BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến cô giáo ThS Lưu Thúy Hòa, Viện Sinh – Nông, trường Đại học Hải Phòng Ban lãnh đạo Viện Sinh – Nông, trường Đại học Hải Phòng nhiệt tình bảo, giúp đỡ em nhiều tạo điều kiện thuận lợi trình thực tập Đồng thời em xin trân trọng cảm ơn thầy giáo, cô giáo cộng tác viên công tác Bộ môn thực vật, Bộ môn Hóa phân tích Trường đại học Dược Hà Nội Bộ môn Kỹ thuật di truyền Viện Di truyền nông nghiệp (thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) tạo điều kiện thuận lợi cho em thực công việc liên quan trình thực tập Cuối cùng, cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, đặc biệt ba mẹ bên động viên, khích lệ suốt trình thực tập Hải Phòng, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Hùng Cường BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường DANH MỤC BIỂU BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH Lớp: Công nghệ sinh học K13 BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Tính đa hình chiều dài phân đoạn nhân bản) cs Cộng DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotit triphotphat EDTA Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid Kb Kilobase PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RAPD Random Amplified Polymorphism DNA (Phân tích ADN đa hình nhân ngẫu nhiên) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Phân tích chiều dải phân đoạn ADN cắt hạn chế) SDS Sodium Dodecyl Sulphat SSR Simple Sequence Repeats STS Sequense Tagged Site TAE Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA Tris Trioxymetylaminometan CTAB Cetyl trimethylammonium bromide EtBr Ethidium bromide ISSRs Inter Simple Sequence Repeats rDNA Ribosomal DNA HPLC High Performance Liquid Chromatography BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 PHẦN MỞ ĐẦU 1.Đặt vấn đề Berberin alcaloid có nhân isoquilolin (Khosla, 1992; Rastogi cộng sự, 1993) Đó hoạt chất ứng dụng từ lâu đời y học truyền thống giới để chữa bệnh nước nghèo đặc tính kháng khuẩn, nấm, đơn bào (Đỗ Huy Bích, 2006), berberin sử dụng để chống lại Staphylococcus aureus kháng kháng sinh Methicillin (Yu HH cs, 2005),…và ngày có tiềm lớn điều trị bệnh phát triển hạ đường huyết (Wang Y cs 2010, Gu Y cs 2010 ), ung thư (Tang J cs 2009, Kim JB cs 2009, Pinto-Garcia L cs 2010) Trên giới xác định khoảng 150 loài thực vật bậc cao có berberin, thuộc 23 chi họ, bao gồm: Na (Annonaceae), Hoàng liên (Berberidaceae), Cải cần (Fumariaceae), Tiết dê (Menispermaceae), Thuốc phiện (Papaveraceae), Mao lương (Ranunculaceae), Cam (Rutaceae), họ chủ yếu Berberidaceae, Menispermaceae, Papaveraceae, Ranunculaceae Rutaceae (Nguyễn Kim Cẩn, 2002) Họ Berberidaceae họ thực vật có hoa, bao gồm 15-17 chi thực vật có hoa Họ thuộc mao lương (Ranunculales) Họ phân bố vùng ôn đới phía bắc bán cầu (Judd cộng sự, 1999) Họ Berberidaceae chứa khoảng 570-700 loài, phần lớn (khoảng 450-600 loài) thuộc chi Berberis Các loài họ thân gỗ, bụi thân thảo có nguồn gốc từ vùng ôn đới cận nhiệt đới châu Âu, châu Á, châu Phi, Bắc Nam Mỹ (Ahrendt 1961) Ở Việt Nam, xác định có 26 loài thực vật thuộc họ khác chứa berberin Berberidaceae, Menispermaceae, Ranunculaceae, Rutaceae BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 Papaveraceae ( Nguyễn Kim Cẩn, 2002) Trong đó, thuộc họ Berberidaceae bị khai thác triệt để để làm thuốc buôn bán thị trường nước để làm thuốc (Hoàng liên, Hoàng liên ô rô,…) xuất qua Trung Quốc Điều dẫn dẫn đến cạn kiệt nguồn tài nguyên loài cho berberin Việt Nam trở thành thuốc quý ghi sách đỏ (Nguyễn Tiến Bân, 2007) Việc phân loại loài chi Berberis, Mahonia, Podophyllum họ Berberidaceae phức tạp với đặc điểm hình thái giống loài chi Sự phân biệt loài khó khăn phần trăm đa bội cao lai tạo (Cadic Decourtye 1987) Điều dẫn đến nhầm lẫn việc xác định loài thu hái, sử dụng Trên giới có nghiên cứu phân biệt loài chi mức độ phân tử số loài B asiatica Roxb, B aristata DC., B lycium Royle (Subramani Paranthaman Balasubramani cs, 2011; Vivek Tripathi cs, 2013, ), loài Podophyllum hexandrum (Md Afroz cs, 2009, Pradeep Kumar Naik cs, 2010; Akshay Nag cs, 2013) so sánh loài họ Berberidaceae (C Roß W Durka, 2006, Mehdi Rezaei cs, 2011) Việt Nam chưa có công trình nước nghiên cứu đánh giá, tư liệu hoá mức độ phân tử đa dạng di truyền tập đoàn cách sâu rộng có hệ thống Từ lý trên, việc nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền giống/loài cho berberin họ Hoàng liên mức phân tử cần thiết cấp bách để định hướng cho công tác thu thập, bảo tồn khai thác sử dụng nguồn gen địa quý cách có hiệu Mục đích nghiên cứu Xây dựng phương pháp nghiên cứu tối ưu nhằm phân tích đa dạng di truyền giống/loài Hoàng liên gai (berberidaceae) BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 Yêu cầu - Điṇh danh xác giống/loài Hoàng liên đăc c điểm hình thái - Xác định thị đặc trưng, alen nhận dạng xác giống/loài Hoàng liên gai ưu tú - Đánh giá khác biệt di truyền giống/loài Hoàng liên gai qua việc phân tích RAPD với primer ngẫu nhiên - Mô tả quan hệ di truyền phần mềm NTSYS BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.Vị trí phân loại khoa học Họ Hoàng mộc, gọi họ Hoàng liên gai (Berberidaceae), họ khoảng 14-15 chi thực vật có hoa Họ thuộc Mao lương (Ranunculales) Họ chứa khoảng 570-700 loài, phần lớn (khoảng 450-600 loài) thuộc chi Berberis Các loài họ loại thân gỗ, bụi thân thảo chủ yếu thường xanh Phân loại khoa học họ Berberidaceae hệ thống phân loại thực vật sau (Lê Đình Bích Trần Văn Ơn, 2007): Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae) Liên Hoàng liên (Ranunculanae) Bộ Hoàng liên (Ranunculales) Họ Hoàng liên gai (Berberidaceae) Các chi Achlys Berberis - hoàng liên gai (hoàng mù), hoàng mộc, tiểu bá, nghêu hoa Bongardia Caulophyllum - hồng mao thất Diphylleia - sơn hà diệp Dysosma - bát giác liên Epimedium - dâm dương hoắc Gymnospermium Jeffersonia - tiên hoàng liên BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 Leontice - mẫu đan (đơn) thảo, không nhầm với loài hoa mẫu đơn Mahonia - hoàng liên ô rô, thổ hoàng liên, thổ hoàng bá, thập đại công lao Nandina - nam thiên trúc Podophyllum - Podophyllum tonkinense bát giác liên, hay Podophyllum hexandrum bát giác liên sáu nhị Ranzania Vancouveria Đặc điểm thực vật phân bố họ Hoàng liên gai (Berberidaceae) 2.1 Đặc điểm chung họ Hoàng liên gai (Berberidaceae) Hoàng liên gai loại cỏ nhiều năm, bụi gỗ nhỏ, thừờng xanh rụng Thân có gai Lá đơn hay kép, mọc so le, đối mọc gốc Lá kèm có không Gân hình lông chim hình chân vịt Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 3, mọc thành cụm đơn độc Cụm hoa dạng chùm, bông, tán, xim, chùy Hoa có cuống không Lá bắc có không Đài 6-9, thường dạng cánh hoa, rời, xếp 2-3 vòng Tràng 6, rời Tuyến mật có không Nhị 6, đối diện tràng; bao phấn ô, mở van nứt dọc Bầu trên, nhìn bên có noãn; noãn nhiều, 1, đính noãn mép gốc; vòi nhụy có không, tồn Quả mọng, nang đại Hạt nhiều, nội nhũ phong phú 2.2 Đặc điểm thực vật chi Berberis Cây bụi thường xanh rụng Thân cành trơn nhẵn có lông măng, có rãnh không, có gai không, gai đơn chia làm 3-5 nhánh Lá đơn, mọc so le, mép có gai, nguyên hay Hoa đơn độc hay mọc thành cụm, dạng chùm, tán chùy Hoa màu vàng bóng, da cam, vàng đo đỏ, hay vàng nhạt, có vàng lục Hoa mẫu 3; bắc thường 3, sớm rụng, dạng vảy Đài 6, 9, màu vàng Tràng 6, 10 BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 *Kết phân tích với mồi OPO12 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi OPO12 thu tổng số 100 băng gồm 10 loại băng có 10 băng đa hình băng đơn hình Trên tổng số 16 mẫu giống nghiên cứu cho thấy xuất băng ADN từ khoảng 450bp đến 1300bp Ở mẫu xuất băng cá biệt vị trí có kích thước khoảng 1000bp Số băng ADN thu mẫu dao động từ băng đến băng Sử dụng mồi OPO12 nhận biết mẫu MH5 Mahonia sp Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPO12 1-3: Berberis sp, 4-14: Mahonia sp, 15-16: Podophyllum sp M: marker 1kb Bảng 4.3 Số băng ADN thu 16 mẫu giống nghiên cứu với mồi OPO12 Primer OPO12 Band BE1 BE2 BE3 MH1 MH2 MH3 MH4 MH5 MH6 MH7 MH8 MH9 MH10 MH11 PO1 PO2 1300 1 1 1 1 1 1 1 1200 1 1 1 1 1 1 1 1000 0 0 0 0 0 0 0 900 1 1 1 1 1 1 1 800 1 1 1 1 1 1 1 700 1 1 1 0 1 0 54 BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 600 1 1 1 1 1 1 1 500 1 1 0 0 0 0 0 450 1 1 1 1 1 1 1 *Kết phân tích với mồi BiO16 Qua kết phân tích RAPD, ghi nhận 10 sản phẩm khuếch đại, với mồi BiO16 không cho sản phẩm khuếch đại giống BE1, BE2 , MH3 MH5 Hình 4.4 Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR với mồi BiO16 1-3: Berberis sp, 4-14: Mahonia sp, 15-16: Podophyllum sp M: marker 1kb Bảng 4.4 Số băng ADN thu 16 mẫu giống nghiên cứu với mồi BiO16 Primer Band BE1 BE2 BE3 MH1 MH2 MH3 MH4 MH5 MH6 MH7 MH8 MH9 MH10 MH11 PO1 PO2 BiO16 900 0 0 0 0 0 1 800 0 0 0 0 0 0 700 0 0 0 0 0 0 600 0 1 0 0 0 0 0 500 0 1 0 1 0 0 450 0 0 0 1 0 0 400 0 0 0 0 0 0 300 0 0 0 1 0 0 55 BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 200 0 0 0 0 0 0 0 150 0 0 0 0 0 0 0 *Kết phân tích với mồi S285 Trong primer, nhận thấy Primer S285 có số băng khuếch đại thấp 16 mẫu berberidaceae ,tổng số băng khuếch đại 40,số băng đa hình 10, có xuất băng đồng hình kích thước 250 Hình 4.5 Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR với mồi S285 1-3: Berberis sp, 4-14: Mahonia sp, 15-16: Podophyllum sp M: marker 1kb *Kết phân tích với mồi S300 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi S300 thu tổng số 172 có tổng số loại băng cao với 15 băng có 13 băng đa hình băng đơn hình Trên tổng số 16 mẫu giống nghiên cứu cho thấy xuất băng ADN từ khoảng 250bp đến 3000bp 56 BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 Hình 4.6 Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR với mồi S300 1-3: Berberis sp, 4-14: Mahonia sp, 15-16: Podophyllum sp M: marker 1kb *Kết phân tích với mồi OPO2 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi OPO2 thu tổng số 97 băng gồm 14 loại băng có 14 băng đa hình băng đơn hình Trên tổng số 16 mẫu giống nghiên cứu cho thấy xuất băng ADN từ khoảng 250bp đến 2500bp Ở mẫu xuất băng cá biệt vị trí có kích thước khoảng 500bp Số băng ADN thu mẫu dao động từ băng đến 11 băng Sử dụng mồi OPO2 nhận biết mẫu MH10 Mahonia sp Hình 4.7 Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPO2 57 BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 1-3: Berberis sp, 4-14: Mahonia sp, 15-16: Podophyllum sp M: marker 1kb *Kết phân tích với mồi OPO1 Kết điện di sản phẩm PCR với mồi OPO1 thu tổng số 47 băng gồm loại băng có băng đa hình băng đơn hình Trên tổng số 16 mẫu giống nghiên cứu cho thấy xuất băng ADN từ khoảng 450bp đến 1500bp Xuất băng đồng hình kích thước 700bp Hình 4.8 Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPA1 1-3: Berberis sp, 4-14: Mahonia sp, 15-16: Podophyllum sp M: marker 1kb Bảng 4.5 Bảng thống kê phân tích đa hình PCR-RAPD 16 mẫu giống Hoàng liên gai Tổng số mồi PCR Tổng số mồi đa hình Tổng số băng khuyếch đại Tổng số loại băng Tổng số băng đa hình Tổng số băng đơn hình Tỉ lệ băng đa hình 58 50 29 2751 283 242 46 85,5% BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 Với 464 phản ứng PCR nhân lên tổng số 2751 băng ADN thuộc 283 loại băng khác (trung bình 9,8 băng/mồi), có 242 băng đa hình (85,5%) 46 băng đơn hình (14,5%) Các băng có kích thước khác dao động từ 250 bp đến 4000 bp Số băng nhân lên mồi khác Hai mồi OPN20, S300 nhân lên số băng nhiều 15 băng mồi OPN15, OPN17 nhân lên số băng băng (bảng 4.1) Số băng đa hình cao việc thiêt lập mối quan hệ di truyền xác Một số mồi có tất băng tỷ lệ băng đa hình cao (100%), điều chứng tỏ khác vùng ADN genome loài họ Hoàng liên gai Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) coi thước đo tính đa dạng di truyền alen locus (Smith cs (1997)) Theo Weir (1996) cho rằng, giá trị PIC hiểu đa dạng di truyền locus gen nghiên cứu Qua kết thu bảng 4.1 cho thấy rằng, giá trị PIC 29 mồi RAPD dao động khoảng 0,75 - 0,91 Hệ số PIC trung bình 29 mồi 16 mẫu giống Hoàng liên gai nghiên cứu cao 0,88 cho thấy băng ADN nhân lên đa dạng Phân tích đa dạng di truyền 16 mẫu giống Hoàng liên gai Kết RAPD thu gel điện di mã hóa thành dạng nhị phân phân tích phần mềm NTSYSpc để tính ma trận tương đồng cặp mẫu phân nhóm di truyền mẫu giống nghiên cứu Kết bảng 4.6 cho thấy, hệ số tương đồng di truyền 16 mẫu giống Hoàng liên gai dao động khoảng 0,43 đến 0,85 Mẫu giống BE1 (Berberis sp) PO2 (Podophyllum sp) có mức sai khác di truyền lớn (hệ số tương đồng 59 BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 di truyền nhỏ 0,43) Hai mẫu giống (MH10 – MH11) có hệ số tương đồng di truyền cao 0,85 Cả mẫu giống MH10, MH11 thuộc loài Hoàng liên (Mahonia sp), có chung nguồn gốc (Lâm Đồng) đứng gần phát sinh loài Bảng 4.6 Hệ số tương đồng di truyền 16 mẫu giống Hoàng liên gai BE BE MH MH BE MH MH MH MH MH1 MH MH MH MH1 PO BE1 1,00 BE2 1,00 MH2 0,47 0,4 0,76 1,00 MH1 0,49 0,77 0,81 1,00 BE3 0,44 0,74 0,80 1,00 MH3 0,49 0,78 0,5 0,61 0,57 0,53 1,00 MH4 0,48 0,74 0,79 0,81 0,73 0,60 1,00 MH5 0,46 0,72 0,74 0,77 0,76 0,57 0,76 1,00 MH6 MH1 0,73 0,76 0,78 0,71 0,60 0,78 0,78 1,00 0,74 0,80 0,80 0,77 0,57 0,78 0,77 0,81 1,00 MH8 0,47 0,4 0,4 0,74 0,78 0,78 0,72 0,55 0,77 0,71 0,74 0,81 1,00 MH9 0,46 0,71 0,77 0,83 0,73 0,59 0,81 0,73 0,79 0,83 0,84 1,00 MH7 MH1 0,49 0,68 0,78 0,81 0,69 0,64 0,79 0,69 0,77 0,79 0,75 0,84 1,00 0,44 0,72 0,76 0,78 0,73 0,57 0,77 0,73 0,76 0,85 0,73 0,80 0,78 1,00 PO1 0,44 0,74 0,79 0,76 0,73 0,55 0,78 0,70 0,75 0,80 0,79 0,78 0,72 0,78 1,00 PO2 0,43 0,70 0,76 0,73 0,67 0,53 0,75 0,67 0,73 0,76 0,75 0,79 0,72 0,76 0,84 60 PO2 1,00 BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 BE1 BE2 BE3 MH2 MH1 MH4 MH8 MH9 MH7 MH10 MH10MW MH11 PO1 PO2 MH5 MH6 MH3 0.46 0.56 0.65 Coefficient 0.75 0.85 Hình 4.9 Sơ đồ mối quan hệ di truyền mẫu giống nghiên cứu Dựa sơ đồ hình mối quan hệ di truyền mẫu giống Hoàng liên gai cho thấy mức tương đồng khoảng 77% chia 16 mẫu giống nghiên cứu thành nhóm • Nhóm I: gồm mẫu BE1 (Berberis sp) có nguồn gốc thu thập Phan xi • păng, Lào Cai Nhóm II: gồm mẫu BE2 (Berberis sp) BE3 (Berberis sp) có nguồn gốc • thu thập Núi Sả séng, Lào Cai Hệ số tương đồng hai mẫu 0,78 Nhóm III: gồm mẫu MH1 (Mahonia sp), MH2 (Mahonia sp), MH4 (Mahonia sp), MH7 (Mahonia sp), MH8 (Mahonia sp), MH9 (Mahonia sp), MH10 (Mahonia sp) , MH11 (Mahonia sp) Nhóm có hệ số tương đồng dao động từ • 0,75 (MH7 MH8) đến 0,85 (MH10 MH11) Nhóm phụ 3.1: gồm mẫu MH1 (Mahonia sp), MH2 (Mahonia sp), MH4 (Mahonia sp), có nguồn gốc SaPa, Lào Cai Hệ số tương đồng nhóm dao động từ 0,79 đến 0,81 61 BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP • Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 Nhóm phụ 3.2: gồm mẫu MH7, MH8, MH9 Cả ba mẫu thuộc loài Mahonia sp có nguồn gốc thu thập Langbiang, Lâm Đồng Hệ số tương đồng nhóm dao động từ 0,75 đến 0,84 • Nhóm phụ 3.3: gồm mẫu MH10 (Mahonia sp), MH11 (Mahonia sp), có • nguồn gốc thu thập Phó Bảng, Hà Giang hệ số tương đồng 0,85 Nhóm IV: gồm mẫu PO1 PO2 Hai mẫu thuộc loài Podophyllum sp • thu thập Ba Vì, Hà Tây có hệ số tương đồng 0,84 Nhóm V: gồm mẫu MH5 (Mahonia sp), MH6 (Mahonia sp) hệ số tương đồng hai mẫu 0,78 Tuy nhiên, chúng có nguồn gốc thu thập khác nhau: Lào Cai • (MH5) Lâm Đồng (MH6) Nhóm VI: gồm mẫu MH3 (Mahonia sp) có nguồn gốc thu thập Đèo Gió, Bắc Kạn Kết cho thấy, đa số loài chi mẫu có nguồn gốc thu thập phân nhóm có mối quan hệ di truyền gần Tuy nhiên, có mẫu MH5 (Mahonia sp), MH6 (Mahonia sp) thuộc Nhóm V có nguồn gốc thu thập khác có mối quan hệ di truyền gần Khi so sánh loài chi, mối quan hệ di truyền loài BE1 (Berberis sp) với loài chi xa (hệ số tương đồng mẫu BE1 BE2 0,47; BE1 BE3 0,44) Mối quan hệ di truyền mẫu MH3 (Mahonia sp) với loài chi tương tự (hệ số tương đồng mẫu MH3 (Mahonia sp) với mẫu chi Mahonia dao động từ 0,55-0,64) Điều có ý nghĩa quan công tác lai tạo giống để chọn tạo giống bố mẹ có đặc tính ưu việt, có di truyền khác Kết xác định hàm lượng berberin Ở mẫu podophylum hàm lượng berberin Bảng 4.7: Kết hàm lượng berberin Mẫu Nghiên Cứu Hàm lượng berberin(%) Mẫu Nghiên Cứu 62 Hàm lượng berberin(%) BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 BE1 2,32 MH5 0,46 BE2 1,61 MH6 0,40 BE3 3,10 MH7 0,151 MH1 0,91 MH8 0,24 MH2 0,52 MH9 0,7373 MH3 3,98 MH10 0,37 MH4 1,21 MH11 0,37 Phân tích với mồi OPN6 Với mồi OPN6 xuất băng cá biệt giếng 8(mẫu MH5), mẫu MH5 có hàm lượng berberin 0,46 tương đối thấp, thấp so với mẫu Hình 4.10: Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPN6 Phân tích với mồi OPE18 Với mồi OPE18 có xuất băng cá biệt giếng số 2( mẫu BE2), mẫu BE có hàm lượng berberin 1.61, chưa phải cao 63 BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 Hình 4.11: Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR với mồi OPE18 Vì vậy, sau phân tích ta thấy tính đa dạng di truyền RAPD ảnh hưởng đến xác định hàm lượng berberin mẫu 64 BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 PHẦN KẾT LUẬN Các mẫu Hoàng liên gai Việt Nam đa dạng, kết phân tích tính đa dạng di truyền 16 mẫu giống với 29 mồi RAPD thu tổng số 2751 băng ADN thuộc 283 loại băng khác (trung bình 9,8 băng/mồi), có 242 băng đa hình (85,5%) 46 băng đơn hình (914,5%) Các băng có kích thước khác dao động từ 250 bp đến 4000 bp Sau sàn lọc ta có primer: OPO2, OPO5, OPK19, S279, S300 tiến hành phản ứng RAPD cho kết đa hình cao với giống/loài hoàng liên gai Phân tích tính đa dạng di truyền 16 giống Hoàng liên thu thâp c taị Lào Cai Lâm Đồng dựa phần mềm NTSYSpc Version 2.1, nhận thấy giống khảo sát có đa daṇg cao măṭ di truyền (mức tương đồng gen 0,43 đến 0,85), yếu tố vùng điạ lý không làm thay đổi nhiều măṭ di truyền môṭ giống Tuy nhiên mức tương đồng di truyền 77%, 16 mẫu giống nghiên cứu chia thành nhóm cách biệt di truyền Nhóm I: gồm mẫu BE1 (Berberis sp) có nguồn gốc thu thập Phan xi păng, Lào Cai Nhóm II: gồm mẫu BE2 (Berberis sp) BE3 (Berberis sp) có nguồn gốc thu thập Núi Sả séng, Lào Cai Hệ số tương đồng hai mẫu 0,78 Nhóm III: gồm mẫu MH1 (Mahonia sp), MH2 (Mahonia sp), MH4 (Mahonia sp), MH7 (Mahonia sp), MH8 (Mahonia sp), MH9 (Mahonia sp), MH10 (Mahonia sp) , MH11 (Mahonia sp) Nhóm có hệ số tương đồng dao động từ 0,75 (MH7 MH8) đến 0,85 (MH10 MH11) 65 BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 Nhóm IV: gồm mẫu PO1 PO2 Hai mẫu thuộc loài Podophyllum sp thu thập Ba Vì, Hà Tây có hệ số tương đồng 0,84 Nhóm V: gồm mẫu MH5 (Mahonia sp), MH6 (Mahonia sp) hệ số tương đồng hai mẫu 0,78 Tuy nhiên, chúng có nguồn gốc thu thập khác nhau: Lào Cai (MH5) Lâm Đồng (MH6) Nhóm VI: gồm mẫu MH3 (Mahonia sp) có nguồn gốc thu thập Đèo Gió, Bắc Kạn 66 BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Tiến Bân (2007), Sách đỏ Việt Nam, tập 2, Nhà xuất Khoa học kĩ thuật công nghệ, tr 129-131 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung (2003), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập 1,2, NXB KHKT Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, Nhà xuất Y học, tr 224-241 Nguyễn Kim Cẩn (2002), “Nghiên cứu chứa Berberin giới nước”, Tạp chí Dược liệu, Tập 7, số 1,2,3,4 Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, tập 1, Nhà xuất Khoa học kĩ thuật, tr 440-441 Đinh Đoan Long, Nguyễn Tập, Phạm Thanh Huyền, Lê Thanh Sơn, Ngô Đức Phương (2009), “Sử dụng thị RAPD-PCR nghiên cứu đa hình di truyền nhằm góp phần giá trị bảo tồn hai loài thuốc ngũ gia bì hương (Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith) ngũ gia bì gai (A.trifoliatus (L.) Merr) Việt Nam”, Tạp chí Dược liệu, tập 14 (1), tr 10-16 Tài liệu Tiếng Anh Md Afroz Alam, Pradeep Kumar Naik, Gyan Prakash Mishra (2009) Congruence of RAPD and ISSR Markers for Evaluation of Genomic Relationship Among Populations of Podophyllum hexandrum Royle from Himachal Pradesh, India Turk J Bot, 33: 1-12 Nguyen Thi Lang (2002) Biotechnology Protocol Protocol for molecular Biotechnology Ed Nong nghiep Publisher, Ho chi minh City Vivek Tripathi and Sandhya Goswami (2013) Assessment of genetic diversity in Berberis lycium Royle complex using RAPD markers Journal of Cell Biology and Genetics, 3(1): 1-13 67 BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường 68 Lớp: Công nghệ sinh học K13 [...]... từ 0.013 đến 0.52, trung bình là 0,12 Cây di truyền của 50 loài B Lycium chia thành 5 nhóm chính Nghiên cứu này không hỗ trợ phân loại trước loài B Lycium (dựa vào đặc điểm hình thái) nhưng cho thấy sự đa dạng lớn trong loài B Lycium Đối với chi Podophyllum, tác giả Md Afroz Alam và cộng sự (2009) đã sử dụng chỉ thị RAPD để phân tích đa dạng di truyền của 28 loài Podophyllum hexandrum được thu thập... Himachal Pradesh, Ấn Độ Kết quả phần trăm các alen đa hình là 92,37 %, chứng tỏ 28 loài Podophyllum hexandrum đa dạng di truyền cao Đến năm 2010, Naik và cộng sự đã sử dụng 19 mồi ngẫu nhiên RAPD, 11 mồi ISSR và 13 cặp mồi AFLP để phân tích đa dạng di truyền của 28 loài Podophyllum hexandrum trên Kết quả cho thấy, phần trăm alen đa hình di truyền giữa các loài Podophyllum hexandrum khi sử dụng chỉ thị... những chỉ thị phân tử phổ biến dùng để phân tích đa dạng di truyền 4.1 Phương pháp chỉ thị hình thái 14 BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 Gen - thể hiện bản chất di truyền, thường thể hiện một hay nhiều tính trạng có thể đo đếm được – gen đó xem như gen chỉ thị Chỉ thị hình thái là một trong những phương pháp sơ khai trong việc đánh giá sự đa dạng di truyền Tuy nhiên,... tra nhiễm sắc thể ở tất cả các mẫu nghiên cứu đều là thể tứ bội (2n = 4x = 56) Nghiên cứu ở mức phân tử bằng kỹ thuật RAPD và giải trình tự vùng ITS cho thấy mối quan hệ giữa các đơn vị phân loại và sự khác biệt giữa các loài Tác giả, Vivek Tripathi và Sandhya Goswami (2013) cũng sử dụng phương pháp khuyếch đại ngẫu nghiên RAPD để đánh giá sự đa dạng di truyền của 50 loài Berberis lycium Royle thu thập... thì kỹ thuật RAPD đã được áp dụng để phân tích đa dạng di truyền của nhiều loại nấm khác nhau: Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces et de Not, Corynespora cassiicola (Nguồn NUWS20050722.084916/public/04Chapter3.pdf) Nhận di n chỉ thị phân tử: ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền và mối tương quan giữa kiểu gen RGA và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một số giống lúa ở Việt Nam (Nguyễn Thị Lang,... các loài Podophyllum Hexandrum ở Ấn Độ trước nguy cơ tuyệt chủng nghiêm trọng, Nag và cộng sự đã xác định được 20 mồi SSR để đánh giá đa dạng di truyền và phân biệt khác nhau giữa các loài Kết quả thu được tổng cộng 91 alen Số lượng alen dao động từ 2-9 với trung bình 4,55 alen mỗi mồi và dị hợp tử (H0) dao động từ 0,067-1,000 8.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền ở Việt Nam Mặc dù việc nghiên cứu. .. phân tích được thực hiện như sau: 30 BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 i Nhập các số liệu của bảng thống kê các band điện di sản phẩm RAPD vào bảng tính NTEDIT ii Xử lý kết quả bằng NTSYS iii Kết quả xử lý số liệu thể hiện ở bảng hệ số tương đồng di truyền và sơ đồ hình cây 8 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền trên thế giới và Việt Nam 8.1 Tình hình nghiên cứu. .. hình thái khác nhau như cây có gai và lá mọc đơn ở chi Berberis nhưng lại không có ở các loài Mahonia đã khẳng định chúng thuộc hai chi khác nhau (Ahrendt, 1961) Gần đây, các kỹ thuật di truyền được sử dụng để nghiên cứu tính đa dạng của các loài trong họ Berberidaceae và đi tìm mối quan hệ phát sinh loài giữa các loài Để xác định sự khác biệt giữa các loài xâm lấn và các loài bản địa trong chi Mahonia,... (Nguyễn Tiến Hùng (2009), Đối với các loài thuộc các chi của họ Berberidaceae, các nghiên cứu mới dừng lại ở mức thu thập nguồn gen và trồng lưu giữ (chưa đầy đủ) một cách ngẫu nhiên, xác định phương pháp định tính berberin trong dược liệu (Nguyễn Kim Cẩn, 2000); xác định hàm lượng berberin từ Hoàng liên gai, Hoàng liên chân gà, Hoàng bá (Tạ Kim Thạch, 2005); phương pháp chiết xuất berberin, như từ Vàng... số lượng chỉ thị di truyền nhiều nhất so với các kỹ thuật khác đối với mỗi tổ hợp mồi Lượng ADN tổng số tiêu tốn cho kỹ thuật này lại rất ít Đây là một phương pháp có hiệu quả cả trong nghiên cứu đa dạng di truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ gen Tuy nhiên AFLP là chỉ thị di 21 BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nguyễn Hùng Cường Lớp: Công nghệ sinh học K13 truyền trội, do đó không thể phân biệt giữa thể