ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HIỀN TÊN ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA TIÊN MAO TRÙNG (TRYPANOSOMMA EVANSI) LƯU HÀNH TRÊN TRÂU Ở TỈNH TUYÊN QUANG” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Thú y Khoa : Chăn nuôi thú y Khóa học : 2009 - 2014 Giảng viên hướng dẫn : GS.TS Nguyễn Thị Kim Lan Thái Nguyên, tháng 11 năm 2013 65 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực tập sở với nỗ lực, cố gắng thân giúp đỡ, dạy bảo ân cần thầy, cô giáo khoa Chăn nuôi Thú y; anh chị thầy, cô giáo khoa Công nghệ sinh học, Viện đại học mở Hà Nội, đến em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp với đề tài: “Nghiên cứu tách dòng biểu gene mã hóa kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng (Trypanosoma evansi) lưu hành trâu tỉnh Tuyên Quang” Nhân dịp hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo GS.TS Nguyễn Thị Kim Lan trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện tốt cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin trân trọng cảm ơn thầy, cô giáo khoa Chăn nuôi Thú y giúp em hoàn thành khóa học Cuối em xin bày tỏ lòng biết ơn đến người thân, gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ em hoàn thành khoa luận tốt nghiệp Xin trân trọng cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 11 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Hiền 66 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1 Thành phần điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn RoTAT 1.2 49 Bảng 4.2 Thành phần điều kiện phản ứng giải trình tự gene 50 Bảng 4.3 So sánh trình tự gene RoTAT 1.2 chủng T evansi Tuyên Quang với trình tự GenBank 51 Bảng 4.4 Thành phần điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen RoTAT 1.2/ pET32a (+) enzyme Bam HI 53 Bảng 4.5 Thành phần điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen RoTAT 1.2/ pET32a (+) enzyme Xho I 53 Bảng 4.6 Thành phần điều kiện phản ứng nối gen 54 67 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 4.1 Kết điện di ADN tổng số 43 Hình 4.2 Kết điện di sản phẩm PCR mẫu ADN tổng số 44 Hình 4.3 Kết tinh sản phẩm PCR 44 Hình 4.4 Sơ đồ thiết kế vector tái tổ hợp pJET1.2 - RoTAT 1.2 46 Hình 4.5 Kết nuôi cấy vi khuẩn biến nạp môi trường LB có ampicilin, chất thị màu X-gal, chất cảm ứng IPTG 47 Hình 4.6 Kết điện di sản phẩm tách plasmid 48 từ khuẩn lạc màu trắng 48 Hình 4.7 Kết kiểm tra plasmid tái tổ hợp phản ứng PCR với cặp mồi F1.2 /R1.2 50 Hình 4.8 Trình tự gene RoTAT 1.2 T evansi 51 Hình 4.9 Sơ đồ tóm tắt trình thiết kế vector biểu gen RoTAT1.2 52 Hình 4.10 Hình ảnh điện di gen RoTAT 1.2 cắt enzyme giới hạn Bam HI Xho I 53 Hình 4.11 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp 55 Hình 4.12 Kết biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E coli BL21 56 Hình 4.13 Sơ đồ cấu trúc vector pET 32a(+) 57 Hình 4.14 Kết điện di protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 gel SDS - PAGE 57 Hình 4.15 Kết phản ứng Western blot protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 với kháng thể kháng 6xHis 58 Hình 4.16 Kết phản ứng Western blot protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 với kháng thể kháng T evansi 59 68 DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ADN : Acid deoxyribonucleic ARN : Acid Ribonucleic BSA : Bovine Serum Albumin CATT : Card Agglutination Test for Trypanosomiasis cADN : ADN bổ sung (complementary ADN) dNTP : Deoxynucleotid triphotphat ddNTP : Dideoxynucletit EDTA : Ethylen Diamin Tetra Acetic ELISA : Enzym Linked Immunosorbent Assay EtBr : Ethydium bromide IFAT : Indirect Fluorescent Antibody Test IPTG : Isopropyl β - D - thiogalactoside ISG : Invanant Surface Glycoprotein KST : Ký sinh trùng LATEX : Latex Agglutination Test PBS : Phosphat Buffered Saline PBST : Phosphat Buffered Saline Tween PCR : Polymerase Chain Reaction PVDF : Polyvinylidene difluoride RE : Restriction enzyme SDS : Sodium Dodecyl Sulfat SDS - PAGE : Sodium Dodecyl Sulfat Poly Acrylamide TAE : Tris - axit acetic – EDTA TMT : Tiên mao trùng VAT : Variable Antigen Type VGS : Vanant Glycoprotein Surface 69 MỤC LỤC Trang Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Điểm đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tiên mao trùng bệnh tiên mao trùng gia súc 2.1.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc phân loại tiên mao trùng 2.1.1.1 Vị trí tiên mao trùng Trypanosoma hệ thống phân loại động vật nguyên sinh 2.1.1.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo tiên mao trùng 2.1.1.3 Cấu trúc kháng nguyên tiên mao trùng Trypanosoma evansi 2.1.2 Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng 2.1.2.1 Phân bố bệnh 2.1.2.2 Vật chủ vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng 2.1.2.3 Tuổi vật chủ, mùa mắc bệnh 2.1.3 Đặc điểm bệnh lý lâm sàng bệnh 10 2.1.3.1 Đặc điểm bệnh lý 10 2.1.3.2 Triệu chứng lâm sàng bệnh tiên mao trùng trâu, bò 11 2.1.3.3 Bệnh tích bệnh tiên mao trùng 12 2.1.4 Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 13 2.1.4.1 Chẩn đoán lâm sàng 13 2.1.4.2 Chẩn đoán thí nghiệm 13 2.1.5 Phương pháp phát ADN tiên mao trùng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 18 2.1.6 Phòng trị bệnh tiên mao trùng 18 2.1.6.1 Phòng bệnh 18 2.1.6.2 Điều trị bệnh 20 70 2.2 Tách dòng gene 21 2.2.1 Khái niệm phương pháp 21 2.2.2 Vector tách dòng 24 2.2.2.1 Khái niệm 24 2.2.2.2 Các loại vector tách dòng 25 2.2.3 Plasmid pCR 2.1 26 2.3 Biểu gene 27 2.3.1 Khái niệm 27 2.3.2 Vector biểu 29 Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 3.1 Đối tượng 30 3.2 Vật liệu 30 3.2.1 Sinh phẩm nghiên cứu 30 3.2.2 Thiết bị dụng cụ nghiên cứu 30 3.2.3 Môi trường hóa chất 31 3.2.4 Cặp mồi dùng nghiên cứu 33 3.3 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 33 3.4 Nội dung nghiên cứu 33 3.4.1 Nghiên cứu điều kiện tách dòng gene mã hóa kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi 33 3.4.2 Nghiên cứu biểu gene mã hóa kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi 33 3.5 Phương pháp nghiên cứu 34 3.5.1 Tách chiết ADN từ ký sinh trùng Trypanosoma evansi 34 3.5.2 Phương pháp điện di gel agarose 34 3.5.3 Khuếch đại đoạn gene mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 35 3.5.4 Phương pháp tinh ADN không sử dụng gel agarose 36 3.5.5 Phương pháp nối gene 36 3.5.6 Phương pháp tạo tế bào khả biến 37 71 3.5.7 Phương pháp chuyển ADN tái tổ hợp mang đoạn gene RoTAT 1.2 vào tế bào khả biến (biến nạp) 38 3.5.8 Phương pháp tách plasmid 38 3.5.9 Phương pháp cắt enzyme giới hạn 39 3.5.10 Phương pháp tinh ADN gel agarose 39 3.5.11 Phương pháp điện di gel SDS-PAGE 40 3.5.12 Phương pháp biểu protein T4 E coli BL21 41 3.5.13 Phương pháp Western blot 42 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4.1 Tách dòng xác định trình tự gene mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 Trypanosoma evansi 43 4.2 Kết biểu gene mã hóa kháng nguyên T evansi 52 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 60 5.1 Kết luận 60 5.1.1 Kết tách dòng xác định trình tự gene mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 Trypanosoma evansi 60 5.1.2 Kết biểu gene mã hóa kháng nguyên bề mặt T evansi 60 5.2 Đề nghị 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 I Tài liệu tiếng Việt 62 II Tài liệu tiếng Anh 64 Phần MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Nhiều tác giả nghiên cứu miễn dịch học cho rằng, tiên mao trùng biến đổi kháng nguyên bề mặt để né tránh miễn dịch đặc hiệu vật chủ Tuy nhiên, Van Meirvenne cho biết, biến đổi kháng nguyên bề mặt ký sinh trùng có pha trình nhiễm (trước xuất đáp ứng miễn dịch thể vật chủ) Theo Hajduc Vickernlan (1981) [27], tượng biến đổi kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng thấy gia súc bị tiêm thuốc làm suy giảm miễn dịch Những quan điểm hoàn toàn để lý luận xuất kháng nguyên biến đổi tiên mao trùng Như vậy, quan điểm biến đổi kháng nguyên lớp vỏ tiên mao trùng chưa thống Hiện nay, có nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng như: phương pháp phát tiên mao trùng trực tiếp, phương pháp tập trung tiên mao trùng, phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm, phương pháp chẩn đoán huyết học Trong đó, phương pháp chẩn đoán huyết học đánh giá có độ nhạy độ đặc hiệu cao, cho kết nhanh có khả chẩn đoán với số lượng mẫu lớn, thời gian ngắn Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm phương pháp phổ biến, hiệu quả, xác thường ứng dụng nhiều để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng Việt Nam Song, nhược điểm phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm cần chẩn đoán nhanh, với số lượng nhiều thời gian ngắn phương pháp đáp ứng Kháng nguyên RoTAT 1.2 có mặt hầu hết VAT (Variable Antigen Type) Trypanosoma evansi Kháng nguyên chế tạo công nghệ gene cho khả phát đặc hiệu tiên mao trùng đạt 98% Để sản xuất kháng nguyên RoTAT 1.2 Trypanosoma evansi phục vụ chế tạo Kit chẩn đoán bệnh tiên mao trùng lưu hành trâu tỉnh Tuyên Quang, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tách dòng biểu gene mã hóa kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng (Trypanosoma evansi) lưu hành trâu tỉnh Tuyên Quang” 1.2 Mục tiêu đề tài - Xác định gene mã hóa kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng - Tạo tế bào chủ yếu biểu gene mã hóa kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng 1.3 Điểm đề tài - Đề tài xác định gene mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 tiên mao trùng phân lập Tuyên Quang để tạo sở cho việc xác định cấu trúc kháng nguyên - Kháng nguyên RoTAT 1.2 tái tổ hợp chế tạo nước phục vụ sản xuất Kit chẩn đoán có khả phát đặc hiệu với bệnh tiên mao trùng Việt Nam tính tương đồng kháng nguyên 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học Đề tài tách dòng, xác định trình tự gene mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 biểu gene mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 tiên mao trùng Trypanosoma evansi phân lập Tuyên Quang 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết đề tài sở khoa học phục vụ sản xuất Kit chẩn đoán huyết học có khả phát đặc hiệu bệnh tiên mao trùng gia súc Việt Nam tính tương đồng kháng nguyên 50 Hình 4.7 Kết kiểm tra plasmid tái tổ hợp phản ứng PCR với cặp mồi F1.2 /R1.2 (Giếng 1: Marker, Giếng 2: Sản phẩm PCR plasmid pJET1.2) Hình 4.7 cho thấy: Trên hình ảnh điện di, dòng plasmid tái tổ hợp số 1, 2, sau kiểm tra phản ứng PCR thấy xuất băng sáng có kích thước tương ứng với kích thước gen mã hóa kháng nguyên RoTAT1.2 205 bp Đoạn gene tinh kit PurelinkTMPCR purification (Invitrogen) tiến hành giải trình tự gene Quy trình thực kit BigDye Terminator 3.1 Cycle Sequencing với thành phần điều kiện phản ứng giải trình tự gene ghi bảng 4.2; kết giải trình tự gene RoTAT 1.2 ghi hình 4.8 Bảng 4.2 Thành phần điều kiện phản ứng giải trình tự gene Thành phần H2O Big dye Dung dịch đệm 2,5 X FM13 (2 µM) RM13 (2 µM) ADN plasmid Tổng Thể tích (µl) 5,725 6,075 0,6 0,6 2,0 15,0 • • • • • • Điều kiện Bước 1: 960C phút Bước 2: 960C 10 giây Bước 3: 500C giây Bước 4: 600C phút Bước 5: lặp lại 25 chu kì từ bước đến bước Bước 6: 40C đến lúc kết thúc 51 Hình 4.8 Trình tự gene RoTAT 1.2 T evansi Để chứng minh gene RoTAT 1.2 T evansi phân lập trâu tỉnh Tuyên Quang tương đồng với gene RoTAT 1.2 ngân hàng gene quốc tế (GenBank), so sánh để thấy tương đồng Kết trình bày bảng 4.3 Bảng 4.3 So sánh trình tự gene RoTAT 1.2 chủng T evansi Tuyên Quang với trình tự GenBank Mã số GenBank Tên chủng gene xác định trình tự Phần trăm Mức độ Chiều trình tự dài so sánh tương đồng (bp) với GenBank (%) (%) Trypanosoma evansi AB259839.1 RoTat 1.2 gene for 205 100 100 variable surface glycoprotein, partial cds Trypanosoma evansi surface EF495337.1 variable 205 100 99 glycoprotein (VSG) mARN, partial cds Trypanosoma evansi clone variable surface AF317914.1 RoTat1.2 205 100 99 glycoprotein (VSG) mARN, complete cds Kết bảng 4.3 cho thấy, đoạn trình tự plasmid pJET- 52 RoTAT 1.2 mà tách dòng giải trình tự với mồi M13 có độ tương đồng cao (99 - 100%) với trình tự gene RoTAT 1.2 chủng T evansi ngân hàng gene quốc tế 4.2 Kết biểu gene mã hóa kháng nguyên bề mặt T evansi Vector lựa chọn để biểu gene mã hóa kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng vector pET 32a (+) Với ưu điểm là: có khả tạo số lượng lớn tế bào vật chủ, có promoter hoạt động mạnh, có gene kháng kháng sinh thị để chọn lọc tế bào chứa plasmide tái tổ hợp, pET 32a (+) sử dụng quy trình sản xuất nhiều loại protein tái tổ hợp khác nhau, biểu mức độ cao gene vi khuẩn E coli Plasmid pJET-RoTAT 1.2 chứa trình tự đoạn gene RoTAT 1.2 sau tinh sử dụng trực tiếp để thực phản ứng PCR khuếch đại gene RoTAT 1.2 Vector biểu thiết kế theo sơ đồ thể hình 4.9 Gene RoTAT 1.2 vector pET 32a(+) cắt với enzyme Bam HI điện di tinh kit High Pure Product purification kit (Roche) Sau đó, sản phẩm tinh tiếp tục cắt với enzyme Xho I Thành phần điều kiện phản ứng cắt với enzyme trình bày bảng 4.4 4.5 Sản phẩm xử lý enzyme cuối tinh điện di kiểm tra gel agarose 1% trước thực phản ứng ghép nối với Hình 4.9 Sơ đồ tóm tắt trình thiết kế vector biểu gen RoTAT1.2 53 Bảng 4.4 Thành phần điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen RoTAT 1.2/ pET32a (+) enzyme Bam HI Thể tích (µl) Điều kiện xử lý H2O 60 Đệm 10x 15 pET 32a (+)/ RoTAT 1.2 70 Ủ 370C Bam HI Tổng 150 Bảng 4.5 Thành phần điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen RoTAT 1.2/ pET32a (+) enzyme Xho I Thành phần Thành phần H2O Đệm 10x pET 32a (+)/ RoTAT 1.2 XhoI Tổng Thể tích (µl) 33 10 54 100 Điều kiện xử lý Ủ 370C Kết điện di gene RoTAT 1.2 cắt enzyme giới hạn Bam HI Xho I ghi lại hình 4.10 Hình 4.10 Hình ảnh điện di gen RoTAT 1.2 cắt enzyme giới hạn Bam HI Xho I (Giếng M: marker, giếng 1: sản phẩm cắt gen RoTAT 1.2, giếng 2: sản phẩm cắt vector pET 32a (+)) 54 Kết điện di thể hình 4.10 cho thấy, sản phẩm cắt enzyme gene RoTAT 1.2 vector pET 32a(+) xuất băng nhất, có kích thước khoảng 0,2 kb 5,9 kb, tương tự kích thước lý thuyết gene RoTAT 1.2 vector pET 32a(+) Kết chứng tỏ, sản phẩm PCR sau cắt hai enzyme cắt giới hạn Bam HI Xho I có chất lượng tốt, không thay đổi đáng kể so với kích thước ban đầu gene Sản phẩm cắt enzyme giới hạn gel tinh kit QIAEX II Gel Extraction Kit Qiagen, ghép nối với nhờ phản ứng nối có thành phần điều kiện ghi bảng 4.6 Bảng 4.6 Thành phần điều kiện phản ứng nối gen Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Đệm 10x RoTAT 1.2 cắt Bam HI Xho I 10 pET 32a(+) cắt Bam HI Xho I T4 ligase Tổng Điều kiện Ủ 160C qua đêm 20 Sản phẩm phản ứng ghép nối gen biến nạp vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α Có nhiều phương pháp áp dụng phương pháp xung điện, phương pháp biến nạp… Trong nghiên cứu này, tiến hành theo phương pháp biến nạp, đưa plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E coli tác dụng nhiệt ion Ca2+ Sau biến nạp, dịch nuôi cấy trang đĩa môi trường LB thạch có bổ sung kháng sinh Ampicillin 100 µg/ml nuôi 37oC qua đêm Các khuẩn lạc màu trắng có khả chứa vector tái tổ hợp lựa chọn để tách chiết plasmid cắt enzyme cắt giới hạn Từ số khuẩn lạc lựa chọn ngẫu nhiên, thu plasmide tái tổ hợp Kết điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp enzyme Bam HI Xho I ghi lại hình 4.11 55 Hình 4.11 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp enzyme Bam HI Xho I (Giếng M: thang chuẩn; giếng 1: Sản phẩm PCR gen RoTAT 1.2; giếng 2: sản phẩm cắt pET 32a/ RoTAT 1.2 với enzyme Bam HI Xho I) Kết hình 4.11 cho thấy, enzyme giới hạn cắt plasmid thành hai băng có kích thước tương ứng với kích thước gene RoTAT 1.2 vector pET 32a(+) Để khẳng định gene RoTAT 1.2 chèn vào vector biểu khung chiều đọc, không xuất lỗi trình chép ADN, vector pET 32a/RoTAT tinh để xác định lại trình tự nucleotide so sánh với trình tự GenBank Trình tự plasmid tái tổ hợp chứa đoạn ADN mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 có kích thước khoảng 205 bp khung dịch mã, xác định với chuỗi polypeptide chứa đoạn tín hiệu đầu N tương ứng với 68 acid amin Như vậy, thiết kết thành công vector tái tổ hợp pET 32a/RoTAT 1.2 Plasmid tái tổ hợp biến nạp vào tế bào vi khuẩn E coli BL21(DE3) phương pháp sốc nhiệt nuôi cấy đĩa LB có chứa kháng sinh ampicillin 370C, qua đêm Kết biến nạp thể hình 4.12 56 Hình 4.12 Kết biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E coli BL21 Hình 4.12 cho thấy: Chủng vi khuẩn E coli BL21 (DE3) pLysS chủng vi khuẩn mang đặc tính di truyền biến đổi, thích hợp cho việc biểu protein tái tổ hợp từ nhóm vector pET Chủng mang plasmid pLysS mã hóa cho lyzozyme, giúp kiểm soát chặt chẽ việc cảm ứng biểu protein tái tổ hợp so với chủng BL21(DE3) thông thường Protein RoTAT 1.2 biểu dạng dung hợp đầu C với đoạn 6xHis Sự biểu protein RoTAT 1.2 E coli BL21 (DE3) bước đầu phân tích phương pháp SDS - PAGE phương pháp Western blot Các dòng tế bào vi khuẩn E coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp pET 32a/RoTAT 1.2 thu từ đĩa nuôi cấy, tiến hành nuôi cấy lắc môi trường lỏng LB có chứa ampicilin 100 µg/ml, 370C qua đêm đến pha ổn định Từ dịch nuôi cấy này, vi khuẩn lại tiếp tục cấy chuyển sang môi trường LB lỏng có chứa kháng sinh ampicilin 100 µg/ml, lắc khoảng để OD600 đạt từ 0,6 – 1, bổ sung chất cảm ứng IPTG để đạt đến nồng độ cuối mM Điều kiện cảm ứng IPTG 370C máy lắc, với tốc độ 200 vòng/phút Đoạn gen mã hoá cho protein RoTAT 1.2 chèn vào vùng MCS vector pET 32a(+) biểu protein kiểm soát với T7 promoter Cấu trúc vector pET32 a (+) trình bày hình 4.13 57 Hình 4.13 Sơ đồ cấu trúc vector pET 32a(+) Hình 4.13 cho thấy: Trên vector pET 32a (+) có chứa gen lacI mã hoá cho protein ức chế gắn vào vùng operator lac promoter T7, ngăn cản phiên mã có cảm ứng IPTG Protein RoTAT 1.2 biểu theo chế kiểm soát âm hệ thống operon lac chất cảm ứng IPTG bổ sung vào môi trường nuôi cấy Tế bào vi khuẩn tái tổ hợp sau cảm ứng thu nhận, xử lý điện di gel SDS-PAGE 12,5% Kết ghi hình 4.14 Hình 4.14 Kết điện di protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 gel SDS - PAGE (Giếng M: thang chuẩn; giếng 1,2: E coli BL21 - pET32/RoTAT 1.2 cảm ứng với IPTG; giếng 3,4: E coli BL21 - pET32/ RoTAT 1.2 không cảm ứng với IPTG; giếng 5: E coli BL21- pET32) 58 Hình 4.14 cho thấy: So sánh hình ảnh điện di đồ mẫu có chất cảm ứng IPTG, đồng thời so sánh kích thước với thang protein chuẩn ta thấy, mẫu có cảm ứng với IPTG (đường chạy số 1, 2) xuất băng protein có kích thước nằm khoảng kDa (tương ứng với kích thước lý thuyết protein RoTAT 1.2 có gắn đuôi His-tag), mẫu không cảm ứng với IPTG (đường chạy số 3, 4) không thấy xuất băng Hơn nữa, mẫu nuôi E coli BL21 - pET32 không bổ sung IPTG (đường chạy số 5), không thấy xuất băng protein Như vậy, băng protein xuất có nhiều khả protein tái tổ hợp đích mà cần biểu Để khẳng định chắn khả biểu gen RoTAT 1.2, tiến hành phản ứng Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng T evansi kháng thể đặc hiệu kháng 6xHis Protein RoTAT 1.2 sau phân tích gel polyacrylamide, chuyển sang màng nitrocellulose cho phản ứng với kháng thể đặc hiệu, sau gắn với protein A gắn enzyme peroxidase, màu TMB Kết phản ứng Western blot protein RoTAT 1.2 với kháng thể kháng đuôi 6xHis kháng thể kháng T evansi ghi hình 4.15, 4.16 Hình 4.15 Kết phản ứng Western blot protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 với kháng thể kháng 6xHis Vạch 1, 2, 3: phản ứng với protein thu từ chủng BL21/pET- RoTAT 1.2 không cảm ứng IPTG; vạch 4, 5, 6: phản ứng với protein thu từ chủng BL21/pET- RoTAT 1.2 có cảm ứng IPTG 59 Hình 4.16 Kết phản ứng Western blot protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 với kháng thể kháng T evansi Vạch 1, 2, 3: phản ứng với protein thu từ chủng BL21/pET- RoTAT 1.2 không cảm ứng IPTG; vạch 4, 5, 6: phản ứng với protein thu từ chủng BL21/pET- RoTAT 1.2 có cảm ứng IPTG Hình 4.15 4.16 cho thấy, tín hiệu lai với hai loại kháng thể tìm thấy vị trí dự kiến (8 kDa), phù hợp với kết điện di SDSPAGE Như vậy, biểu thành công kháng nguyên RoTAT 1.2 tiên mao trùng T evansi vi khuẩn E coli BL21(DE3) 60 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua trình tiến hành nghiên cứu đề tài, thu kết sau: 5.1.1 Kết tách dòng xác định trình tự gene mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 Trypanosoma evansi - ADN tổng số tách chiết có chất lượng tốt - Sản phẩm PCR mẫu ADN tổng số tách từ tiên mao trùng phân lập có kích thước phù hợp 205 bp - Sản phẩm tinh đạt yêu cầu, xuất băng vạch rõ tương ứng với vạch có kích thước 205 bp gene RoTAT 1.2 - Thiết kế thành công vector tách dòng gene mã hóa kháng nguyên bề mặt T evansi - Trên đĩa nuôi cấy vi khuẩn biến nạp hình thành hai loại khuẩn lạc màu xanh trắng - Đã tách dòng xác định trình tự gene mã hóa kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng Trypanosoma evansi phân lập từ trâu bị bệnh tỉnh Tuyên Quang Trình tự gene tương đồng 99 - 100% với trình tự GenBank 5.1.2 Kết biểu gene mã hóa kháng nguyên bề mặt T evansi - Vector lựa chọn để biểu gene mã hóa kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng vector pET32a (+) - Thiết kết thành công vector tái tổ hợp pET 32a/RoTAT 1.2, vector biểu gene mã hóa kháng nguyên bề mặt T evansi - Sản phẩm PCR sau cắt hai enzyme giới hạn Bam HI Xho I có chất lượng tốt, không thay đổi đáng kể so với kích thước ban đầu gene (xuất băng nhất, có kích thước khoảng 0,2 kb 5,9 kb, tương tự kích thước lý thuyết gene RoTAT 1.2 vector pET32a (+)) - Các mẫu có cảm ứng với IPTG xuất băng protein có kích thước nằm khoảng kDa tương ứng với kích thước lý thuyết 61 protein RoTAT 1.2 có gắn đuôi His - tag, mẫu không cảm ứng với IPTG không xuất băng này, mẫu nuôi E coli BL21 - pET32 không bổ sung IPTG không xuất băng protein - Đã biểu thành công gene mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 T evansi vi khuẩn biểu E coli BL21(DE3) Kháng nguyên có trọng lượng kDa, xác định phương pháp điện di SDS PAGE Western blot 5.2 Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu điều kiện biểu gene mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 T evansi vi khuẩn biểu E coli BL21(DE3) để sản xuất kháng nguyên RoTAT1.2 tái tổ hợp, phục vụ cho nghiên cứu sản xuất Kit chẩn đoán có khả phát đặc hiệu kháng thể kháng tiên mao trùng Việt Nam tính tương đồng kháng nguyên 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt Phạm Chiến, Nguyễn Đức Tân, Lê Đức Quyết (1999), “Kết khảo sát ký sinh trùng đường máu đàn bò huyện Mi Dinh Daklak”, Kết hoạt động KHKT Thú y, tr 53 Phan Văn Chinh (2006), Bệnh tiên mao trùng Trypanosoma evansi trâu, bò nuôi tỉnh miền Trung biện pháp phòng trị Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Quốc Doanh (1999), Một số đặc tính sinh học T evansi (Steel, 1885), bệnh học chúng gây ra, quy trình bảo quản sử dụng giống T evansi để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng, Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Hà Nội Đào Trọng Đạt (1963), “Nghiên cứu nguyên nhân đổ ngã trâu bò vụ đông xuân”, Kỷ yếu Viện khoa học Nông nghiệp, Lương Văn Huấn, Lê Hữu Khương (1997), Giáo trình Ký sinh bệnh ký sinh gia súc, gia cầm, Nhà xuất Đại học Quốc gia - TP.HCM Nguyễn Đăng Khải (1995), "Về triệu chứng sảy thai bệnh tiên mao trùng trâu bò T evansi", Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y tập III, số 1, tr 69 - 71 Phạm Sỹ Lăng (1982), Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh tiên mao trùng trâu, bò Trypanosoma evansi tỉnh phía Bắc Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ khoa học Thú y Phạm Sỹ Lăng, Lê Ngọc Mỹ (1984), “Một số thay đổi máu trâu bò bị bệnh tiên mao trùng Trypanosoma evansi (steel, 1885) tỉnh phía Bắc Việt Nam”, Kết nghiên cứu khoa học kỹ thuật thú y 1979 – 1984 Phan Địch Lân, Phạm Sỹ Lăng (1972), “Kết điều tra nguyên nhân trâu, bò đổ ngã đông xuân huyện Bình Lục biện pháp phòng trị”, Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp 10 Phan Địch Lân (1974), “Thành phần họ mòng Tabanidae vai trò truyền bệnh miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp 63 11 Phan Địch Lân (2004), Bệnh ngã nước trâu bò, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội, tr 56 - 73 12 Phan Lục, Nguyễn Văn Thọ (1995), “Đơn bào ký sinh trâu bò số điểm thuộc tỉnh phía Bắc”, Kỷ yếu kết nghiên cứu khoa học Thú y 13 Hà Viết Lượng (1998), Đơn bào ký sinh, đặc điểm dịch tễ biện pháp phòng trị bệnh Trypanosomiasis bò thuộc Nam Trung Bộ, Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp, Hà Nội 14 Lê Ngọc Mỹ (1994), “Kết bước đầu thiết lập phản ứng ELISA để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng”, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, tập II, số 15 Lê Ngọc Mỹ (1994), “Phương pháp ELISA phát kháng nguyên phương pháp ký sinh trùng học chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (T evansi) trâu bò mắc bệnh tự nhiên”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập II, số 16 Đoàn Văn Phúc, Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn Đăng Khải (1981), “Thí nghiệm dùng Trypamidium điều trị bệnh tiên mao trùng”, Thông tin thú y Viện Thú y, Hà Nội 17 Đoàn Văn Phúc (1994), “Kết ứng dụng số phương pháp huyết học chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trâu thực địa”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập II, số 18 Vương Thị Lan Phương (2004), Nghiên cứu kháng nguyên bề mặt Trypanosoma evansi phân lập từ trâu, bò phía Bắc Việt Nam tinh chế kháng nguyên dùng phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Hà Nội 19 Lê Đức Quyết (1995), “Tình hình trâu, bò nhiễm tiên mao trùng số tỉnh duyên hải miền Trung Tây Nguyên”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập III, số 20 Nguyễn Như Thanh (2000), Cơ sở phương pháp nghiên cứu dịch tễ học thú y, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr 126 21 Lương Tố Thu (1994), “Kết sản xuất Conjugate huỳnh quang chẩn đoán bệnh tiên mao trùng so sánh độ nhạy với phương pháp chuẩn khác”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập II, số 64 22 Lương Tố Thu, Lê Ngọc Mỹ (1996), “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp ngưng kết nhựa (CATT) để chẩn đoán tình hình bệnh tiên mao trùng (do T evansi) đàn trâu Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập IV, số 23 Hồ Thị Thuận (1984), “Điều tra tình hình nhiễm Trypanosoma evansi nghiên cứu quy trình phòng trị cho trâu bò sữa phía Nam”, Kết nghiên cứu khoa học kỹ thuật thú y 1979 - 1984 II Tài liệu tiếng Anh 24 Barry J D., Tumer C M R (1991), The diamics of antigenic variation ADN growth of African trypanosomes, Parasitology Today, 7, pp 207 - 21 25 Davison (1999) Evaluation of diagnostic test for T evansi ADN then application in epidemiogical studies in Indonesia, PhS thesis Eliburgh 26 Jackson D.G Windle, H,J., Voorheis, H.P., (1993), The indentification purification ADN characterization of two invariant surface glucoproteins located beneathnthe surface coat barrier of bloodstream forms of Trypanosoma brucei J Biol Chem 27 Hajduk S.L., Vikerman K., (1981), Antigenic variation in cyclically transmitted Trypanosoma brucei Variable antigen type compositionin the fist parasitemia in mice bitten by Trypanosoma infected glossinea morsitants, Parasitology 28 Hoare C A (1972), The Trypanosomes of MammaIs A zoological monograph, Black well scientific Publication Oxford ADN Edinburgh 29 Losos G J., Ikede B O (1972),” Review of the pathology of diheases of domectic ADN laboratory animal” caused by T congolense, T vivax, T brucei, T rhođensiense ADN T gambiense, Joumal of Veterinary pathology, 9, pp - 15 30 Luckins A G (1988), Trypanosoma evansi in Asia, Parasitology today, p - 49 31 Raper J., Portela Molina M P., (2002), Natural immunity to human African trypanosomiasis: Trypanosomelytic factor ADN the blood incubation infectivity test Trans R Soc Trop Med Hyg, Apr, 96 32 Vickerman K., Luckins A G., (1969), Localization of Variable antigens in the surface coat of Trypanosoma brucei using ferritin conjugated antibody, Nature [...]... này nằm ở túi tiên mao * Kháng nguyên biến đổi Về kháng nguyên biến đổi, cần đề cập đến sự biến đổi lớp vỏ bề mặt VSG, những quan điểm mới về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của tiên mao trùng và cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi Nhờ kháng thể đặc hiệu được đánh dấu mà Vickerman và Luckins đã phát hiện ra sự biến đổi của lớp kháng nguyên bề mặt Lớp áo bề mặt của tiên mao trùng có thành phần... phân tử là tách dòng thực nghiệm và tách dòng ảo * Tách dòng in vitro Tách dòng in vitro hay tách dòng thực nghiệm là tách dòng gene được thực hiện từ các mẫu sinh học (mô tế bào, lông, tóc, dịch sinh học…) mang các gene cần tách dòng hoặc tổng hợp nhân tạo đoạn gene cần tách dòng Tách dòng in vitro gồm các phương pháp khác nhau, có thể tách dòng từ ADN, tách dòng từ ARN hoặc tách dòng trên cơ sở trình... sóng tiên mao trùng mạnh là những đợt sóng yếu Mỗi đợt sóng tiên mao trùng bắt đầu bằng sự tăng số lượng tiên mao trùng trong máu, sau đó giảm và khó phát hiện thấy tiên mao trùng Mỗi đợt tiên mao trùng tăng lên trong máu là biểu hiện sự xuất hiện một quần thể tiên mao trùng có tính kháng nguyên bề mặt mới, quần thể này có thể tiếp tục 11 sinh sản và tồn tại một thời gian cho đến khi cơ thể xuất hiện kháng. .. kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng ở trên bản nhựa, thì sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên với kháng thể Hiện tượng ngưng kết có thể quan sát được bằng mắt thường, và được giải thích là do kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng được gắn lên các hạt latex là loại kháng nguyên hữu hình, có nhiều điểm quyết định tính kháng nguyên bề mặt (epitop surface) Còn kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao. .. vậy, quan điểm về sự biến đổi kháng nguyên lớp vỏ của tiên mao trùng cho đến nay vẫn chưa thống nhất * Cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi Khi kháng thể đặc hiệu kết hợp với phân tử của kháng nguyên bề mặt (VSG) và với bổ thể, gắn lên trên bề mặt và làm tiêu tan tiên mao trùng thì đó cũng là nguyên nhân chính thúc đẩy sự hoạt hoá của gene Kết quả là các phân tử kháng nguyên VSG được thay đổi hoàn... kháng nguyên bề mặt của ký sinh trùng đã có ngay ở pha đầu tiên của quá trình nhiễm (trước khi xuất hiện đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ) Theo Hajduc và Vickernlan (1981) [27], hiện tượng biến đổi kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng còn thấy ở gia súc đã bị tiêm thuốc làm suy giảm miễn dịch Những quan điểm này là hoàn toàn mới để lý luận về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của tiên mao trùng. .. tiên mao trùng ở trâu bò, Vương Thị Lan Phương (2004) [18], đã nghiên cứu kháng nguyên bề mặt T evansi phân lập từ trâu, bò ở 6 tỉnh phía Bắc Việt Nam và cho biết: đã thu được 6 mẫu tiên mao trùng từ 6 tỉnh, tiến hành phân dòng, phân VAT và thu được 26 VAT thuộc 6 kho kháng nguyên khác nhau Bằng phản ứng dung giải miễn dịch và phương pháp thấm miễn dịch, tác giả đã xác định được sự thay đổi kháng nguyên. .. quanh và một cặp ở trung tâm, xếp song song dọc chiều dài roi (Hoare, 1972 [28]; Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [3]) 2.1.1.3 Cấu trúc kháng nguyên của tiên mao trùng Trypanosoma evansi Kháng nguyên của T evansi gồm hai loại: kháng nguyên ổn định (kháng nguyên không biến đổi) và kháng nguyên biến đổi * Kháng nguyên ổn định (kháng nguyên không biến đổi) Phần lớn các thành phần kháng nguyên tiên mao trùng không biến... bệnh tiên mao trùng ở nước ta * Các phương pháp phát hiện kháng nguyên tiên mao trùng - Phương pháp ELISA kháng nguyên (Ag - ELISA) Đây là phương pháp sử dụng phản ứng ELISA kháng nguyên để phát 18 hiện kháng nguyên lưu động trong máu của gia súc nhiễm bệnh Phản ứng dựa trên kháng thể đơn dòng đặc hiệu với tiên mao trùng Lê Ngọc Mỹ (1994) [14], đã bước đầu ứng dụng phương pháp này để chẩn đoán bệnh tiên. .. gây ra vết viêm trên mặt da, kích thước chỗ viêm phụ thuộc vào số lượng tiên mao trùng được tiêm truyền Vào máu, tiên mao trùng nhân lên theo cấp số nhân ở trong máu, trong bạch huyết và ở trong các mô khác của cơ thể vật chủ theo cách phân chia theo chiều dọc Số lượng tiên mao trùng trong máu không phải lúc nào cũng như nhau Mật độ tiên mao trùng thay đổi theo ngày Biểu đồ sóng tiên mao trùng cho thấy,