MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Bacteriocin loại protein tổng hợp vi khuẩn Nó có khả ức chế phát triển loại vi khuẩn có cấu trúc tương tự Bacteriocin A.Gratia tìm thấy năm 1925 Ông thực công trình nghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn, kết công trình tác động mạnh đến phát triển chất kháng sinh chất kháng khuẩn sinh từ vi khuẩn [45] Bacteriocin đa dạng cấu trúc, chức năng, sinh thái Bacteriocin có khả tiêu diệt vi khuẩn khác tạo thành kênh làm thay đổi tính thấm màng tế bào, nhiều loại bacteriocin có khả phân giải ADN, ARN công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào Vì bacteriocin dùng nhiều bảo quản thực phẩm, xử lý môi trường, chế biến thức ăn chăn nuôi [16] Vi khuẩn lactic quan tâm nhiều chúng có khả sinh tổng hợp nên bacteriocin Vì việc nghiên cứu vi khuẩn lactic bacteriocin vấn đề thiết thực có ý nghĩa to lớn sống người[40] Vi khuẩn lactic ứng dụng nhiều ngành sản xuất, đặc biệt công nghiệp thực phẩm số ngành chế biến khác chúng có khả sinh axit, tạo hương kháng số vi khuẩn nhờ khả sinh tổng hợp bacteriocin[3] Trong công nghiệp thực phẩm, việc nghiên cứu tuyển chọn tạo chủng vi khuẩn lactic có khả tổng hợp bacteriocin cao để sử dụng trình lên men lactic không nhằm mục đích bảo quản mà nhằm đưa thị trường loại sản phẩm có tính chất hương vị mong muốn[41] Các hướng ứng dụng bacteriocin chủ yếu gồm: - Bảo quản thực phẩm - Bảo quản sản phẩm sữa - Bổ sung vào thức ăn gia súc - Muối chua rau Bên cạnh vi khuẩn lactic sử dụng để sản xuất chế phẩm Probiotic - sản phẩm chứa hay nhiều loại vi sinh vật sống có lợi cho hệ tiêu hoá Chúng có khả cải thiện hệ thống vi sinh đường ruột, tác dụng tốt đến sức khoẻ người hay động vật Các chủng vi khuẩn sử dụng tạo chế phẩm Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei [47] Trong ngành mỹ phẩm bacteriocin sử dụng thành phần số loại mỹ phẩm chăm sóc da có tính diệt khuẩn giữ ẩm[17] Những năm gần nghiên cứu giới xác định chất bacteriocin đồng thời xác định số loại bacteriocin vi khuẩn lactic sinh khả ứng dụng Những công trình có đóng góp tích cực , nâng cao chất lượng sống người Đã có nghiên cứu nước quan tâm dến việc sử dụng bacteriocin vi khuẩn lactic tổng hợp để bảo quản thực phẩm, thay loại hoá chất bảo quản độc hại đồng thời tạo sản phẩm có chất lượng cao Tuy nhiên để thu nhận bacteriocin, cần thiết phải chọn lựa củng vi khuẩn có khả tổng hợp cao tiến tới tạo dựng kỹ thuật sinh học chủng thích hợp phục vụ cho sản xuất công nghiệp Từ vấn đề cấp thiết việc nghiên cứu khả sinh tổng hợp bacteriocin (chất kháng khuẩn) số chủng vi khuẩn lactic vấn đề quan trọng việc nghiên cứu vi khuẩn lactic Chính vậy, mạnh dạn chọn đề tài: ‘Nghiên cứu khả sinh tổng hợp bacteriocin vi khuẩn lactic’ Vi khuẩn lactic phân lập từ nhiều nguồn khác dưa chua, nem chua, sữa chua chọn nem chua làm nguồn để phân lập vi khuẩn lactic cho việc nghiên cứu MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI - Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp bacteriocin cao -Khảo sát số đặc điểm sinh lý yếu tố ảnh hưởng đến khả tổng hợp bacteriocin chủng tuyển chọn - Khảo sát khả kháng vi sinh vật gây bệnh tìm hiểu chất bacteriocin thu nhận Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI - Phân lập vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp bacteriocin - Xác định tính chất đối kháng bacteriocin với số loại vi sinh vật gây bệnh -Xác định điều kiện nuôi cấy tốt để vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacteriocin cao - Bước đầu tìm hiểu chất bacteriocin Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI - Đẩy mạnh hướng nghiên cứu ứng dụng bacteriocin việc sản xuất chất bảo quản dùng cho thực phẩm CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN Luận văn bao gồm chương mục sau: Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng hình vẽ Mở đầu Chương 1: Tổng quan Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết thảo luận Chương 4: Kết luận kiến nghị Tài liệu tham khảo Phụ lục Chương TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC 1.1.1.Đặc điểm chung vi khuẩn lactic Hầu hết vi sinh vật sinh axit lactic thuộc họ Lactobacillaceae xếp vào bốn chi: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus Leuconostoc Vi khuẩn lactic lên men dễ dàng loại đường đơn glucose, galactose, mannose đường kép saccharose, maltose, lactose đồng hóa cách chọn lọc Còn polysacarit (dextrin, tinh bột, inulin ) lên men lactic vài loài vi khuẩn [4] Vi khuẩn lactic vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao Để sinh trưởng bình thường, nguồn cacbon chúng cần nitơ, axit amin, số vitamin, chất sinh trưởng chất khoáng Trong trình lên men, axit lactic tự sinh kìm hãm trình sinh trưởng có mặt chất đệm cần thiết để trì trình lên men [4] Vi khuẩn lactic thường đòi hỏi đạm hữu (protein, peptit, axit amin) Chỉ có số loài có khả sinh trưởng môi trường có đạm vô nguồn đạm Muốn phát triển bình thường vi khuẩn lactic thường đòi hỏi số chất sinh trưởng Có loại vi khuẩn lactic (Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus casei, Lactobacillus arabinosus ) có tính mẫn cảm cao loại chất sinh trưởng Người ta thường sử dụng chúng để tiến hành định lượng chất sinh trưởng Về mặt hình thái vi khuẩn lactic có dạng lưỡng cầu, tứ cầu, liên cầu thành chuỗi [4] Streptococcus lactic loại vi khuẩn có hình bầu dục thường đứng thành đôi hay thành chuỗi ngắn Chúng phát triển thích hợp 30- 35oC Khi phát triển sữa chúng làm tích lũy khoản 0.8-1.0% axit lactic tức khoảng 110-120ot (1ot lượng axit chứa 100ml sữa trung hòa 1ml NaOH 0.1N) Streptococcus cremoris loại cầu khuẩn xếp thành hình chuỗi, phát triển tốt 25-30oC, khả lên men maltose dextrin, khả tích lũy axit lactic tương tự Streptococcus lactic, gram dương không sinh bào tử Lactobacillus bulgariccus loại trực khuẩn hình que dài, phát triển tốt 40-48oC, có khả tích lũy đến 3-3.5% axit lactic, gram dương không sinh bào tử Lactobacillus acidophillus có hình dạng tương tự Lactobacillus bulgariccus Chúng phát triển tốt 40oC, không sinh bào tử Vi khuẩn Lactobacillus delbruckii loại trực khuẩn hình que ưa nhiệt, chúng thích hợp phát triển 48-52oC có khả tích lũy axit lactic, gram dương không sinh bào tử S citrovorus, S paracitrovorus, S diaxeli lactic S thermophilus có tế bào thường xếp thành hình chuỗi, gram dương không sinh bào tử L lactic, L thermophilus trực khuẩn không tạo bào tử, gram dương không di động L casei L plantarium trực khuẩn xếp thành chuỗi, gram dương không sinh bào tử 1.1.2.Quá trình lên men lactic [5] Lên men lactic trình chuyển hóa đường thành axit lactic sản phẩm khác thực nhờ vi khuẩn lactic Tùy thuộc vào sản phẩm tạo thành mà trình lên men lactic chia làm hai loại: lên men đồng hình lên men dị hình Trong trình lên men đồng hình, sản phẩm axit lactic Ngoài có lượng nhỏ axit bay hơi, rượu ethanol sản phẩm khác Quá trình lên men lactic đồng hình biểu diễn sau: C6H12O6 CH3COCOOH Glucose CH3CHOHCOOH + Q axit piruvic axit lactic Ở trình lên men dị hình, axit lactic sản phẩm chủ yếu mà có nhiều sản phẩm khác axit acetic, ethanol, CO2, H2 tạo thành với lượng đáng kể Quá trình lên men lactic dị hình biểu diễn sau: C6H12O6 CH3CHOHCOOH + CH3CH2OH + Glucose axit lactic rượu etylic COOHCH2CH2COOH + CH3COOH+ CO2 +H2 axit sucxinic axit acetic Số lượng sản phẩm phụ hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, vào môi trường dinh dưỡng điều kiện ngoại cảnh, thông thường axit lactic chiếm 40%, axit sucxinic chiếm khoảng 20%, rượu etylic chiếm khoảng 10%, axit acetic chiếm khoảng 10% loại khí chiếm khoảng 20% Trong số loại vi khuẩn lên men lactic điển hình cần phải kể đến loài: Streptococcus lactic, Streptococcus cremoris, Lactobacillus bulgariccus, Lactobacillus (thermobacterium cereale), acidophillus, Lactobacillus Lactobacillus plantarum, delbruckii Lactobacillus cucumeris fermentatic Còn thuộc loại vi khuẩn lên men lactic không điển hình có loài giống Leuconostoc (Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextraniccus) giống phụ beta bacterium 1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng vi khuẩn lactic[4][8] 1.1.3.1 Nguồn cacbon Nguồn cacbon tốt loại đường, polisacarit thực chất lên men Tốc độ lên men loại đường monosacharit, disacharit oligosacharit khác Nếu nhân giống người ta dùng loại đường thông thường vi khuẩn thích nghi với loại đường sau chúng phát triển có hiệu môi trường chứa loại đường mà không làm ảnh hưởng đến khả lên men nguồn cacbon khác 1.1.3.2 Vitamin Hàm lượng vitamin môi trường giữ vai trò quan trọng sinh trưởng phát triển vi khuẩn lactic Vitamin B6 vitamin quan trọng sinh tổng hợp axit amin vi khuẩn lactic thay số axit amin khác Tuy nhiên tuỳ thuộc vào loại vi khuẩn lactic, nhiều loại axit amin coi axit amin không thay thế, tức buộc phải có mặt môi trường Sự phụ thuộc tốc độ sinh trưởng vi khuẩn lactic vào nồng độ vitamin định lượng phép thử Vì việc xác định loại vitamin cần thiết cho sinh trưởng loại vi khuẩn lactic khác quan trọng nghiên cứu ảnh hưởng thành phần môi trường đến sinh trưởng phát triển vi khuẩn lactic 1.1.3.3 Nhiệt độ Nhiệt độ nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sinh trưởng vi khuẩn lactic Tuỳ thuộc vào nhiệt độ tối ưu cho lên men cho sinh trưởng, vi khuẩn lactic chia làm loại: loại ưa nhiệt loại ưa ấm Loại ưa nhiệt gồm có: L bulgaricus, L thermophilus, L delbrueckii phát triển tốt 45-62oC Loại ưa ấm gồm có L causasicus, L lactis, L helveticus, L acidophilus, L bifidus phát triển tốt 37-45oC L casei, L plantarum, L.leichmanii, L brevis, L buchneri, L pastorianus phát triển tốt 28-32oC 1.1.3.4 Muối khoáng Photphat loại muối quan trọng mà vi khuẩn lactic yêu cầu Các muối amôn dùng làm nguồn nitơ song chúng gây ảnh hưởng định lên chuyển hoá số axit amin Sự có mặt số loại muối khoáng bắt buộc hàm lượng có sẵn chúng môi trường phức hợp đầy đủ 1.2.TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN 1.2.1.Giới thiệu chung Bacteriocin [34], [45] Bacteriocin loại protein sinh tổng hợp vi khuẩn Nó có khả ức chế phát triển loại vi khuẩn có cấu trúc tương tự Bacteriocin A.Gratia tìm thấy năm 1925 trình nghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn, kết công trình thúc đẩy phát triển nghiên cứu chất kháng sinh chất kháng khuẩn sinh từ vi khuẩn Ông gọi chất phát Colicin có khả tiêu diệt E.coli Những năm gần đây, nghiên cứu bacteriocin chủ yếu tập trung vào vi khuẩn gram âm, điển hình colicins Tuy nhiên nghiên cứu bacteriocin sinh tổng hợp vi khuẩn gram dương tiến hành có nhiều báo cáo cung cấp thông tin vấn đề Những sản phẩm vi khuẩn sinh có khả gây ức chế vi khuẩn khác có nhiều enzyme, antibiotic, bacteriocin Người ta đưa nhiều tiêu chí để định nghĩa bacteriocin, tiêu chí dùng nhiều trường hợp, áp dụng với nhiều mức độ khác để định nghĩa loại bacteriocin khác Những tiêu chí sau: - Phạm vi ức chế loại khác - Sự có mặt loại protein hoạt động - Cách thức hoạt động có tính kháng khuẩn - Loại tế bào mà tác dụng - Những yếu tố di truyền - Do trình tổng hợp sinh học có tính ức chế 1.2.2 Tính đối kháng phương pháp xác định tính đối kháng [34] Tính đối kháng khả ức chế phát triển vi sinh vật Hiện người ta xác đinh nhiều chất có khả ức chế phát triển vi sinh vật bacteriocin, chất kháng sinh, virus xâm nhiễm vi khuẩn Vì nghiên cứu bacteriocin vấn đề quan trọng phải xác định xem loại vi khuẩn mà nghiên cứu có tính đối kháng loài vi sinh vật hay không Hiện người ta xác định số loại bacteriocin kháng đồng thời nhiều loại vi sinh vật 1.2.2.1.Phương pháp xác định tính đối kháng Để xác định tính đối kháng, việc thử nghiệm tiến hành môi trường rắn có chủng thị Tính đối kháng thể chủng thị bị ức chế môi trường Hai phương pháp xác định tính đối kháng thường sử dụng phương pháp đối kháng đồng thời phương pháp đối kháng Phương pháp đối kháng đồng thời đơn giản A.Gratia đưa Trong phương pháp chủng thử nghiệm chủng thị nuôi cấy môi trường, tính đối kháng thể việc chất ức chế chủng thử nghiệm khuếch tán vào môi trường gây ức chế chủng thị Sử dụng đĩa thạch nuôi cấy chủng thị, sau tạo giếng đĩa thạch cho chủng thử nghiệm nuôi ủ vào giếng Phương pháp thích hợp kiểm tra khuẩn lạc riêng lẽ áp dụng rộng rãi nghiên cứu mặt di truyền Phương pháp đối kháng Fredericq đưa sau cải tiến thêm Trong phương pháp này, chủng thử nghiệm nuôi ủ đĩa thạch - Khả sinh tổng hợp bacteriocin xảy sau 12 nuôi ủ (theo khoảng thời gian nghiên cứu) dừng lại sau 24-28 - Ở nhiệt độ 48oC trở lên chủng L4BN không sinh tổng hợp bacteriocin 3.4.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ vô đến khả sinh tổng hợp bacteriocin Nitơ vô thành phần dinh dưỡng quan trọng sinh trưởng phát triển nhiều loại vi sinh vật có vi khuẩn lactic Nguồn nitơ vô dễ hấp thụ vi sinh vật muối amôn Hầu loại vi sinh vật có khả đồng hoá muối amôn Do tiến hành khảo sát ảnh hưởng số muối amôn đến khả sinh tổng hợp bacteriocin Các loại muối chọn: NH 4Cl, NH4H2PO4, NH4C2O (NH4)2SO4 Chủng L4BN tiến hành nuôi tĩnh ổn nhiệt môi trường dịch thể MRS với tỉ lệ phối giống 0.01% có bổ sung nguồn nitơ vô 0.1% Tiến hành nuôi 37oC 24 Kết xác định khả sinh tổng hợp bacteriocin trình bày hình 3.14 (Kết phân tích qua lần đo thể phụ lục 3) Hình 3.14 Ảnh hưởng nguồn nitơ vô đến khả sinh tổng hợp bacteriocin Từ đồ thị nhận thấy bổ sung vào môi trường lượng nitơ định trước có ảnh hưởng đến sinh tổng hợp bacteriocin chủng L4BN Muối amoni photphat nguồn nitơ thích hợp cho sinh tổng hợp bacteriocin chủng L4BN, lượng bacteriocin đạt đến 320 AU/ml cao hẳn so với môi trường không bổ sung nitơ vô đồng thời lượng bacteriocin sinh cao so với muối khác Với NH 4Cl NH4C2O4 lượng bacteriocin sinh 160AU/ml, với (NH4)2SO4 lượng bacteriocin sinh 40AU/ml Nguyên nhân gây khác gốc photphat có tính đệm cao tính axit yếu nên không làm giảm pH môi trường nhiều gốc khác Đối với muối khác sau đồng hoá gốc amôn, môi trường tích luỹ gốc anion vô Cl-, SO42- làm giảm pH môi trường Đối với vi khuẩn lactic điểm quan trọng trình sinh trưởng chúng phụ thuộc nhiều vào pH Như việc bổ sung nguồn muối khoáng đặc biệt amoni photphat yếu tố làm tăng khả sinh tổng hợp bacteriocin chủng L4BN 3.4.3 Ảnh hưởng số loại đường đến khả sinh tổng hợp bacteriocin Các cacbohydrat thành phần dinh dưỡng quan trọng sinh trưởng phát triển vi sinh vật Chủng L4BN có khả lên men số loại đường theo nghiên cứu Ở khảo sát ảnh hưởng glucose, sacharose, lactose, mannose arabinose đến khả sinh tổng hợp bacteriocin chủng L4BN Chủng L4BN tiến hành nuôi tĩnh ổn nhiệt môi trường dịch thể MRS với tỉ lệ phối giống 0.01% có bổ sung đưòng với tỉ lệ 1% Tiến hành nuôi 37oC 24 Kết xác định khả sinh tổng hợp bacteriocin trình bày hình 3.15 (Kết phân tích qua lần đo thể phụ lục 3) Hình 3.15 Ảnh hưởng số loại đường đến khả sinh tổng hợp bacteriocin Từ đồ thị nhận thấy bổ sung vào môi trường nguồn cacbohydrat có ảnh hưởng đến sinh tổng hợp bacteriocin chủng L4BN Tất loại đường làm tăng khả sinh tổng hợp bacteriocin so với nuôi ủ môi trường đơn Glucose nguồn cacbohydrat thích hợp cho sinh tổng hợp bacteriocin chủng L4BN, lượng bacteriocin đạt đến 640 AU/ml cao hẳn so với môi trường không bổ sung đường đồng thời lượng bacteriocin sinh cao so với loại đường khác Điều dễ lý giải tất loại đường, glucose loại đường mà vi sinh vật dễ đồng hoá giai đoạn vi sinh vật phát triển tốt sử dụng nhanh, mạnh lượng glucose nguyên nhân dẫn đến khả sinh tổng hợp bacteriocin cao Với lactose, sacharose, mannose lượng bacteriocin sinh 320AU/ml, với arabinose lượng bacteriocin sinh 160AU/ml Một loại đường mà vi sinh vật khó đồng hóa arabinose thực nghiệm cho thấy việc sử dụng đường arabinose chủng L4BN hạn chế, nguyên nhân dẫn đến khả sinh tổng hợp bacteriocin không cao Như việc bổ sung thêm cacbohydrat đặc biệt glucose với tỉ lệ 1% yếu tố làm tăng khả sinh tổng hợp bacteriocin chủng L4BN 3.5 CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN TÍCH BACTERIOCIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI 3.5.1 Chiết tách xác định hoạt tính bacteriocin Để xác định trọng lượng phân tử bacteriocin tiến hành nuôi cấy để thu nhận lượng bacteriocin lớn Chủng L4BN tiến hành nuôi tĩnh ổn nhiệt 500ml môi trường dịch thể MRS với tỉ lệ phối giống 0.01% có bổ sung đưòng glucose với tỉ lệ 1% muối NH4H2PO4 với tỉ lệ 0.1% Tiến hành nuôi 37oC 24 Môi trường dịch thể sau được chiết tách bacteriocin theo quy trình sau: Quy trình chiết tách bacteriocin Ly tâm dịch cấy( 4oC, 16000 vòng/15 phút) ↓ Kết tủa dịch bên với 50% (NH4)SO4 bão hoà ↓ Để qua đêm ↓ Ly tâm hỗn hợp (4oC, 16000 vòng/15 phút) ↓ Lọc lấy kết tủa ↓ Hoà tan photphat buffer ↓ Tiến hành điện di Kết điện di trình bày mục 3.4.3 Thử hoạt tính bacteriocin: Protein sau kết tủa thử hoạt tính bacteriocin Với phương pháp thử hoạt tính bacterocin mục 2.2.1.2 chủng thị E.coli, kết thể hình 3.16 Hình 3.16 Hoạt tính bacteriocin Qua kết hình 3.16 cho thấy protein sau kết tủa có hoạt tính bacteriocin với chủng thị E.coli Điều chứng tỏ thành phần protein thu hồi có mặt bacteriocin Đây cho việc chạy điện di để xác định trọng lượng phân tử bacteriocin 3.5.2 Điện di đánh giá chất bacteriocin Sử dụng tác nhân hoá học để chiết tách protein Dung dịch nuôi cấy vi sinh vật ly tâm lạnh o C 16000 vòng 15 phút Lấy dịch bên cho kết tủa với 50% (NH4)SO4 bão hoà Sau để qua đêm để kết tủa hoàn toàn Ly tâm hỗn hợp 4oC 16000 vòng 15 ph sau lọc lấy kết tủa, ta chiết tách protein Hoà tan protein dung dịch photphat buffer Dùng phương pháp điện di để xác đinh trọng lượng phân tử protein sau chiết tách Giếng Giếng -97kDa 66kDa -45kDa -30kDa -20.1kDa 14.4kDa 7kDa Hình 3.17 Điện di đồ gel polyacrylamide 16% Chú thích: Giếng 1: protein chuẩn 200kDa Giếng 2: băng bacteriocin chủng L4BN Kết cho thấy protein sau chiết tách nhiễm nhiều tạp chất, trình điện di tạp chất khiến băng bị mờ Giếng protein chuẩn 200kDa Giếng băng protein chủng L4BN Băng có trọng lượng phân tử nhỏ 14.4kDa Trong điều kiện phòng thí nghiệm xác định protein có trọng lượng phân tử tối thiểu 14.4kDa không xác định trọng lượng phân tử xác bacteriocin CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1.KẾT LUẬN Qua nội dung nghiên cứu trình bày, luận văn giải số vấn đề sau: Đã phân lập tuyển chọn ba chủng vi khuẩn lactic từ nem chua có khả sinh tổng hợp bacteriocin có ký hiệu L4BN, L14BN, L15BN với chủng đối kháng E.coli Xác định chủng L4BN có khả sinh tổng hợp bacteriocin cao chủng L14BN L15BN Chủng L4BN sinh trưởng, phát triển khả axit hoá tốt 37 oC 24 Đã xác định chủng L4BN thuộc giống phụ Lactobacillus Đã khảo sát ảnh hưởng số yếu tố nhiệt độ, thời gian, nguồn nitơ vô cơ, loại đưòng đến khả sinh tổng hợp bacteriocin chủng L4BN -Khả sinh tổng hợp bacteriocin chủng L4BN thích hợp nhiệt độ 37oC 24 -Khả sinh tổng hợp bacteriocin chủng L4BN tăng có bổ sung thêm muối NH4H2PO4 với nồng độ 0.1% glucose với nồng độ 1% Chiết tách bacteriocin từ dịch môi trường theo phương pháp chiết tách protein Sau thu nhận thử khả kháng E.coli xác định chất protein bacteriocin 4.2 KIẾN NGHỊ Những vấn đề nghiên cứu vi khuẩn lactic rộng kết đạt trên, xin đề xuất nghiên cứu bổ sung sau: - Xác định tên chủng L4BN - Nghiên cứu ứng dụng khả sinh tổng hợp bacteriocin chủng L4BN vào bảo quản thực phẩm - Xác định tính chất bacteriocin chủng L4BN sinh - Xác định thêm số chủng vi sinh vật có tính đối kháng với chủng L4BN - Đánh giá trọng lượng phân tử bacteriocin phương pháp điện di SDS-PAGE TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Bộ Thuỷ sản(2005), Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [2] Cao Đăng Nguyên, Đỗ Quý Hải(2005), Giáo trình công nghệ Protein, NXB Huế [3] Hồ Sưởng(1999), Vi sinh vật bảo quản chế biến thực phẩm, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [4] Kiều Hữu Ảnh(1999), Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [5] Lê Xuân Phương(2001), Vi sinh vật công nghiệp, NXB xây dựng, Hà Nội [6] Lê Ngọc Tú(1997), Hoá sinh công nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội [7] Lê Ngọc Tú(chủ biên), Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Ngô Hữu Hợp, Đặng Thị Thu, Nguyễn Trọng Cẩn(2004), Hoá học thực phẩm, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [8] Lương Đức Phẩm(1998), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội [9] Nguyễn Lân Dũng(1983), Thực tập vi sinh vật học, NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp [10 ] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Tý(1997), Một số phương pháp nghiên cứu Vi sinh vật học- Tập 2, NXB Giáo dục, Hà Nội [11 ] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Tý(1997), Một số phương pháp nghiên cứu Vi sinh vật học- Tập 3, NXB Giáo dục, Hà Nội [12 ] Nguyễn Đức Lượng (2000), Công nghệ vi sinh vật tập 1, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh [13 ] Nguyễn Đức Lượng (2000), Công nghệ vi sinh vật tập 2, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh [14 ] Nguyễn Đức Lượng (2000), Thí nghiệm công nghệ sinh học-Tập : Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh [15] Nguyễn Đức Lượng (2000), Công nghệ vi sinh vật-Tập 2: Thực phẩm lên men truyền thống, Trường Đại học Kỹ thuật thành phố Hồ Chí Minh [16] Nguyễn thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn thị Kim Quy(2002), “Nghiên cứu khả sinh tổng hợp bacteriocin loài Lactobacillus plantarum L24”, Tạp chí di truyền học ứng dụng,115(1), tr.14-19 [17].Trần Linh Thước (2004), Phân tích vi sinh vật thực phẩm mỹ phẩm, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [18] Trần Thị Định, Vũ Thị Thư(2005), “ Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn lên men sinh tổng hợp axit lactic từ rỉ đường mía”, Tạp chí Bộ Công Nghiệp-Vụ Khoa học công nghệ, 44(2), tr.10-11 [19] Trần Thị Xô, Lê Xuân Phương(2005), Giáo án thí nghiệm Hoá sinh vi sinh, Trường Đại Học Bách Khoa, Đà Nẵng [20] Võ Nhân Hậu, Nguyễn Thị Thuỳ Linh, Phan thị Hồng Thảo, Lê Thanh Mai(2005), “ Nghiên cứu đặc điểm sinh thái, sinh lý, sinh hoá số chủng vi khuẩn lactic lựa chọn chủng thích hợp chế biến cải bẹ muối chua”, Tạp chí khoa học kỹ thuật nông nghiệp, 36(1), tr.9-10 [21] Võ Thu Uyên(2006), “Ứng dụng vi khuẩn lactobacillus mới”, Tạp chí công nghiệp Hoá chất, 13(1), tr.7-8 TIẾNG ANH [22] Beatriz Robredo and Carmen Torres(2000), Bacteriocin Production by Lactobacillus salivarius of Animal origin, Universidad de La Rioja Spain [23] D.A Kekessy and J.D Piguet(1970), New method for detecting bacteriocin production, Institute of Hygiene, Geneva, Switzerland [24] Farida khalid, Roquya Siddiqi, Naheed Mojgani(1999), Detection and characterization of a heat stable bacteriocin (lactocin LC-09) produced by a clinical isolate of lactobacilli, From Department of Microbiology, University of Karachi, Karachi-75270, Pakistan [25] John R Tagg, Adnan S Dajani and Lewis W Wannamaker(1976), Bacteriocins of Gram- Positive bacteria, Department of Microbiology, University of Otago, Dunedin, New Zealand [26] H.Farkas-Himsley and A.Pagel(1976), Bacteriocin typing by leakage of Ultraviolet Light Absorbing Material, Department of Microbiology and Parasitology, University of Toronto, Toronto, Ontario M5S 1A1, Canada [27] Luc De Vuyst, Frederic Leroy(2007), “Bacteriocin from Lactic acid bacterio: Production, Purification, and Food applications”, Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology, 13(1), pp.194-199 [28] Lejeune, Callewaert, Crabbe, De Vuyst(1998), “Modelling the growth and bacteriocin production by Lactobacillus amylovorus DCE 471 in batch cultivation”, Journal of applied microbiology, 66(2), pp.606-613 [29] M Busarcevic, M Kojic, M Dalgalarrondo, J.M Chobert, T.Haertle, L Topisirovic(2008), Purification of bacteriocin LS1 produced by human oral isolate Lactobacillus salivarius BGH01, Oral microbiology and immunology [30] M.L.Cabo, M.A Murado, M.P Gonzalez and L.Pastoriza(1999), A method for bacteriocin quantification, Instituto de Investigacion Marinas, Vigo (Pontevedra), Spain [31] Nia Xiraphi, Marina Georgalaki, Gonzalez Van Driessche, Bart Devreese, Jozef Van Beeumen, Effie Tsakalidou, John Metaxopoulos and Eleftherios H.Drosinos(2005), Purification and Characterization oF curvaticin L442, a bacteriocin produced by lactobacillus curvatus L442, Department of Food Science and Technology, Greece [32] NMKL No140,1991-UDC 579.86:57.083:637.5 [33] Patankar CV, Joshi LM(1985), “Bacteriocin production in Salmonella”, Journal of Postgrad Med, 31(1), pp.46-51 [34] Ralph W.Jack, John R.Tagg and Bibek Ray(1995), Bacteriocin of Gram Positive Bacteria, Russell Grimwade School of biochemistry, University of Melbourne, Parkville, Victoria 3052, Australia; Department oF Microbiology, University of Otago, Dunedin, New Zealand, and Department of animal Science, College of Agriculture, University of Wyoming, Laramie, Wyoming 82071-3684 [35] R.Yang, MC Johnson and b Ray(1992), Novel method to extract large amounts of bacteriocin from lactic acid bacteria , Animal Science Department, University of Wyoming, Laramie 82071 [36] Raf Callewaert and Luc De Vuyst(1999), Bacteriocin production with Lactobacillus amylovorus DCE 471 is improved and Stabilized by Fed- batch fermentation, Research group of Industrial Microbiology, Belgium [37] Svetoslav D Todorov, Leon M.T.Dicks(2007), Bacteriocin production by Lactobacillus pentosus ST712 BZ isolated from boza, Department of Microbiology University of Stellenbosch, South Africa [38] S.D Todorov and L.M.T Dicks(2005), Screening for bacteriocin producing lactic acid bacteria from boza, a traditional cereal beverage from Bulgaria Comparison of the bacteriocins, Department of Microbiology University of Stellenbosch, South Africa [39] Sinead C.Corr, Yin Li, Christian U Riedel, Paul vW Otoole, Colin Hill and Cormac G.M.Gahan(2007), Bacteriocin production as a mechanism for the antiinfective activity of lactobacillus salivarius UCC118, University College Cork, Cork, Ireland [40] Savadogo Aly*, Quattara cheik A.T, Bassole Imael H.N, Traores S.Alfred(2006), Bacteriocins and lactic acid bacteria, Universite de Quagadougou Burkina Faso [41] Soore, T.Masud and Kiran Anwaar(2002), “ Role of lactic acid bacteria in food preservation and human health”, Pakistan Journal of nutrition, 30(8), pp 584-590 [42] Takatsugu Tahara, Kazuo Kanatani, Kazushi Yoshida, Hirosumi Miura, Masaru Sakamoto and Masao Oshimura(1992), Purification and some properties of acidocin 8912, a novel Bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus TK 8912, Research laboratory, Hyogo 662, Japan [43] Todorov SD, Van Reenen CA, Dicks LM(2004), Optimization of bacteriocin production by Lactobacillus plantarum ST13BR , a strain isolated from barley beer, University of Stellenbosch- South Africa [44] Y.S Chen, F.Yanagida and J.S.Hsu(2006), “Isolation and characterization of lactic acid bacteria from Suan-tsai, a traditional fermented food in Taiwan”, Taiwan Journal of applied Microbiology, 67(2), pp.123128 CÁC TRANG WEB [45].http://www.enwikipedia org/wiki/bacteriocin, 12/11/2007 [46].http://www.biology.clc.uc.edu/, 15/03/2008 [47].http://www.hieuquakinhtecuaviecsudungvikhuanlactic.htm, 19/11/2007 [48].http:// www2.hcmut.edu.vn/, 10/03/2008 [49].http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=87512 , 12/09/07 [50].http:// www.sinhhocvietnam.com/vn/ , 6/7/2007 [51]http:// www.sciencedirect.com , 01/02/2008 [52].http://www.journal.com , 16/09/2007 [53].http://www.vinachem.com.vn/new/XBPViewContent.asp? , 8/2/2007 [...]... nghiên cứu như sau: Phân lập vi khuẩn lactic và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin cao Nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn đó Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và thành phần môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Từ đó nuôi ủ vi khuẩn lactic trong điều kiện tối ưu để thu nhận bacteriocin Nghiên cứu bản chất protein của bacteriocin. .. chủng vi khuẩn là khả năng sinh tổng hợp bacteriocin 1.2.3 Sinh tổng hợp bacteriocin [34] Điều kiện nuôi ủ đối với những loại sinh tổng hợp nên bacteriocin có ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn Đối với nhiều chủng vi sinh vật điều kiện nuôi cấy để khả năng sinh tổng hợp bacteriocin là cao nhất đã được xác định 1.2.3.1.Thành phần môi trường nuôi cấy Đối với vi khuẩn gram dương có khả năng tạo bacteriocin. .. với vi c sinh tổng hợp bacteriocin cực đại (12800AU/ml) được ghi nhận trên môi trường MRS sau 24h Nghiên cứu đã đưa ra được các loại môi trường, nhiệt độ và pH có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và thành phần hỗn hợp các loại môi trường mà vi c sinh tổng hợp bacteriocin là lớn nhất [37][38] 1.4.2 Ở Vi t Nam: Hiện nay ở nước ta vi c nghiên cứu về bacteriocin do vi khuẩn lactic sinh tổng. .. và về mặt cảm quan có nhiều ưu vi t hơn là sản phẩm thực phẩm lên men lactic tự nhiên Có được ưu điểm này là do ngoài những tính chất ưu vi t vi khuẩn lactic còn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin , một chất bảo quản thực phẩm Nhận xét: Qua quá trình tìm hiểu và tổng hợp tài liệu, tổng hợp các công trình nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic trong và ngoài nước, chúng... sinh tổng hợp chất kháng khuẩn nhiều nhất Vi c áp dụng những phương pháp này có thể xác định được loại vi khuẩn nào có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Hạn chế của những phương pháp này là không xác định cụ thể hoạt tính của bacteriocin Cần loại bỏ những yếu tố gây ức chế mà không có bản chất là bacteriocin 1.2.2.2.Quan hệ giữa tính đối kháng và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Khi nghiên cứu bacteriocin. .. pH ảnh hưởng đến hoạt tính của bacteriocin Nhiệt độ thích hợp cho loại vi khuẩn có khả năng sinh bacteriocin phát triển cũng là nhiệt độ thích hợp cho vi c sinh tổng hợp bacteriocin Mỗi loại vi khuẩn thích hợp với một khoảng nhiệt độ khác nhau Số lượng bacteriocin trong một môi trường có thể sinh ra khác nhau ở các pha khác nhau của một chu kỳ phát triển Vi c sinh tổng hợp bacteriocin tốt nhất ở pha... động của bacteriocin[ 34] Hầu hết các bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn gram âm có hoạt tính ức chế các loài cùng họ hàng Đối với bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn gram dương có hoạt tính ức chế các loại vi khuẩn gram dương Tuy nhiên một vài loại vi khuẩn gram âm bị ức chế bởi bacteriocin hay chất giống bacteriocin được sinh ra bởi vi khuẩn gram dương Những vi khuẩn gram dương có khả. .. bacteriocin thì rất thích hợp với môi trường rắn Tăng độ nhớt của môi trường bằng cách thêm agar, dextran, glycerol hoặc tinh bột sẽ làm tăng khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn streptococci Nhiều loại môi trường khác nhau có tác dụng khác nhau trong vi c làm tăng hay giảm khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Một số thành phần môi trưòng làm tăng khả năng sinh tổng hợp bacteriocin phải kể đến... HÌNH NGHIÊN CỨU, ỨNG DỤNG BACTERIOCIN TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 1.4.1 Trên thế giới: Hiện nay vi c nghiên cứu, ứng dụng bacteriocin do vi khuẩn lactic sinh tổng hợp nên đang là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quan tâm Và cũng đã có những công trình nghiên cứu và ứng dụng thành công , góp phần vào vi c nâng cao chất lượng cuộc sống của nhân loại Bacteriocin là một chất kháng khuẩn có khả năng. .. một số vấn đề sau: Khả năng sinh tổng hợp bacteriocin ở mỗi loài vi khuẩn lactic khác nhau là khác nhau và rất phong phú và đa dạng Tuy nhiên, ở Vi t Nam các nghiên cứu về lĩnh vực này còn hạn chế Hiện nay các loại hoá chất dùng để bảo quản thực phẩm ít nhiều có ảnh hưởng đến sức khoẻ con người, thế nhưng các công trình nghiên cứu ứng dụng bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn lactic trong bảo