoglucanase 86 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ thủy phân liên kết -1,4-O-glucoside cellulase Hình 1.2 Trình tự amino acid tƣơng ứng với cấu trúc bậc Cel12A từ số chủng vi sinh vật Hình 1.3 Mô hình cấu trúc không gian (A); Sơ đồ trung tâm xúc tác (B) Cel12A từ H grisea Hình 1.4 Cấu trúc vùng CBD Cel12A từ Humicola grisea 10 Hình 1.5 Cơ chế thủy phân phân tử cellulose (A) phức hệ cellulose (B) enzyme thuộc phức hệ cellulase 11 Hình 2.1 Đƣờng chuẩn nồng độ glucose 30 Hình 2.2 Quy trình tinh endoglucanase từ chủng A awamori VTCC-F-099 33 Hình 2.3 Đƣờng chuẩn Bradford dùng BSA làm chuẩn 36 Hình 3.1 Hoạt tính endoglucanase 26 chủng A awamori nghiên cứu 42 Hình 3.2 Điện di đồ DNA tổng số (A); Sản phẩm PCR (B): với khuôn DNA tách chiết từ chủng A awamori VTCC-F-099; Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp XbaI XhoI (C) 44 Hình 3.3 Cây phân loại chủng A awamori VTCC-F-099 45 Hình 3.4 Khả sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian chủng A awamori VTCC-F-099 46 Hình 3.5 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp endoglucanase chủng A awamori VTCC-F-099 48 Hình 3.6 Ảnh hƣởng nồng độ CMC đến khả sinh tổng hợp endoglucanase chủng A awamori VTCC-F-099 49 Hình 3.7 Ảnh hƣởng nồng độ lõi ngô đến khả sinh tổng hợp endoglucanase chủng A awamori VTCC-F-099 51 Hình 3.8 Ảnh hƣởng nồng độ ammonium acetate đến khả sinh tổng hợp endoglucanase chủng A awamori VTCC-F-099 53 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.9 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp endoglucanase chủng A awamori VTCC-F-099 54 Hình 3.10 Điện di đồ gel polyacrylamide sản phẩm tinh endoglucanase từ chủng A awamori VTCC-F-099 qua cột Sephadex G-100 56 Hình 3.11 Điện di đồ sản phẩm tinh endoglucanase gel polyacrylamide 57 Hình 3.12 Ảnh hƣởng nồng độ chất lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A awamori VTCC-F-099 58 Hình 3.13 Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A awamori VTCC-F-099 60 Hình 3.14 Ảnh hƣởng pH phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A awamori VTCC-F-099 61 Hình 3.15 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên độ bền endoglucanase từ chủng A awamori VTCC-F-099 62 Hình 3.16 Ảnh hƣởng pH tới độ bền endoglucanase từ chủng A awamori VTCC-F-099 63 Hình 3.17 Ảnh hƣởng pH tới độ bền endoglucanase từ chủng A awamori VTCC-F-099 theo thời gian 64 Hình 3.18 Ảnh hƣởng dung môi hữu lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A awamori VTCC-F-099 65 Hình 3.19 Ảnh hƣởng chất tẩy rửa lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A awamori VTCC-F-099 68 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Cellulose thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào thực vật Đó loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp Việc phân hủy cellulose tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hƣởng đến tốc độ nhiều trình sản xuất công nghiệp Endo-β-1,4-glucanase (3.2.1.4) ba loại enzyme thuộc hệ enzyme thủy phân cellulose (cellulase) Enzyme tham gia phân cắt ngẫu nhiên liên kết β-1,4 glucoside từ bên phân tử cellulose số loại polysaccharide tƣơng tự khác tạo thành oligosaccharide Endo-β-1,4-glucanase đƣợc sản xuất nhiều loại vi sinh vật nhƣ vi khuẩn, nấm men, nấm mốc Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase có thực vật, động vật nguyên sinh số loài động vật không xƣơng sống khác Các enzyme có nguồn gốc khác có cấu trúc khác Điều dẫn tới khác hoạt tính xúc tác điều kiện phản ứng tối ƣu enzyme Hiện nay, việc sử dụng enzyme nhƣ endo-β-1,4-glucanase số ngành công nghiệp nhƣ: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, bột giặt, sản xuất dung môi hữu xử lý môi trƣờng quan trọng, mang lại nhiều giá trị to lớn Tuy nhiên, enzyme chế phẩm có liên quan đƣợc sử dụng ngành công nghiệp Việt Nam số nƣớc chủ yếu đƣợc nhập từ nƣớc với giá thành cao Vì thế, việc nghiên cứu, sản xuất chế phẩm enzyme có nguồn gốc tự nhiên đòi hỏi cấp thiết nhiều quốc gia giới có Việt Nam Nƣớc ta nƣớc sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme nhƣ endo-β-1,4-glucanase phong phú Xuất phát từ lý Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn tình hình nghiên cứu Việt Nam, tiến hành thực đề tài: “Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase đánh giá tính chất lý hóa endo-β-1,4glucanase” với mục tiêu: (1) Tuyển chọn chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao tìm môi trƣờng nuôi cấy thích hợp để tạo endo-β-1,4-glucanase ngoại bào, (2) Tinh đƣợc endo-β-1,4glucanase đánh giá số tính chất lý hóa Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE Cellulase nhóm enzyme thủy phân có khả cắt mối liên kết -1,4-O-glucoside phân tử cellulose số chất tƣơng tự khác Đó phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác đƣợc xếp thành nhóm bản: endo-β-1,4-glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), exo-β-1,4-glucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) [30], [39] Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân chất theo chế định nhờ có phối hợp hoạt động enzyme mà phân tử chất đƣợc thủy phân hoàn toàn tạo thành sản phẩm đơn giản Endo-β-1,4-glucanase loại enzyme tham gia xúc tác phản ứng thủy phân liên kết β-1,4 glucoside bên phân tử cellulose số chất tƣơng tự khác thành sản phẩm đơn giản (các oligosaccharide) Hình 1.1 Sơ đồ thủy phân liên kết -1,4-O-glucoside cellulase Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE 2.2.1 Nguồn gốc Endo-β-1,4-glucanase đƣợc tổng hợp từ nhiều nguồn khác tự nhiên, chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật Trong tự nhiên có nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc số loại nấm men có khả sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase Nấm mốc đối tƣợng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh Nhiều chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Phanerochaete đƣợc nghiên cứu có khả sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ: Aspergillus niger [25], [26], A flavus, A fumigatus [27] A terreus [29] Trichoderma reesei [53], Penicillium persicinum, P brasilianum [33], Penicillium sp [10], Phanerochaete chrysosporium [34] Bên cạnh nấm mốc, vi khuẩn đƣợc xem đối tƣợng có khả sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase phong phú Nhiều loài vi khuẩn hiếu khí đƣợc nghiên cứu có khả sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ Acidothemus cellulobuticus [22], Bacillus pumilis [32], Cellulomonas flavigena, C udai [20], [21], Pseudomonas fluoressens [42] Không có vi khuẩn hiếu khí mà số vi khuẩn kỵ khí có khả sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ Clostridium [57] Nhiều chủng xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces, Streptomyces có khả sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ: Actinomyces griseus [13], Streptomyces reticuli [61] Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase đƣợc sinh tổng hợp thực vật Arabidopsis [23], động vật nguyên sinh số động vật không xƣơng sống khác nhƣ mối [62], động vật thân mềm nhƣ Mytilus edulis [63] Trong số nguồn sinh enzyme vi sinh vật đƣợc xem nguồn cung cấp enzyme với nhiều ƣu điểm bật có tính chất độc đáo vƣợt xa so với enzyme có nguồn gốc từ động vật, thực vật Vì thế, chúng đƣợc sử dụng rộng rãi trình sản xuất chế phẩm enzyme Trƣớc hết, vi sinh vật nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với số lƣợng lớn Đây nguồn nguyên liệu mà ngƣời chủ động tạo đƣợc Chu kỳ sinh trƣởng vi sinh vật ngắn (từ 16-100 giờ) Vi sinh vật sinh trƣởng, phát triển với tốc độ nhanh chóng, khối lƣợng lại nhỏ, kích thƣớc bé, nhƣng tỷ lệ enzyme tế bào tƣơng đối lớn nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao Hơn nữa, enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính mạnh, vƣợt xa sinh vật khác Đối với số trƣờng hợp dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồn enzyme Vi sinh vật nhạy cảm tác động môi trƣờng, thành phần dinh dƣỡng nuôi chúng nhƣ số tác nhân lý hóa, học khác Do thay đổi điều kiện nuôi cấy để chọn chủng cho hàm lƣợng enzyme đáng kể với hoạt tính xúc tác cao Có thể nói rằng, với vi sinh vật, ngƣời ta điều khiển tổng hợp enzyme dễ dàng đối tƣợng khác để tăng lƣợng enzyme đƣợc tổng hợp tổng hợp định hƣớng enzyme Tuy vậy, trình chọn nguồn nguyên liệu từ vi sinh vật, cần lƣu ý số vi sinh vật có khả sinh độc tố để có biện pháp xử lý thích hợp Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.2 Phân loại Theo Ủy ban danh pháp Hiệp hội Hóa sinh Sinh học phân tử Quốc tế, cellulase thuộc lớp (hydrolase): enzyme xúc tác phản ứng thủy phân, tổ (glycosidase): thủy phân liên kết glycoside, nhóm 1: thủy phân liên kết O- S-glycoside (International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 1992; http://afmb.cnrs-mrs.fr/ pedro/CAZY/db.html) Cellulase phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác Tùy theo quan điểm tác giả mà enzyme thuộc phức hệ cellulase đƣợc xếp thành nhóm khác Trƣớc đây, cellulase đƣợc chia làm hai nhóm: nhóm enzyme C1 nhóm enzyme Cx Các enzyme C1 có khả thủy phân sợi cellulose tự nhiên, có tính đặc hiệu không rõ ràng Các enzyme Cx đƣợc chia thành hai loại: exo -1,4-glucanase (3.2.1.21) xúc tác cho phản ứng cắt đứt gốc glucose từ đầu không khử chuỗi cellulose; endo -1,4-glucanase (3.2.1.4) hoạt động tùy tiện hơn, xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết bên phân tử cellulose [7] Hiện nay, cellulase đƣợc chia làm ba dạng: dạng endoglucanase 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase hay carboxylmethylcellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), dạng exoglucanase bao gồm 1,4--D-glucan glucanohydrolase (còn gọi cellodextrinase) (EC 3.2.1.74) 1,4--D-glucan cellobiohydrolase (cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91), dạng -glucosidase -glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) Endoglucanase xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết bên phân tử cellulose Exoglucanase thủy phân liên kết đầu khử đầu không khử phân tử cellulose -glucosidase thủy phân phân tử cellodextrin cellobiose thành glucose [30], [39], [45] Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Các cellulase có nguồn gốc khác đƣợc xếp thành họ Trƣớc đây, dựa vào cấu trúc bậc phân tử protein enzyme, cellulase đƣợc chia làm họ: A, B, C, D, E F [35] Sau đó, cellulase đƣợc chia thành họ: A, B, C, D, E, F, G, H I dựa vào cấu trúc tâm xúc tác [31] Hiện nay, cellulase đƣợc xếp 12 họ: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 44, 45, 48, 61 74 [45] 2.3 CẤU TRÚC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 2.3.1 Cấu trúc bậc Endoglucanase từ nguồn gốc khác có thành phần cấu tạo cấu trúc khác Sự khác thể trƣớc hết đa dạng khối lƣợng phân tử, thành phần trật tự xếp amino acid chuỗi polypeptide Chủng A oryzae KBN616 có khả sinh tổng hợp hai loại endoglucanase Cel A Cel B Phân tử protein Cel A gồm 239 amino acid, trọng lƣợng phân tử 31 kDa, đƣợc xếp vào họ cellulase H Trong đó, Cel B đƣợc xếp vào họ cellulase C với chiều dài 416 amino acid khối lƣợng phân tử 53 kDa [43] Phân tử endoglucanase từ A aculeatus bao gồm 410 amino acid với khối lƣợng phân tử khoảng 43,7 kDa [59] Các endoglucanase từ chủng A niger Z10 có khối lƣợng phân tử 83 kDa 50 kDa [25], từ A terreus 25 kDa [29], từ Trichoderma reesei 48 kDa 55 kDa [40], [47], từ Bacillus sp D04 có khối lƣợng 35 kDa [56] Sandgren cs (2003) có nghiên cứu chi tiết cấu trúc Cel12A thuộc họ 12 (GH 12) endoglucanase từ nấm chịu nhiệt Humicola grisea Cel12A H grisea chuỗi polypeptide gồm 224 amino acid cấu tạo nên chuỗi ,  vùng nối (Hình 1.2) [55] Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 1.2 Trình tự amino acid tƣơng ứng với cấu trúc bậc Cel12A từ số chủng vi sinh vật [55] Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3.2 Cấu trúc không gian Sự khác cấu trúc enzyme thể xếp không gian chuỗi polypeptide, trung tâm xúc tác vùng liên kết chất Chính nhờ khác cấu trúc không gian protein enzyme dẫn tới khác tính chất hóa lý chúng Phân tử Cel12A H grisea cấu tạo chuỗi , chuỗi  (A B) Chuỗi -A đƣợc cấu tạo dải xoắn  (A1-A6), chuỗi -B đƣợc cấu tạo dải xoắn  (B1-B9) Các dải xoắn  đƣợc nối với vùng nối, có vùng nối lớn 29-32, 40-47, 92-96, 165-169 nối tƣơng ứng dải xoắn : B2-A2, A2-A3, A5-B5 A6-B7 (Hình 1.3A) [55] 2.3.3 Cấu trúc trung tâm xúc tác vùng liên kết chất Trung tâm xúc tác Cel12A từ H grisea gồm amino acid glutamic acid E-120 E-205 (Hình 1.3B), Cel12A từ Trichoderma reesei E-116 E-200 [55] Hình 1.3 Mô hình cấu trúc không gian (A); Sơ đồ trung tâm xúc tác (B) Cel12A từ H grisea [55] Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Vai trò liên kết chất tham gia xúc tác thủy phân cellulose cellulase đƣợc thực nhờ vùng liên kết đặc hiệu cellulose bind domain (CBD) Các CBD nằm trung tâm hoạt động enzyme không Tùy thuộc vào loại enzyme mà vùng liên kết có cấu tạo hóa học cấu trúc không gian khác Cel12A H grisea có vùng liên kết với tham gia amino acid, cystein (C175, C206, C216) đóng vai trò trung tâm CBD1 với C175 làm trung tâm nằm dải xoắn -A6 liên kết yếu với amino acid T85, I123, A144, F173, I177, F180 tƣơng tác Van der Walls Liên kết amino acid CBD1 có kích thƣớc 3,5 đến 4,1 Å (Hình 1.4A) CBD2 với C206 làm trung tâm nằm dải xoắn -B4 liên kết với amino acid Q34, W52, W54, S63, P65, Y91, A98 T204 Liên kết amino acid CBD2 có kích thƣớc 3,3 đến 4,9 Å CBD2 chứa trung tâm hoạt động (Glu 205) (Hình 1.4B) CBD3 với C216 làm trung tâm nằm dải xoắn -A4 liên kết với amino acid W48, V87, W89, F214 F219 Liên kết amino acid CBD3 có kích thƣớc 3,3 đến 4,8 Å (Hình 1.4C) [55] Hình 1.4 Cấu trúc vùng CBD Cel12A từ Humicola grisea [55] Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... Tuyển chọn các chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp endo- β- 1 ,4 -glucanase cao và tìm môi trƣờng nuôi cấy thích hợp để tạo endo- β- 1 ,4 -glucanase ngoại bào, (2) Tinh sạch đƣợc endo- β- 1 ,4 glucanase và đánh giá một số tính chất lý hóa của nó Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO- β- 1 ,4 -GLUCANASE Cellulase... nhƣ endo- β- 1 ,4 -glucanase là rất phong phú Xuất phát từ những lý do Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 http://www.lrc-tnu.edu.vn trên và tình hình nghiên cứu tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp endo- β- 1 ,4 -glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của endo- β- 1 ,4 glucanase với các mục tiêu: (1) Tuyển chọn. .. khí cũng có khả năng sinh tổng hợp endo- β- 1 ,4 -glucanase mạnh nhƣ Clostridium [57] Nhiều chủng xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces, Streptomyces cũng có khả năng sinh tổng hợp endo- β- 1 ,4 -glucanase mạnh nhƣ: Actinomyces griseus [13], Streptomyces reticuli [61] Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 http://www.lrc-tnu.edu.vn Ngoài ra, endo- β- 1 ,4 -glucanase còn đƣợc sinh tổng hợp ở thực vật Arabidopsis... nấm mốc và một số loại nấm men có khả năng sinh tổng hợp endo- β- 1 ,4 -glucanase Nấm mốc là một trong những đối tƣợng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp endo- β- 1 ,4 -glucanase mạnh nhất Nhiều chủng nấm mốc thuộc các chi Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Phanerochaete đã đƣợc nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp endo- β- 1 ,4 -glucanase mạnh nhƣ: Aspergillus niger [25], [26], A flavus, A fumigatus [27]...  -1 ,4 -O-glucoside của cellulase Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO- β- 1 ,4 -GLUCANASE 2.2.1 Nguồn gốc Endo- β- 1 ,4 -glucanase có thể đƣợc tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật Trong tự nhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm men có khả năng sinh tổng hợp. .. F, G, H và I dựa vào cấu trúc của tâm xúc tác [31] Hiện nay, các cellulase đƣợc sắp xếp trong 12 họ: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 44 , 45 , 48 , 61 và 74 [45 ] 2.3 CẤU TRÚC CỦA ENDO- β- 1 ,4 -GLUCANASE 2.3.1 Cấu trúc bậc một Endoglucanase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc khác nhau Sự khác nhau đó thể hiện trƣớc hết ở sự đa dạng về khối lƣợng phân tử, thành phần và trật tự sắp xếp của các...  -1 ,4 -O-glucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tƣơng tự khác Đó là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau và đƣợc xếp thành 3 nhóm cơ bản: endo- β- 1 ,4 -glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase) (EC 3.2.1 .4) , exo -β- 1 ,4 -glucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và β- glucosidase hay β- D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) [30], [39] Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất. .. tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hƣởng đến tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp Endo- β- 1 ,4 -glucanase (3.2.1 .4) là một trong ba loại enzyme thuộc hệ enzyme thủy phân cellulose (cellulase) Enzyme này tham gia phân cắt ngẫu nhiên các liên kết β- 1 ,4 glucoside từ bên trong các phân tử cellulose và một số loại polysaccharide tƣơng tự khác tạo thành các oligosaccharide Endo- β- 1 ,4 -glucanase. .. Phanerochaete chrysosporium [ 34] Bên cạnh nấm mốc, vi khuẩn cũng đƣợc xem là một trong những đối tƣợng có khả năng sinh tổng hợp endo- β- 1 ,4 -glucanase khá phong phú Nhiều loài vi khuẩn hiếu khí đã đƣợc nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp endo- β- 1 ,4 -glucanase mạnh nhƣ Acidothemus cellulobuticus [22], Bacillus pumilis [32], Cellulomonas flavigena, C udai [20], [21], Pseudomonas fluoressens [42 ] Không chỉ có các... định và nhờ có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất đƣợc thủy phân hoàn toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất Endo- β- 1 ,4 -glucanase là loại enzyme tham gia xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết β- 1 ,4 glucoside ở bên trong các phân tử cellulose và một số cơ chất tƣơng tự khác thành các sản phẩm đơn giản hơn (các oligosaccharide) Hình 1.1 Sơ đồ thủy phân liên kết  -1 ,4 -O-glucoside