ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HUYỀN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP TỪ BỘT LÚA MẠCH LÊN MEN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2010 - 2014 Thái Nguyên, năm 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HUYỀN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP TỪ BỘT LÚA MẠCH LÊN MEN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành : Cơng nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Lớp : 42 - CNSH Khóa học : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn : ThS Bùi Tuấn Hà Khoa CNSH-CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, năm 2014 LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình thực tập phịng Cơng Nghệ Vi Sinh, khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, em nhận nhiều giúp đỡ từ ban chủ nhiệm khoa CNSH & CNTP, thầy cô hướng dẫn, bạn bè gia đình Trước hết, em xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Tuấn Hà, giảng viên khoa CNSH & CNTP, tạo điều kiện, hướng dẫn giúp đỡ em hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn đến thầy cô khoa CNSH & CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên nhiệt tình giúp đỡ em suốt trình học tập hồn thành khóa luận Cuối em xin chân thành cảm ơn đến quan tâm sâu sắc từ gia đình, bạn bè ln bên cạnh động viên, giúp đỡ em trình thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 30 tháng 05 năm 2013 Sinh viên thực Nguyễn Thị Huyền DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 3.2 Các thiết bị sử dụng thí nghiệm 24 Bảng 4.1 Hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn Lactic 29 Bảng 4.2 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp bacteriocin vi khuẩn BL1 30 Bảng 4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả tổng hợp bacteriocin vi khuẩn BL1 31 Bảng 4.4 Ảnh hưởng pH đến sinh tổng hợp bacteriocin 32 Bảng 4.5 Ảnh hưởng NaCl tới khả sinh tổng hợp bacteriocin vi khuẩn BL1 34 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc Nisin Z 12 Hình 2.2: Cấu trúc Sakacin P 14 Hình 3.1: Phương pháp cấy khảo sát khả kháng vi khuẩn thị 25 Hình 4.1 Biểu đồ ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới khả sinh bacteriocin vi khuẩn BL1 30 Hình 4.2 Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ tới khả sinh tổng hợp bacteriocin vi khuẩn BL1 31 Hình 4.3 Biểu đồ ảnh hưởng pH tới khả sinh bacteriocin vi khuẩn BL1 33 Hình 4.4 Biểu đồ ảnh hưởng nồng độ NaCl tới sinh tổng hợp bacteriocin BL1 34 MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Mục tiêu đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vi khuẩn lactic 2.1.1 Phân loại vi khuẩn lactic 2.1.1.1 Theo Orla-Jensen 2.1.1.2 Phân loại theo hình dạng tế bào 2.1.1.3 Phân loại theo cách thức lên men 2.1.1.4 Phân loại dựa vào nhiệt độ 2.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa vi khuẩn lactic 2.1.1.1 Đặc điểm sinh lý 2.1.1.2 Đặc điểm sinh hóa vi khuẩn lactic 2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển vi khuẩn lactic 2.1.3.1 Ảnh hưởng nồng độ đường 2.1.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 2.1.3.3 Ảnh hưởng pH 2.1.4 Một số ứng dụng vi khuẩn lactic 2.1.4.1 Trong công nghệ thực phẩm 2.1.4.2 Trong công nghiệp 2.1.4.3 Trong nông nghiệp môi trường 2.1.4.4 Trong y học 2.1.4.5 Trong mỹ phẩm 2.1.4.6 Trong chăn nuôi thú y 2.2 Giới thiệu chung bacteriocin 2.2.1 Khái niệm 10 2.2.2 Các chủng vi sinh vật sinh bacteriocin 10 2.2.3 Phân loại 11 2.2.3.1 Lớp I 12 2.2.3.2 Lớp II 13 2.2.3.3 Lớp III 15 2.2.3.4 Lớp IV 15 2.2.4 Cơ chế hoạt động bacteriocin 16 2.2.4.1 Phạm vi hoạt động 16 2.2.4.2 Cơ chế hoạt động 16 2.2.4.3 Tính kháng khuẩn bacteriocin 17 2.2.5 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp bacteriocin 18 2.2.6 Ứng dụng bacteriocin 19 2.2.6.1 Ứng dụng bacteriocin bảo quản thực phẩm 19 2.2.6.2 Ứng dụng bacteriocin y tế chăm sóc sức khỏe 20 2.2.6.3 Ứng dụng bacteriocin nông nghiệp 20 2.3 Tình hình nghiên cứu 21 2.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 21 2.3.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 21 PHẦN ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 23 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 23 3.3 Hóa chất thiết bị sử dụng 23 3.3.1 Hóa chất 23 3.3.2 Thiết bị sử dụng 24 3.3.3 Các chủng giống 24 3.3.4 Các môi trường sử dụng 24 3.4 Nội dung nghiên cứu 25 3.5 Phương pháp nghiên cứu 25 3.5.1 Khảo sát khả kháng khuẩn thị vi khuẩn nghiên cứu 25 3.5.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến tổng hợp bacteriocin vi khuẩn 26 3.5.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến tổng hợp bacteriocin vi khuẩn 26 3.5.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường đến tổng hợp bacteriocin vi khuẩn 26 3.5.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NaCl đến tổng hợp bacteriocin vi khuẩn 26 3.5.6 Phương pháp khuếch tán thạch 27 3.5.7 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 28 3.6 Phương pháp sử lý số liệu 28 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Kết khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn thị chủng lactic từ Boza 29 4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp bacteriocin 30 4.2.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp bacteriocin 30 4.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến sinh tổng hợp bacteriocin vi khuẩn BL1 31 4.2.3 Ảnh hưởng pH nuôi cấy đến sinh tổng hợp bacteriocin 32 4.2.4 Ảnh hưởng nồng độ NaCl tới khả sinh tổng hợp bacteriocin vi khuẩn BL1 33 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 5.1 Kết luận 36 5.2 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong sống ngày vi khuẩn lactic sử dụng nhiều thực phẩm lên men ngày dưa muối, cà muối, lên men rượu, sữa chua, nem chua, mai, bia [3] Nó có vai trò quan trọng đời sống tăng cường miễn dịch, ức chế vi sinh vật có hại, bổ sung vi sinh vật có lợi, tác dụng kháng khuẩn Và gần có nhiều nghiên cứu chứng minh vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp bacteriocin Bacteriocin chất kháng khuẩn có chất protein tổng hợp riboxom từ chuỗi peptit protein vi khuẩn Gram âm vi khuẩn Gram dương [20] Nó có khả tiêu diệt vi khuẩn tạo thành kênh làm thay đổi tính thấm màng tế bào, nhiều loại bacteriocin cịn có khả phân giải DNA, RNA công vào peptidoglycan làm suy yếu thành tế bào vi khuẩn gây hại [29] Vì bacteriocin có nhiều ứng dụng, mỹ phẩm, xử lí mơi trường, chế biến thức ăn chăn ni, y học công nghệ thực phẩm [22] Trong y dược, bacteriocin ứng dụng chế phẩm sinh học để điều trị số bệnh viêm đường tiết niệu, hay nhiễm trùng đường tiêu hoá sử dụng điều trị kháng sinh đồ[30] Trong ngành mỹ phẩm, bacteriocin sử dụng thành phần số loại mỹ phẩm chăm sóc da có tính diệt khuẩn giữ ẩm.Trong cơng nghệ thực phẩm, bacteriocin nghiên cứu ứng dụng rộng rãi chế biến bảo quản số loại thực phẩm phomat, xúc xích, sữa chua, số loại sản phẩm thịt, rau đóng hộp [26] Ở Việt Nam có nhiều nghiên cứu sinh tổng hợp bacteriocin từ nem chua, sữa chua, dưa chua Trong “Nghiên cứu khả sinh tổng hợp bacteriocin vi khuẩn lactic phân lập từ bột lúa mạch lên men” 1.2 Mục đích đề tài Đánh giá khả kháng vi khuẩn thị vi khuẩn lactic phân lập từ đồ uống lên men Boza xác định ảnh hưởng điều kiện lên men đến tổng hợp bacteriocin vi khuẩn 1.3 Mục tiêu đề tài Khảo sát khả kháng vi khuẩn thị (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, Bacillus cereus) vi khuẩn lactic phân lập từ Boza Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện lên men tới trình tổng hợp bacteriocin: thời gian lên men, pH, nhiệt độ, nồng độ NaCl 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học Xác định khả kháng vi khuẩn độc hại ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tới khả hình thành bacteriocin vi khuẩn lactic từ Boza, làm sở để có nghiên cứu chủng loại bacteriocin ứng dụng thực tế Đề tài giúp sinh viên có thêm kinh nghiệm, kiến thức bổ ích tiếp cận với cơng tác nghiên cứu khoa học để phục vụ cho nghiên cứu công tác sau 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Là sở để nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn phân lập sản xuất bacteriocin ứng dụng lĩnh vực bảo quản thực phẩm Khẳng định vai trị có lợi đồ uống lên men Boza người 27 3.5.6 Phương pháp khuếch tán thạch Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion agar) Nguyên tắc: Phương pháp dựa khả đối kháng bacteriocin với vi khuẩn thị vi khuẩn acid lactic mơi trường ni cấy Bacteriocincó khả khuếch tán môi trường agar tác động lên vi khuẩn thị Vi khuẩn acid lactic sinh bacteriocin kháng vi khuẩn thị xuất vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch Quy trình thực hiện: Chuẩn bị mơi trường chứa dịng thị: Dịng thị nuôi cấy đĩa 24 giờ, khuẩn lạc cho vào nước cất vô trùng tiến hành pha lỗng dung dịch Trải 0,1ml dung dịch chứa dịng thị vào bề mặt môi trường đĩa Petri Sau trang để khô, tạo giếng nhỏ có đường kính 8mm với kim loại vô trùng Chuẩn bị dịch bacteriocin thô: Vi khuẩn acid lactic phát triển môi trường LB nuôi cấy 37 C 36h o Dung dịch ly tâm 6.000 vòng/phút 20 phút 4oC Loại bỏ phần cặn chứa xác tế bào vi khuẩn, lấy phần nước dung dịch sau ly tâm ( dung dịch bacteriocin thô) trữ lạnh 4oC Thu dung dịch bacteriocin thô Lấy 0,1ml dung dịch bacteriocin thô nhỏ vào giếng đĩa thạch chứa dòng thị Tiến hành ủ mẫu 4oC 15 phút cho dung dịch giếng khuếch tán Các đĩa ủ 37oC Sau 24 đọc kết Với số liệu thu qua đo vòng kháng khuẩn 28 3.5.7 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật Giống vi sinh vật bảo quản môi trường thạch nghiêng nhiệt độ C Sau 2-3 tuần giống vi sinh vật cấy chuyển lần để đảm bảo sức sống ổn định giống vi sinh vật trình nghiên cứu o 3.6 Phương pháp sử lý số liệu Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để tính tốn vẽ đồ thị ` 29 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn thị chủng lactic từ Boza Kết khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus Salmonella thể bảng 4.1 Bảng 4.1 Hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn Lactic Chủng thị Chủng khảo sát BL1 BL2 BL3 BL4 BL5 E coli B cereus S aureus Salmonella ++ ++ ++ + + +++ + + + + + + - ++ ++ + + - Ghi chú: Không đối kháng (-): 0mm; Đối kháng yếu (+): >0 -