ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRƯƠNG HẢI NHUNG NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM BỆNH XƠ GAN TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT BỊ XƠ GAN SỬ DỤNG LIỆU PHÁP TẾ BÀO GỐC Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT Mã số: 62 42 30 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC Tp Hồ Chí Minh – Năm 2015 Công trình hoàn thành tại: PTN Nghiên cứu Ứng dụng Tế bào gốc, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Tp.Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Văn Thanh PGS.TS Huỳnh Nghĩa Phản biện 1: PGS.TS Phạm Thị Lệ Hoa Phản biện 2: GS.TS Nguyễn Văn Thuận Phản biện 3: PGS.TS Lê Văn Đông Phản biện độc lập 1: PGS.TS Lê Văn Đông Phản biện độc lập 2: TS.BS Ngô Quốc Đạt Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp vào lúc ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM - Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên MỞ ĐẦU Gan quan có khả tái sinh trường hợp tổn thương mạn tính khả tự tái tạo gan không sau dẫn đến tình trạng xơ hóa Hiện nay, xơ gan xếp vào danh sách 25 bệnh gây tử vong cao toàn giới Việt Nam nước có tỷ lệ viêm gan xơ gan cao (~20%) so với nhiều nước Thế giới Các biện pháp điều trị xơ gan chưa thực mang lại kết mong đợi Hiện nay, ghép gan cho phương pháp điều trị hiệu lựa chọn tốt cho bệnh nhân mắc bệnh gan giai đoạn cuối Rào cản lớn ghép gan khan nguồn tạng Ngoài ra, ghép gan bệnh nhân xơ gan có nhiều rủi ro liên quan đến trình phẫu thuật Với kiến thức tảng chuyên sâu tế bào gốc y học tái tạo, nhà khoa học đặt niềm tin vào việc sử dụng tế bào gốc tái tạo mô gan bệnh nhân xơ gan Liệu pháp sử dụng tế bào gốc trưởng thành có nhiều ưu điểm như: nguồn thu nhận dồi dào, ghép tự thân, vượt qua rào cản đạo lí Nhiều nghiên cứu lâm sàng cận lâm sàng giới, cho thấy phát đáng ý hiệu vai trò tế bào gốc Ở Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu liệu pháp tế bào gốc điều trị xơ gan, việc phát triển liệu pháp ứng dụng tế bào gốc điều trị xơ gan cấp thiết mở hướng điều trị xơ gan nói riêng bệnh thoái hoá tế bào nói chung Từ sở phân tích nhận định, đề xuất đề tài “Nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh xơ gan mô hình chuột bị xơ gan sử dụng liệu pháp tế bào gốc” nhằm đánh giá hiệu vai trò điều trị tế bào gốc trung mô từ mô mỡ tự thân mô hình chuột xơ gan MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN Luận án tiến hành với mục tiêu chung nghiên cứu điều trị thực nghiệm chuột bệnh xơ gan tế bào gốc Mục tiêu cụ thể sau: - Thu nhận tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột (mADSC) xơ gan - Gây tạo mô hình bệnh xơ gan chuột CCl4 - Phân tích đánh giá hiệu điều trị thực nghiệm tế bào gốc mô mỡ chuột bệnh xơ gan - Phân tích đánh giá vai trò điều trị tế bào gốc trung mô từ mô mỡ mô hình chuột thực nghiệm NỘI DUNG NGHIÊN CỨU LUẬN ÁN: Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA LUẬN ÁN: Nghiên cứu sử dụng nguồn tế bào gốc trưởng thành thu nhận từ nguồn mẫu không gây tranh cãi mặt đạo lí Mô hình chuột bị xơ gan CCL4, mô hình kinh điển, dễ tiếp cận, hiệu liệu pháp dễ dàng đánh giá có độ tin cậy cao Kết nghiên cứu luận án rút số kết luận có ý nghĩa khoa học sau: - mADSC thu nhận từ chuột xơ gan có biểu cao gen liên quan đến tế bào gan mADSC biểu dương tính mạnh CYP1A1 HGF - CCl4 1ml/kg (phác đồ uống lần/tuần 02 ngày kéo dài 11 tuần) liều tối ưu để gây tạo mô hình chuột xơ gan giống chuột đực Swiss - Phác đồ mADSC (5.105 tế bào/con) tự thân cho hiệu cải thiện tiêu liên quan đến xơ hoá chuột 100% chuột sau điều trị mADSC kết hợp với huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) cho hiệu điều trị vượt trội so với sử dụng mADSC riêng lẻ - Khi nuôi cấy môi trường chứa dịch chiết gan xơ, mADSC biến đổi theo chiều hướng biệt hoá thành tế bào gan sau 21 ngày cảm ứng Sau ghép vào thể chuột (truyền toàn thân), mADSC có khả năng: Di cư “homing” gan; Ức chế tế bào bạch cầu hạt; Kích thích biểu gen tan xơ hoá; Biệt hoá in vivo thành tế bào gan sau 21 ngày cấy ghép BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN: Luận án có 169 trang với 24 Bảng 52 Hình Ngoài phần mở đầu (3 trang), kết luận – kiến nghị (2 trang), danh mục công bố (2 trang) tài liệu tham khảo (22 trang) luận án chia thành chương sau Chương 1: Tổng quan (38 trang) Chương 2: Vật liệu - phương pháp (38 trang) Chương 3: Kết - biện luận (52 trang) ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN: Đã nghiên cứu đánh giá mức độ biểu gen/protein liên quan đến tế bào gan mADSC Kết cho thấy: mADSC biểu cao gen liên quan đến tế bào gan ALB, CK18, CK19, TNF, c-met, CYP1A1, AFP, MUC1 LDL receptor mADSC không biểu HNF4α mADSC biểu dương tính mạnh với protein liên quan đến tế bào gan CYP1A1 HGF; dương tính trung bình với protein anfa-fetoprotein, AAT Albumin Kết thu không mang tính chất tham khảo mà cung cấp thêm sở khoa học cho đề xuất ứng dụng ADSC điều trị xơ gan Đã nghiên cứu thử nghiệm điều trị thành công chuột bệnh xơ gan CCl4 liệu pháp cấy ghép mADSC có kết hợp với PRP Liệu pháp điều trị an toàn, 100% chuột sống cải thiện tiêu sau ghép Hiện tại, có công bố giới việc ứng dụng ADSC PRP điều trị xơ gan Tuy nhiên, nghiên cứu kết hợp thành phần chưa công bố Đã nghiên cứu phân tích vai trò điều trị mADSC chuột xơ gan Kết cho thấy mADSC có khả di cư “homing” gan, số lượng tế bào tồn gan đạt cực đại sau ngày ghép (70%) Việc ghép mADSC giúp giảm tế bào viêm kích thích tăng biểu gen tan xơ Trong giới hạn nghiên cứu này, mADSC biệt hoá thành tế bào gan điều kiện in vitro (dịch chiết gan xơ) in vivo sau 21 ngày PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: Sử dụng phương pháp phân lập nuôi cấy tế bào để tăng sinh số lượng tế bào gốc Sử dụng kĩ thuật thao tác chuột để gây tạo chuột xơ gan thu nhận mô từ động vật phục vụ cho đánh giá Sử dụng phương pháp qRT-PCR (PCR phiên mã ngược định lượng) để đánh giá biểu gen Sử dụng phương pháp nhuộm hoá mô, hoá mô miễn dịch để đánh giá cấu trúc mô học Sử dụng máy phân tích tế bào theo dòng chảy (flow cytometer) để đánh giá kiểu hình miễn dịch, phân tích máu ngoại vi đánh giá di cư tế bào Sử dụng phương pháp xử lý thống kê Student's t-Tests (độ tin cậy 0.05) phân tích số liệu KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Kết nội dung 1: Thu nhận, nuôi cấy tăng sinh xác định đặc điểm tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột 3.1.1 Kết thu nhận tế bào đơn từ mô mỡ chuột xơ gan CCl4 Kết thu nhận tế bào từ mô mỡ chuột xơ gan (cỡ mẫu = 5) cho thấy tế bào sau phân tách có tỷ lệ sống khoảng 85% (Bảng 3.1), tế bào sau thu nhận nuôi cấy để tăng sinh số lượng tế bào gốc trung mô ứng viên phục vụ cho đánh giá Bảng Kết thu nhận tế bào đơn từ mô mỡ chuột xơ gan Hình thái tế bào sau nuôi cấy mADSC tế bào có khả bám dính, dạng hình thoi, thuôn dài hai đầu đặc trưng tế bào gốc trung mô Sau 72 giờ, tế bào gốc trung mô bắt đầu trải bề mặt bình nuôi, có hình dạng đặc trưng (Hình 3.1) Các tế bào sau cấy chuyền lần đầu có tốc độ tăng trưởng nhanh so với tế bào sơ cấp, sau tuần tế bào đạt mật độ 70-80% diện tích bề mặt nuôi cấy, hình dạng tế bào tương đối đồng nhất, hình dạng giống nguyên bào sợi B A C D Hình Hình thái tế bào sau nuôi cấy A Thời điểm giờ; B Thời điểm 72 giờ; C Sau cấy chuyền lần 3; D Sau cấy chuyền lần 10 3.1.2 Đánh giá kiểu hình miễn dịch, khả biệt hoá thành tế bào mỡ mADSC Tế bào gốc hệ thứ 3, 5, 10 đánh giá kiểu hình miễn dịch phương pháp flow cytometry (dòng chảy tế bào) (bảng 3.2) Nhận xét: mADSC thu nhận có kiểu hình miễn dịch sau: CD14-/CD34/CD45-/CD44+/CD90+/CD105+, kiểu hình đặc trưng tế bào gốc trung mô Kiểu hình trì qua nhiều hệ nuôi cấy (từ P3-P10) Bảng Tổng kết phần trăm biểu marker mADSC hệ 3.1.3 Kết đánh giá khả biệt hoá thành tế bào mỡ Các mADSC cảm ứng môi trường biệt hoá thành mỡ chuyển dạng tích luỹ giọt mỡ tế bào chất Nhuộm Oil Red O cho kết dương tính (Hình 3.2) A B Hình mADSC sau 21 ngày biệt hoá thành tế bào mỡ A Tế bào chứa giọt mỡ bên tế bào chất; B Tế bào mỡ dương tính với thuốc nhuộm Oil red O (màu đỏ) Theo tiêu chí đặt ra, kết luận mADSC phân lập theo quy trình phù hợp cho nghiên cứu Kết tương tự với nghiên cứu khác [141, 252] 3.2 Kết nội dung 2: Nghiên cứu tiềm ADSCs trị liệu bệnh gan thông qua đánh giá biểu gen liên quan đến dòng tế bào gan khả biệt hoá thành tế bào gan in vitro mADSC 3.2.1 Kết đánh giá biểu gen: HGF, HNF4α, CK18, CK19, c-met, CYP1A1, ALB, AFP SDF-1 mADSC P3 Kết cho thấy mADSC gần không biểu HNF4α Ngược lại, mADSC biểu lượng cao xấp xỉ gen đặc trưng cho tế bào gan (ALB, CK18, CK19, c-met, CYP1A1, MUC1 LDL receptor), ALB LDL biểu mức thấp so với gen lại Điều gợi ý cho tiềm điều trị bệnh gan nguồn tế bào gốc Kết phân tích FCM số protein liên quan đến gan mADSC P3 trình bày Bảng 3 Hình 3 Kết đánh giá biểu protein liên quan đến tế bào gan Bảng 3 Kết phân tích phần trăm dương tính protein liên quan đến tế bào gan dòng mADSC P3 Nhận xét: mADSC hệ P3 biểu mạnh protein HGF CYP1A1, biểu mức trung bình yếu (từ 30-50%) marker anfa – FP, AAT ALB Kết củng cố thêm cho kết đánh giá biểu gen nêu Việc biểu mạnh HGF khả tiết yếu tố HGF, nhân tố quan trọng trình tái tạo gan 3.2.2 Thử nghiệm cảm ứng mADSC thành tế bào gan sử dụng môi trường bổ sung yếu tố tăng trưởng chất cảm ứng khác Sự thay đổi hình thái tế bào sau cảm ứng môi trường Tại thời điểm 10 ngày sau cảm ứng, mADSC trì hình dạng giống nguyên bào sợi Từ ngày 14 đến ngày thứ 21, mADSC thay đổi thành dạng tế bào hình oval hình tròn với vùng nhân lõm dễ quan sát (Hình 3.4) Kết tương tự nghiên cứu Yoshihiro Kamada et al (2009) Kết cho thấy CCl4 tác động đến tế bào gan, gây tổn thương làm thay đổi đến hình thái bên gan chuột Nhận xét mô học mức độ xơ hoá Bảng 3.4 Mức độ viêm xơ gan đọc theo hệ thống tính điểm Knodell-Ishak Hình 3.8 Kết nhuộm HE A Đối chứng; B, C, D Nhóm I, II, III Nhóm đối chứng có mức độ viêm 1/18 thay đổi cấu trúc mạch máu, ống mật Ngược lại, nhóm thí nghiệm có biểu chung hoại tử số vùng tiểu thùy, quanh khoảng cửa quanh tĩnh mạch trung tâm Nhân tế bào phân mảnh, có xuất dãy tế bào lympho dãy xơ, mô gan thay mô liên kết, tất mẫu ghi nhận xơ gan từ 3-5/6 (theo hệ thống tính đểm HAI) (Bảng 3.4, Hình 3.8) Từ kết ghi nhận được, chọn CCl4 liều 1.0 ml/kg liều tối ưu để xây dựng mô hình chuột Swiss xơ gan 3.3.2 Kết gây tạo mô hình xơ gan với liều CCl4 chuẩn hoá Sự thay đổi khối lượng men gan Khối lượng thể chuột thay đổi rõ rệt sau 11 tuần cảm ứng với CCl4 (1.00 ml/kg) Sự tăng AST ALT máu cho thấy hiệu gây độc CCl4 gan chuột Ngoài ra, thay đổi bilirubin trực tiếp albmin thay đổi chức gan sau xử lý với CCl4 (Bảng 3.5) Kết tương tự với nghiên cứu Ohashi cs (2012)[170] 12 Bảng 3.5 Chỉ số loại men gan Hình 3.9 Biểu đồ so sánh mức độ biểu gen nhóm thí nghiệm Hơn nữa, tỉ lệ AST/ALT nhóm mô hình nhỏ tình trạng viêm cấp tính nhóm chuột uống CCl4 [228] Tuy nhiên, để khẳng định mức độ xơ gan việc đánh giá tiêu phân tử mô học cần thiết Sự thay đổi mức độ biểu gen xơ hoá Kết cho thấy mức độ biểu gen fibronectin, TGF-β1, integrin, nt5e, procollagen thay đổi so với nhóm chứng Integrin, fibronectin procollagen tăng đáng kể nhóm mô hình TGF-β1 nt5e tăng nhẹ so với nhóm chứng (Hình 3.9) Sự thay đổi cấu trúc mô học số xơ gan Cấu trúc vi thể cho thấy khác biệt rõ rệt nhóm mô hình nhóm chứng Trên nhóm mô hình (CCl4 ml/kg, 11 tuần), tế bào gan bị hoại tử nhiều, vị trí xung quanh mạch máu ống mật xuất dãy sợi collagen Sợi collagen chiếm phần lớn cấu trúc gan (Hình 3.10) 100% chuột ghi nhận mức độ xơ 3-5/6 13 Hình 10 Kết nhuộm mô H&E Masson Trichrom A, B Nhuộm HE Chuột thường chuột xơ gan; C, D Nhuộm Masson Trichrom chuột xơ gan Sự biểu protein liên quan đến xơ gan collagen type I sma-anfa Hình 11 Kết nhuộm collagen nhóm đối chứng, nhóm uống dầu olive nhóm chuột uống CCl4 Hình 12 Kết nhuộm sma-anfa nhóm đối chứng, nhóm uống dầu olive nhóm chuột uống CCl4 (mũi tên màu vàng: tế bào dương tính với sma-anfa) Kết cho thấy, nhóm chuột uống CCL4 tích tụ nhiều collagen type I (Hình 3.11) mô gan (dương tính bắt màu đỏ) Dãy collagen có xu 14 hướng bắt cầu tạo thành mô gan, dạng xơ gan nhiều Mô gan chuột dương tính với marker nguyên bào sợi smaanfa Kết khẳng định mô hình chuột xơ gan tạo theo quy trình mang đầy đủ tiêu chí cần thiết để phục vụ nghiên cứu 3.4 Kết nội dung 4: Nghiên cứu điều trị thực nghiệm xơ gan chuột liệu pháp cấy ghép tế bào gốc Trong nội dung nghiên cứu này, tiến hành khảo sát hiệu điều trị xơ gan mADSC có kết hợp với huyết tương giàu tiểu cầu Chuột sau điều trị đánh giá tiêu tương tự chuột mô hình xơ gan 3.4.2.1 Cấy ghép mADSC cải thiện mức độ hoại tử tế bào gan (cải thiện số AST ALT) Sau 11 tuần xử lý CCl4, giá trị men AST (246.6 ± 65.86) ALT (187.7 ± 50.65) nhóm mô hình cao từ 7-8 lần so với nhóm đối chứng (p[...]... vụ nghiên cứu 3.4 Kết quả nội dung 4: Nghiên cứu điều trị thực nghiệm xơ gan trên chuột bằng liệu pháp cấy ghép tế bào gốc Trong nội dung nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu quả điều trị xơ gan của mADSC có và không có kết hợp với huyết tương giàu tiểu cầu Chuột sau điều trị được đánh giá các chỉ tiêu tương tự chuột mô hình xơ gan 3.4.2.1 Cấy ghép mADSC cải thiện mức độ hoại tử tế bào gan. .. gan xơ làm thay đổi hình thái mADSC thành tế bào giống tế bào gan Tế bào có biểu hiện chuyển dạng từ ngày thứ 7 và từ ngày thứ 14 ghi nhận các tế bào chuyển dạng từ hình thoi thuôn dài 2 đầu thành dạng tế bào đa 19 giác Từ ngày 21 các tế bào có hình sỏi với nhân lõm và đa nhân, hình dạng tương đồng với tế bào ung thư gan HepG2 (Hình 3.16) Hình 3.16 Sự thay đổi hình dạng của mADSC khi nuôi trong môi... “homing” của mADSC trên cơ thể chuột xơ gan Trong liệu pháp truyền tĩnh mạch trên chuột xơ gan, sau 3 ngày ghép số lượng tế bào mắc kẹt tại phổi là khoảng dưới 10% Khoảng 70% tế bào ghép tồn tại ở gan sau 3 ngày, đây cũng là giá trị cực đại mà chúng tôi khảo sát được (Hình 3.19) Hình 3.19 Phần trăm tế bào dương tính CFDA tại gan và phổi ở các thời điểm sau ghép Hình 3 20 Kết quả nhuộm IHC mô gan sau 21 ngày... tạo mô hình chuột xơ gan trên giống chuột đực Swiss Chuột xơ gan do CCl4 biểu hiện tăng cao AST, ALT và bilirubin, giảm albumin, tăng vượt mức các gen fibronectin, intergrin, TGF-beta 1, procollagen và nt-5e, mô gan xơ dương tính với collagen I và α-sma Đánh giá đặc điểm mô học cho thấy mức độ xơ là 3-5/6 (theo HAI) 4 Phác đồ mADSC (5.105 tế bào/ con) cho hiệu quả điều trị xơ gan trên chuột 100% chuột. .. đến thiếu các yếu tố kích thích tái tạo tế bào gan, số lượng tế bào gan lại càng thiếu hụt, điều này tạo ra một vòng xoắn bệnh lý trong xơ gan [165, 174] Sự kết hợp ADSC và PRP đã cho thấy hiệu quả trên nhiều bệnh [178], nhưng trên xơ gan thì chưa được nghiên cứu nhiều Trong nghiên cứu này, việc ghép ADSC (không kết hợp PRP) giúp cải thiện tình trạng xơ gan trên chuột, nhưng khi kết hợp với PRP thì hiệu... vàng: các tế bào dương tính với sma-anfa) Kết quả cho thấy, nhóm chuột uống CCL4 tích tụ nhiều collagen type I (Hình 3.11) trong mô gan (dương tính bắt màu đỏ) Dãy collagen có xu 14 hướng bắt cầu tạo thành các hòn trong mô gan, một dạng của xơ gan nhiều hòn Mô gan chuột cũng dương tính với marker của nguyên bào sợi cơ smaanfa Kết quả này khẳng định mô hình chuột xơ gan được tạo ra theo quy trình trên mang... thiện chức năng gan sau khi cấy tế bào A B Hình 3.15 A Kết quả định lượng phần trăm diện tích mô gan dương tính với collagen I sau 21 ngày ghép mADSC; B Kết quả nhuộm kháng thể smaanfa sau 21 ngày ghép tế bào Trong nghiên cứu này, ADSC được thu nhận từ chuột xơ gan và cấy ghép lại vào chính cơ thể chuột bệnh PRP được thu nhận từ nhiều chuột khoẻ mạnh Điều khác biệt ở gan chuột so với gan người đó là... nhuộm mô gan sau 21 ngày ghép cho thấy sự hiện diện của tế bào ghép (tế bào màu xanh lá cây (Hình 3.20) Điều này chứng tỏ tế bào ghép đã di cư về gan sau 21 ngày cấy ghép 3.5.2.2 Đánh giá vai trò ức chế tế bào viêm/miễn dịch của mADSC Sau xử lý CCl4, chuột xơ gan biểu hiện tăng bạch cầu hạt trung tính (từ 9,75± 0,94% lên 28,34 ± 7,87%), giảm tế bào lympho và mono Kết quả cho thấy tình trạng viêm của chuột. .. nhóm chứng (Hình 3.9) Sự thay đổi cấu trúc mô học và chỉ số xơ gan Cấu trúc vi thể cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa nhóm mô hình và nhóm chứng Trên nhóm mô hình (CCl4 1 ml/kg, 11 tuần), các tế bào gan bị hoại tử nhiều, tại vị trí xung quanh mạch máu và ống mật xuất hiện các dãy sợi collagen Sợi collagen chiếm phần lớn cấu trúc gan (Hình 3.10) 100% chuột được ghi nhận ở các mức độ xơ 3-5/6 13 Hình 3 10... Kết quả nhuộm mô bằng H&E và Masson Trichrom A, B Nhuộm HE trên Chuột thường và chuột xơ gan; C, D Nhuộm Masson Trichrom trên chuột xơ gan Sự biểu hiện protein liên quan đến xơ gan như collagen type I và sma-anfa Hình 3 11 Kết quả nhuộm collagen trên nhóm đối chứng, nhóm uống dầu olive và nhóm chuột uống CCl4 Hình 3 12 Kết quả nhuộm sma-anfa trên nhóm đối chứng, nhóm uống dầu olive và nhóm chuột uống