Đang tải... (xem toàn văn)
Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết β1,4glycoside trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và một số chất tương tự khác. Cellulose được chia thành ba dạng sau: dạng một là endoglucanase hoặc 1,4βDglucan4glucanohydrolase hoặc carboxylmethylcellulase (endoβ1,4glucanase, EC 3.2.1.4, viết tắt là EG hoặc CMCase); dạng hai là exoglucanase bao gồm 1,4βDglucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.74) và 1,4βDglucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) ; dạng ba là glucosidase hoặc Dglucoside glucohydrolase, (EC 3.2.1.21). Endoglucanase thủy phân liên kết ở bên trong phân tử cellulose. Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử cellulose. βglucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose thành glucose. Hệ enzyme cellulase được phát hiện ở nhiều sinh vật khác nhau như ở thực vật, động vật, côn trùng, nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn. Trong đó, cellulase ở nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn là phổ biến nhất. Nhiều loài thuộc các chi Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Phanerochaete, Clostridium, Cellulomonas, Thermobifida, Streptomyces... có khả năng tiết cellulase ngoại bào lớn đã được nghiên cứu rộng rãi 18. Cellulase được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt may, công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi, công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ, sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp giấy và bột giấy… và đặc biệt trong công nghệ xử lý rác thải, sản xuất phân bón vi sinh 20 . Tiềm năng ứng dụng của cellulase là rất lớn, đặc biệt là endo β1,4glucanase. Do đó, cần có các phương pháp thích hợp để sản xuất chúng ở qui mô công nghiệp. Công nghệ DNA tái tổ hợp với việc chọn lọc các gen mã hóa endo β1,4glucanase từ các đối tượng có khả năng tổng hợp cellulase mạnh để tạo dòng và biểu hiện trong các vật chủ thích hợp nhằm tạo ra một lượng lớn cellulase tái tổ hợp có hoạt tính cao được coi là phương thức có triển vọng và khả thi nhất. Hiện nay, ở Việt Nam vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào về enzyme này từ chủng Trichoderma asperellum mà chủ yếu tập trung vào các chủng Aspergillus. Bên cạnh đó năng suất tổng hợp enzyme endo β1,4glucanase ở T.asperellum còn thấp (0.09 Uml). Việc tạo dòng gene và tổng hợp enzyme endo β1,4glucanase dị chủng ở nấm Pichia Pastoris sẽ giúp gia tăng sản lượng và do đó góp phần làm giảm giá thành của enzyme này. Tuy nhiên kết quả sơ bộ cho thấy hiệu suất tổng hợp endo β1,4glucanase tái tổ hợp không cao hơn so với hiệu suất sản xuất từ Trichoderma asperellum). Vì vậy một trong những giải pháp để tăng hiệu suất là cải thiện hiệu suất biểu hiện bằng cách tối ưu hóa điều kiện biểu hiện. Xuất phát từ ý nghĩa trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu cải thiện mức độ biểu hiện của endo β1,4glucanase tái tổ hợp trong nấm men Pichia Pastoris ”.
ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC KHOA SINH HỌC -o0o BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN NĂM 2015 Tên đề tài: Nghiên cứu cải thiện mức độ biểu endo β-1,4-glucanase tái tổ hợp nấm men Pichia Pastoris Cán cố vấn khoa học: GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc Chủ nhiệm đề tài: Ngô Thị Thuỳ Dung Thừa Thiên Huế, 12 /2015 [Đề tài khoa học] Page LỜI CẢM ƠN Trên thực tế thành công mà không gắn liền với hỗ trợ, giúp đỡ dù hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp người khác Trong suốt thời gian từ bắt đầu thực đề tài đến nay, nổ lực thân, chúng em nhận giúp đỡ nhiệt tình quý thầy cô giáo Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học Huế Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế tạo điều kiện tốt để chúng em thực đề tài này, chúng em xin chân thành cảm ơn Với lòng biết ơn sâu sắc chúng em xin gửi đến thầy Nguyễn Hoàng Lộc, thầy Nguyễn Đức Huy thầy Nguyễn Ngọc Lương tận tình hướng dẫn, bảo, động viên giúp chúng em hoàn thành tốt đề tài Chúng em xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, người thân bạn bè khích lệ, động viên tinh thần cho chúng em suốt thời gian học tập làm việc Trong trình thực đề tài, bước đầu làm quen với kĩ thuật mắc nhiều sai sót, chúng em cố gắng hoàn thiện để ngày trưởng thành Với vốn kiến thức tiếp thu trình thực đề tài không tảng cho trình nghiên cứu đồ án mà hành trang quý báu để chúng em bước vào đời vững tự tin Sau cùng, chúng em xin kính chúc quý thầy cô Khoa Sinh học GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc thật dồi sức khỏe thành công để tiếp tục thực sứ mệnh cao đẹp truyền đạt kiến thức cho hệ mai sau Chúng em xin chân thành cảm ơn! Huế, ngày tháng năm 2015 Sinh viên [Đề tài khoa học] Page MỤC LỤC Contents DANH MỤC BẢNG BIỂU Số hiệu hình, bảng Hình 1.1 Tên hình, bảng Sự thủy phân loại enzyme phức hệ cellulase Trang 04 Hình 1.2 Trình tự amino acid tương ứng với cấu trúc bậc Cel12A từ số chủng vi sinh vật [55] 06 Hình 1.3 Cấu trúc không gian từ xuống (A) từ bên sang (B) Cel12A từ H Grisea [67] 07 Hình 1.4 Cấu trúc vùng liên kết enzyme - chất Cel12A từ H Grisea 08 Hình 1.5 Cơ chế thủy phân cellulose (A) phức hệ cellulose (B) cellulose [45] 09 Hình 2.1 [Đề tài khoa học] Trình tự gen Glu1-TA Page 28 Hình 2.3 Vector pPICZα A (Invitrogen) 29 Hình 2.4 Đường chuẩn glucose 30 Hình 3.1 Các khuẩn lạc dùng để chọn lọc 33 Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ methanol đến khả sinh tổng hợp endo-β-1,4glucanase P.pastoris tái tổ hợp 34 Hình 3.3 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp endo-β-1,4glucanase P.pastoris tái tổ hợp 35 Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp endo-β-1,4glucanase P.pastoris tái tổ hợp 36 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt/ký hiệu Tên đầy đủ Bp base pair Glu glucanase dNTPs deoxyribonucleic triphosphate EDTA ethylennediaminetetraacetic acid EtBr ethidium bromide LB môi trường Luria Bertani OD optical density (mật độ quang) PCR polymerase chain reaction (khuếch đại DNA) RE restriction endonuclease (enzyme cắt hạn chế) TAE đệm Tris - acetate - EDTA TE đệm Tris - EDTA [Đề tài khoa học] Page YPD môi trường yeast extract - peptone - dextrose YPDS môi trường yeast extract - peptone - dextrose - sorbitol IPTG isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galacto-pyranoside SCP single cell protein MCS multiple cloning site ORF open reading frame PC positive control NC negative control YP yeast extract - peptone YPG môi trường yeast extract - peptone – glycerol [Đề tài khoa học] Page MỞ ĐẦU TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cellulase nhóm enzyme thủy phân có khả cắt mối liên kết β-1,4glycoside phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide số chất tương tự khác Cellulose chia thành ba dạng sau: dạng endoglucanase 1,4-β-Dglucan-4-glucanohydrolase carboxylmethylcellulase (endo-β-1,4-glucanase, EC 3.2.1.4, viết tắt EG CMCase); dạng hai exoglucanase bao gồm 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.74) 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) ; dạng ba glucosidase D-glucoside glucohydrolase, (EC 3.2.1.21) Endoglucanase thủy phân liên kết bên phân tử cellulose Exoglucanase thủy phân liên kết đầu khử đầu không khử cellulose β-glucosidase thủy phân phân tử cellodextrin cellobiose thành glucose Hệ enzyme cellulase phát nhiều sinh vật khác thực vật, động vật, côn trùng, nấm, xạ khuẩn vi khuẩn Trong đó, cellulase nấm, vi khuẩn xạ khuẩn phổ biến Nhiều loài thuộc chi Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Phanerochaete, Clostridium, Cellulomonas, Thermobifida, Streptomyces có khả tiết cellulase ngoại bào lớn nghiên cứu rộng rãi [18] Cellulase ứng dụng rộng rãi công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt may, công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi, công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ, sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp giấy bột giấy… đặc biệt công nghệ xử lý rác thải, sản xuất phân bón vi sinh [20] Tiềm ứng dụng cellulase lớn, đặc biệt endo β-1,4-glucanase Do đó, cần có phương pháp thích hợp để sản xuất chúng qui mô công nghiệp Công nghệ DNA tái tổ hợp với việc chọn lọc gen mã hóa endo β-1,4-glucanase từ đối tượng có khả tổng hợp cellulase mạnh để tạo dòng biểu vật chủ thích hợp nhằm tạo lượng lớn cellulase tái tổ hợp có hoạt tính cao coi phương thức có triển [Đề tài khoa học] Page vọng khả thi Hiện nay, Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu enzyme từ chủng Trichoderma asperellum mà chủ yếu tập trung vào chủng Aspergillus Bên cạnh suất tổng hợp enzyme endo β-1,4-glucanase T.asperellum thấp (0.09 U/ml) Việc tạo dòng gene tổng hợp enzyme endo β-1,4-glucanase dị chủng nấm Pichia Pastoris giúp gia tăng sản lượng góp phần làm giảm giá thành enzyme Tuy nhiên kết sơ cho thấy hiệu suất tổng hợp endo β-1,4-glucanase tái tổ hợp không cao so với hiệu suất sản xuất từ Trichoderma asperellum) Vì giải pháp để tăng hiệu suất cải thiện hiệu suất biểu cách tối ưu hóa điều kiện biểu Xuất phát từ ý nghĩa trên, thực đề tài: “Nghiên cứu cải thiện mức độ biểu endo β-1,4-glucanase tái tổ hợp nấm men Pichia Pastoris ” MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Cải thiện mức độ biểu endo β-1,4-glucanase tái tổ hợp nấm men Pichia Pastoris tối ưu hóa nhiệt độ cảm ứng hàm lượng chất cảm ứng ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu Enzyme endo-β-1,4-glucanase tái tổ hợp từ chủng Pichia Pastoris 3.2 Phạm vi nghiên cứu Nội dung: Nghiên cứu cải thiện mức độ biểu endo β-1,4-glucanase tái tổ hợp nấm men Pichia Pastoris Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế Thời gian: Từ 1/2015-12/2015 [Đề tài khoa học] Page Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 4.1 Ý nghĩa khoa học Cải thiện mức độ biểu ngoại bào endo β-1,4-glucanase tái tổ hợp nấm men Pichia Pastoris 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Enzyme endo β-1,4-glucanase tiết môi trường ngoại bào mạnh có khả phân hủy chất cellulose hiệu cao, ứng dụng xử lý môi trường ngành công nghiệp khác [Đề tài khoa học] Page CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE Cellulase nhóm enzyme thủy phân có khả cắt mối liên kết β-1,4-Oglucoside phân tử cellulose số chất tương tự khác Đó phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác xếp thành nhóm bản: endo-β-1,4glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), exo-β-1,4-glucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân chất theo chế định nhờ có phối hợp hoạt động enzyme mà phân tử chất thủy phân hoàn toàn tạo thành sản phẩm đơn giản Hình 1.1 Sự thủy phân loại enzyme phức hệ cellulase Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase ba dạng cellulase Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết β-1,4-glucoside bên phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide số chất tương tự khác để giải phóng [Đề tài khoa học] Page cellulosedextrin, cellobiose glucose Enzyme thể hoạt tính mạnh mẽ cellulose vô định hình [3] Endo-β-1,4-glucanase tạo từ loài khác có thành phần cấu tạo cấu trúc khác Endo-β-1,4-glucanase từ nấm A oryzae có khối lượng phân tử khoảng 34 kDa 62 kDa [77], chủng A oryzae KBN616 31 kDa 53 kDa [41], chủng Trametes hirsuta khoảng 40,6 kDa [57], chủng A terreus M11 khoảng 25 kDa [30] 1.1 Cấu trúc bậc Endoglucanase từ nguồn gốc khác có thành phần cấu tạo cấu trúc khác Sự khác thể trước hết đa dạng khối lượngphân tử, thành phần trật tự xếp amino acid chuỗi polypeptide Chủng A oryzae KBN616 có khả sinh tổng hợp hai loại endoglucanase Cel A Cel B Phân tử protein Cel A gồm 239 amino acid, trọng lượng phân tử 31 kDa, xếp vào họ cellulase H Trong đó, Cel B xếp vào họ cellulase C với chiều dài 416 amino acid khối lượngphân tử 53 kDa [43] Phân tử endoglucanase từ A aculeatus bao gồm 410 amino acid với khối lượngphân tử khoảng 43,7 kDa [59] Các endoglucanase từ chủng A niger Z10 có khối lượngphân tử 83 kDa 50 kDa [25], từ A terreus 25 kDa [29], từ Trichoderma reesei 48 kDa 55 kDa [40], [47], từ Bacillus sp D04 có khối lượng 35 kDa [56] Sandgren cs (2003) có nghiên cứu chi tiết cấu trúc Cel12A thuộc họ 12 (GH 12) endoglucanase từ nấm chịu nhiệt Humicola grisea Cel12A H grisea chuỗi polypeptide gồm 224 amino acid (Hình 1.2) [55] [Đề tài khoa học] Page 10 CHƯƠNG KẾT QUẢ SÀNG LỌC CÁC CHỦNG PICHIA PASTORIS TÁI TỔ HỢP CÓ KHẢ NĂNG SINH ENDO-β-1,4-GLUCASE Các chủng Pichia pastoris nuôi môi trường YPD 30oC, lắc 185 vòng/phút, định lượng enzyme endo-β-1,4- glucanase tiết môi trường ngoại bào thực phương pháp so màu bước sóng 540 nm Kết khảo sát 40 khuẩn lạc chứa gen Glu 1-TA cho thấy, tất khuẩn lạc làm đổi màu dung dịch DNS chứng tỏ tất khuẩn lạc khảo sát có tiết endo-β-1,4- glucanase môi trường ngoại bào mức độ khác Tuy nhiên, khuẩn lạc số có mức độ tiết endo-β-1,4- glucanase môi trường ngoại bào mạnh nhất, có hoạt độ chung 1.55 u/ml [Đề tài khoa học] Page 37 Hình 3.1 Các khuẩn lạc dùng để chọn lọc CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU SINH ENDO-β-1,4-GLUCANASE CỦA PICHIA PASTORIS 3.1 Ảnh hưởng hàm lượng chất cảm ứng methanol Các nồng độ methnol khác ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp enzyme khác Qua khảo sát nồng độ methnol tối ưu cho P pastoris sinh endo-β-1,4glucanase 2.5 ml/l với hoạt độ chung 1.54 u/ml Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ methanol đến khả sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase P.pastoris tái tổ hợp [Đề tài khoa học] Page 38 3.2 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy Trong bốn môi trường nuôi cấy khảo sát môi trường YPL môi trường tối ưu cho P pastoris tiết endo-β-1,4-glucanase với hoạt độ chung đo 1.43 u/ml Hình 3.3 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase P.pastoris tái tổ hợp 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy Vận tốc phản ứng enzyme xúc tác tăng lên tăng nhiệt độ giới hạn định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc enzyme Qua khảo sát hoạt tính enzyme đạt cực đại nhiệt độ 30oC với hoạt độ chung 1.38u/ml, khoảng nhiệt độ khảo sát 20 oC, 25 oC, 30 oC 35 oC Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase P.pastoris tái tổ hợp CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Điều kiện tiết endo-β-1,4-glucanase tối ưu Pichia Pastoris 30oC, nồng độ methanol [Đề tài khoa học] Page 39 cảm ứng 2.5 ml/l môi trường nuôi cấy YPL KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu cải thiện khả sinh tổng hợp phân tích mức độ biểu enzyne endo-β-1,4-glucanase nấm men Pichia pastoris Nghiên cứu sản xuất enzyme endo-β-1,4-glucanase quy mô công nghiệp Thử nghiệm ứng dụng Glu1-TA chế biến thức ăn chăn nuôi xử lý rác thải cellulose TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [Đề tài khoa học] Page 40 [1] Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy, Tăng Thị Chính, Phan Tuyết Minh, Lê Thanh Xuân, Trần Quang Huy, Đào Ngọc Quang, Phạm Thị cúc (1999), "Sử dụng vi sinh vật có hoạt tính phân giải cellulose cao để nâng cao chất lượng phân hủy rác thải sinh hoạt nông nghiệp", Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 546-551 [2] Chu Thị Thanh Bình, Nguyễn Lân Dũng Lương Thùy Dương (2002), "Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu chủng nấm men có khả phân giải cellulose nhằm ứng dụng xử lý bã thải hoa làm thức ăn chăn nuôi", TC Di truyền học ứng dụng, 2, 34-36 [3] Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2006) Danh mục thức ăn chăn nuôi, nguyên liệu thức ăn chăn nuôi nhập vào Việt Nam Số 01/2006/QĐBNN [4] Phạm Thị Trân Châu Phan Tuấn Nghĩa (2006), Công nghệ Sinh học Tập 3: Enzyme ứng dụng, Nxb Giáo dục [5] Cao Cường Nguyễn Đức Lượng (2003), "Khảo sát trình cảm ứng enzyme chitinase cellulase Trichoderma harzianum, ảnh hưởng hai enzyme lên nấm bệnh Sclerotium rolfsii", Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 321-324 [6] Trịnh Đình Khá (2006), "Tuyển chọn, nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase đánh giá tính chất lý hóa cellulase", Luận văn Thạc sỹ Khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội [7] Trịnh Đình Khá Nguyễn Sỹ Lê Thanh (2011), "Tinh sơ đánh giá tính chất hoá lý cellulase từ chủng Penicillium sp DTQ-HK1", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5, 47-54 [8] Hoàng Quốc Khánh, Ngô Đức Duy Nguyễn Duy Long (2003), "Khả sinh tổng hợp đặc điểm cellulase Aspergillus niger RNNL-363", Báo cáo khoa [Đề tài khoa học] Page 41 học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 304-307 [9] Trần Thị Lệ, Trần Thị Thu Hà, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Xuân Kỳ (2012), "Tuyển chọn chủng nấm Trichoderma spp phân giải cellulose mạnh để sản xuất phân hữu vi sinh nghiên cứu ảnh hưởng chúng giống đậu xanh 208 vụ xuân 2011 hợp tác xã Hương Long, thành phố Huế", Tạp chí Khoa học Đại học Huế, 71 [11] Trần Non Nước, Võ Văn Song Toàn, Dương Thị Hương Giang Trần Nhân Dũng (2012), "Tuyển chọn tối ưu hóa vi khuẩn kỵ khí sinh tổng hợp enzyme cellulase chất bột giấy", Tạp chí Khoa học, Trường ĐH Cần Thơ, 22b, 4353 [12] Trần Thạnh Phong, Hoàng Quốc Khánh, Võ Thị Hạnh, Lê Bích Phượng, Nguyễn Duy Long, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân (2007), "Thu nhận Enzyme Cellulase Trichoderma reesei môi trường bán rắn", Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, 10, 17-24 [14] Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy Nguyễn Xuân Sâm (2004), Công nghệ enzyme, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [13] Trần Thị Thanh Thuần, Nguyễn Đức Lượng (2010), "Nghiên cứu enzyme cellulase pectinase từ chủng Trichoderma viride Aspergillus niger nhằm xử lý nhanh vỏ cà phê", Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, 12, 50-56 [15] Hồ Sỹ Tráng (2006), Cơ sở hóa gỗ cellolose, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội [16] Nguyễn Văn Tuân (2009), "Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase đánh giá tính chất lý hóa endo-β-1,4glucanase", Luận văn thạc sĩ khoa học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên [Đề tài khoa học] Page 42 TIẾNG ANH [16] Ahmed S., Bashir A., Saleem H., Saadia M and Jami A (2009), "Production and purification of cellulose degrading enzymes from a filamentous fungus Trichoderma harzianum", Pak J Bot., 41, 1411-1419 [17] Bhat L T (2000), "Cellulases and related enzymes in biotechnology", Biotechnol Adv., 18, 355-383 [18] Bhat M K and Bhat S (1997), "Cellulose degrading enzymes and their potential industrial applications", Biotechnol Adv., 15, 583- 620 [19] Campillo E D (1999), "Multiple endo-1,4-β-D-glucanase (cellulase) genes in Arabidopsis", Curr Top Dev Biol., 46, 39-61 [20] Cereghino J L and Cregg J M (2000), "Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris", Fems Microbiol Rev., 24, 45- 66 [21] Chinedu S, Nwinyi C, Okochi V (2008) Properties of endoglucanase of Penicillium chrysogemum PCL501, Austr Basic Appl Sci, 2(3): 738 746 [22] Coral G., Arikan B., Unaldi M and H G (2002), "Some properties of crude carboxymethyl cellulase of Aspergillus niger Z10 wild-type strain", Turk J Biol, 26, 209-213 [23] Das M., Prasad J and Ahmad S (1997), "Endoglucanase production by paperdegrading mycoflora", Appl Microbiol., 25, 313-315 [Đề tài khoa học] Page 43 [24] De la Cruz J., Pintor-Toro J A., Benítez T., Llobell A and Romero L C (1995), "A novel endo-beta-1,3-glucanase, BGN13.1, involved in the mycoparasitism of Trichoderma harzianum", J Bacteriol, 177, 6937-6945 [25] Ding S J., Gea W and Buswell J A (2002), "Secretion, purification and characterisation of a recombinant Volvariella volvacea endoglucanase expressed in the yeast Pichia pastoris", Enzyme and Microbial Technology, 31, 621-626 [26] Dürre P (1998), "New insights and novel developments in lostridial acetone/butanol/isopropanol fermentation", Appl Microbiol Biotechnol., 49, 639648 [27] Fukuda H, Mikami S, Kizaki Y, Wakabayashi S (2002) Properties of cellulose- degrading enzymes from Aspergillus oryzae and their contribution to material utilization and alcohol yield in sake mash fermention, Biosci and Bioeng, 95(5): 479-484 [28] Fuglsang C C., Berka R M., Wahleithner J A., Kauppinen S., Shuster J R., Rasmussen G., et al (2000), "Biochemical analysis of recombinant fungal mutanases a new family of α-1,3-glucanases with novel carbohydrate-binding domains", J Biol Chem., 275, 2009-2018 [29] Ganiger M C., Bhat S., Chettri P and Kuruvinashetti M S (2008), "Cloning and expression of endoglucanase genes from Trichoderma species in Saccharomyces cerevisiae", J Appl Sci Res., 4, 1546-1556 [30] Gao J., Weng H., Xi Y., Zhu D and Han S (2008), "Purification and characterization of a novel endo-β-1,4-glucanase from thermoacidophilic Aspergillus terreus", Biotechnol Lett., 30, 323-327 [Đề tài khoa học] Page 44 [31] Gilkes N R., Henrissat B., Kilburn D G., Miller R C and Warren R A J (1991), "Domains in microbial 1,4-glycanases: sequence onservation, function, and enzyme families", Microbiol Rev., 5, 303-315 [32] [33] Hara Y, Hinoki Y, Shimoi H, Ito K (2003) Cloning and sequence analysis of endoglucanase genes from an industrial fungus Aspergillus kawachi, Biosci Biotechnol Biochem, 67: 2010-2013 Henrissat B., Claeyssens M., Tomme P., Lemesle L and Mornon J P (1989), "Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis", Gene, 81, 83-95 [34] Hsu C K., Liao J W., Chung Y C., Hsieh C P and Chan Y C (2004), "Xylooligosaccharides and fructooligosaccharides affect the intestinal micro biota and precancerous colonic lesion development in rats", J Nutr., 134, 1523-1528 [35] Huang X M., Yang Q., Liu Z H., Fan J X., Chen X L., Song J Z., et al (2010), "Cloning and heterologous expression of a novel endoglucanase gene egVIII from Trichoderma viride in Saccharomyces cerevisiae", Appl Biochem Biotechnol., 162, 103-115 [36] Hung N B., Quang H T., Ha T T T., Thao T N., Chau T T D and Loc N H (2010), "Isolation and characterization of 42 kDa chitinase from Trichoderma asperellum", Vietnamese J Biotechnol., 8, 1651-1657 [37] Invitrogen (2005), "A manual of methods for expression of recombinant proteins in P passtoris", Pichia Expression Kit, Catalog N0 K1740-s1701: 1741-1756 [38] Jin X., Meng N and Xia L M (2011), "Expression of an endo-β-1,4-glucanase gene from Orpinomyces PC-2 in Pichia pastoris", Int J Mol Sci., 12, 3366-3380 [39] Karlsson J., Saloheimo M., Siika M., Tenkanen M., Penttila M and Tjerneld F (2001), "Homologous expression and characterization of Cel61A (EGIV) of Trichoderma reesei", Eur J Biochem., 268, 6498-6507 [Đề tài khoa học] Page 45 [40] Kirk O., Borchert T V and Fuglsang C C (2002), "Industrial enzyme aplications", Curr Opin Biotech., 13, 345-351 [41] Kitamoto N., Go M., Shibayama T., Kimura T., Kito Y., Ohmiya K., et al (1996), "Molecular cloning, purification and characterization of two endo-β-1,4-glucanase from Aspergillus oryzae KBN616", Appl Microbiol Biotechnol., 46, 538-544 [42] Kuhad R C., Gupta R and Singh A (2011), "Microbial cellulases and their industrial applications", Enzyme Res Doi:10.4061/2011/280696, [43] Kulminskaya A A., Thomsen K K., Shabalin K A., Sidorenko I A., Eneyskaya E V., Savel’ev A N., et al (2001), "Isolation, enzymatic properties, and mode of action of an exo-1,3-β-glucanase from Trichoderma viride", Eur J Biochem, 268, 6123-6131 [44] Kwon J P., Ekino K., Goto M and Furukawa K (1999), "Heterologous expression and characterization of endoglucanse I (EGI) from Trichoderma viride HK-75", Biosci Biotech Biochem., 63, 1744-1720 [45] Lee R L., Weimer P J., Zyl W H and Pretorius I S (2002), "Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology", Microbiol Mol Biol Rev., 66, 506577 [46] Li C H., Wang H R and Yan T R (2012), "Cloning, purification, and characterization of a heat and alkaline- stable endoglucanase B from Aspergillus niger BCRC31494", Molecules, 17, 9774- 9789 [47] Li J., Tang C., Shi H and Wu M (2011), "Cloning and optimized expression of a neutral endoglucanase gene (ncel5A) from Volvariella volvacea WX32 in Pichia pastoris", J Biosci Bioengin., 111, 537-540 [Đề tài khoa học] Page 46 [48] Li X., Wang D., Zhou F., Yang H., Bhaskar R., Hu J., et al (2010), "Cloning and expression of a cellulose gene in the silkworm, Bombyx mori by improved Bac-toBac/BmNPV baculovirus expression system", Mol Biol Rep., 37, 3721-3728 [49] Li X., Wang M., Zhang P., Hu J., Sun C., Liu X., et al (2011), "Heterologous expression characteristics of Trichoderma viride endoglucanase V in the silkworm, Bombyx mori L", Appl Biochem Biotechnol., 165, 728-736 [50] Li X., Zhang P., Liang S., Zhou F., Wang M., Bhaskar R., et al (2012), "Molecular cloning and characterization of from Trichoderma viride and its expession in Bombyx mori", Appl Biochem Biotechnol., 166, 309-320 [51] Li X., Zhang P., Wang M., Zhou F., Malik F A., Yang H., et al (2011), "Expression of Trichoderma viride endoglucanase III in the larvae of silkworm, Bombyx mori L and characteristic analysis of the recombinant protein", Mol Biol Rep., 38, 3897-3902[52] Lindenmuth B E and McDonald K A (2011), "Production and characterization of Acidothermus cellulolyticus endoglucanase in Pichia pastoris", Protein Expression and Purification, 77, 153-158 [53] Loc N H., Ngoc L M T., Quang H T and Huy N D (2015), "Cloning and expression of two genes coding endo-β-1,4-glucanases from Trichoderma asperellum PQ34 in Pichia pastoris", Chemical Papers, DOI: 10.1515/chempap, [54] Loc N H., Quang H T., Lam B T H and Trang D T T (2011), "The effects of culture conditions on neutral protease (NPRC10) in a recombinant Escherichia coli BL21 (DE3)", Ann Biol Res., 2, 474-485 [55] Luo H., Yang J., Yang P., Li J., Huang H., Shi P., et al (2010), "Gene cloning and expression of a new acidic family endo-β-1,3-1,4-glucanase from the acidophilic fungus Bispora sp MEY-1", Appl Microbiol Biotechnol., 85, 1015-1023 [Đề tài khoa học] Page 47 [56] Macarrón R., Acebal C., Castiilón M P., Domínguez J M and Manta I D L (1993), "Mode of action of endoglucanase III from Trichoderma reesei", Biochem J., 289, 867-873 [57] Nozaki K, Seki T, matsui K, Mizuno M, Kanda T, Amano Y (2007 Structure and characteristics of an endo-beta-1,4-glucanase, isolated from Trametes hirsuta, with high degradation to crystalline cellulose, Biosci Biotechnol Biochem, 71(10): 2375-2382 [58] Nakakuki T (2003), "Development of functional oligosaccharides in Japan", Trends Glycosci Glycotechnol., 15, 57-64 [59] Okada H., Tada K., Sekiya T., Yokoyama K., Takahashi A., Tohda H., et al (1998), "Molecular characterization and heterologous expression of the gene encoding a low-molecular-mass endoglucanase from Trichoderma reesei QM9414", Appl Environ Microbiol., 64, 555-563 [60] Omogbenigun O F., Nyachoti C M and Slominski B A (2004), "Dietary supplementation with multienzyme preparations improves nutrient utilization and growth performance in weaned pigs", J Anim Sci., 82, 1053-1061 [61] Penttilä M E., Andre L., Saloheimo M., Lehtovaara P and Knowles J K C (1987), "Expression of two Trichoderma reesei endoglucanases in the yeast Saccharomyces cerevisiae", Yeast, 3, 175-185 [62] Prielhofer R., Maurer M., Klein J., Wenger J., Kiziak C., Gasser B., et al (2013), "Induction without methanol: novel regulated promoters enable high-level expression in Pichia pastoris", Microbial Cell Factories, 12, [63] Qin Y., Wei X., Liu X., Wang T and Qu Y (2008), "Purification and characterization of recombinant endoglucanase of Trichoderma reesei expressed in Saccharomyces cerevisiae with higher glycosylation and stability", Protein Expr Purif, 58, 162-167 [Đề tài khoa học] Page 48 [64] Rech R and Ayub M A Z (2006), "Fed-batch bioreactor process with recombinant Saccharomyces cerevisiae growing on cheese whey", Brazilian Journal of Chemical Engineering, 23, 435-442 [65] Rubini M R., Dillon A J P., Kyaw C M., Faria F P., Pocas-Fonseca M J and Silva-Pereira I (2010), "Cloning, characterization and heterologous expression of the first Penicillium echinulatum cellulase gene", J Appl Microbiol., 108, 11871198 [66] Saloheimo M., Setala T N., Tenkanen M and Penttila M (1997), "cDNA cloning of a Trichoderma reesei cellulase and demonstration of endoglucanase activity expression in yeast", Eur J Biochem., 249, 584-591 [67] Sang J, Young J, Hyen S (1995) Characterization of a bifunctional cellulase and structural gene The cel gene of Bacillus sp D04 has exoendoglucanase activity, J Biol chem, 270: 26012-26019 [68] Sambrook J R D (2001), "Cold spring harbor laboratory press, Cold spring habor", Molecular clonning A laboratory manual, 3rd ed, 133-135 [69] Shaikh Z J., "Cloning and characterization of endoglucanase genes from Trichoderma spp," Master's thesis, Department of biotechnology college of agriculture, dharwad university of agricultural sciences, 2005 [70] Tan H., Zhang G., Zheng G., Cui F and Qian S (2008), "Cloning and expression of endo-β-glucanase II gene in Humicola insolens H31-3", Front Biol China, 3, 287-292 [71] Watanabe H and Tokuda G (2001), "Animal cellulases", Cell Mol Life Sci., 58, 1167-1178 [72] Wonganu B., Pootanakit K., Boonyapakron K., Champreda V., Tanapongpipat S and Eurwilaichitr L (2008), "Cloning, expression and characterization of a [Đề tài khoa học] Page 49 thermotolerant endoglucanase from Syncephalastrum racemosum (BCC18080) in Pichia pastoris", Protein Expression and Purification, 58, 78-86 [73] Wu S and Letchworth G J (2004), "High efficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreated with lithium acetate and dithiothreitol", Biotechniques, 36, 152-154 [74] Wu Z., Chen H., Zeng M and Wu Q (2009), "Over-expression of endoglucanase gene in Pichia pastoris", J Agri Biotechnol., 17, 529-535 [75] Xiao J C., Qiu L X., Wei J Z., Feng Y S., Wan X X., Jing L., et al (2005), "Expression of nonfusion extracellular porcine zona pellucida protein 3β in E coli", J Reproduct Contracept., 16, 11-16 [76] Xu B., Janson J C and Sellos D (2001), "Cloning and sequencing of a molluscan endo-β-1,4-glucanase gene from the blue mussel, Mytilus edulis", Eur J Biochem., 268, 3718-3727 [77] Yamane Y, Furita J, Izuwa S, Fukuchi K, Shimizu R, Hiyoshi A (2002) Properties of cellulose-degrading enzymes from Aspergillus oryzae and their contribution to material utilization and alcohol yield in sake mash fermention, Biosci Bioeng, 95(5): 479-484.(4) [Đề tài khoa học] Page 50 [Đề tài khoa học] Page 51 [...]... endo β-1,4-glucanase trong Pichia pastoris Nấm men P pastoris có những ưu điểm về kỹ thuật phân tử và di truyền giống nấm men S cerevisiae nhưng mức độ biểu hiện protein ngoại lai của nó gấp 10-100 lần Do đó, P pastoris đã trở thành hệ thống biểu hiện đặc trưng cho việc sản xuất những protein tái tổ hợp ở nồng độ cao P pastoris cũng được các nhà nghiên cứu lựa chọn và biểu hiện thành công các gen β-1,4-glucanase... protein tái tổ hợp Endoglucanase II tái tổ hợp được tinh sạch bằng điện di điểm đẳng điện Hoạt độ riêng của endoglucanase II tái tổ hợp được xác định là 220,57 u/mg protein Endoglucanase II tái tổ hợp tinh sạch có khối lượng phân tử 52,8 kDa Khối lượng phân tử gia tăng do quá [Đề tài khoa học] Page 28 trình glycosyl hóa cao, và enzyme tái tổ hợp được tiết ra bởi P pastoris không thay đổi nhiệt độ và... các chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả năng chịu được nhiệt độ 80oC, nhiệt độ lên men tối ưu từ 45 oC đến 55oC, pH môi trường ban đầu thích hợp nhất là 8 Nguồn carbon tốt nhất cho sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn nghiên cứu là glucose và CMC; nguồn nitrogen là peptone và cao nấm men Các tác giả cũng đã nghiên cứu động thái của quá trình sinh tổng hợp cellulase và kết quả... 2011, gen endo- β-1,4-glucanase (celE) từ Opinomyces PC-2 đã được Jin và cs tái tổ hợp trong plasmid pPIC9K và biểu hiện trong P pastoris GS115 dưới sự điều hòa của promoter AOX1 Kết quả điện di SDS-PAGE thu được băng protein có khối lượng phân tử khoảng 52 kDa Endoglucanase tái tổ hợp được tạo ra bởi P pastoris trên môi trường chứa CMC hoạt động ở pH 6 và nhiệt độ 45oC Sự cảm ứng bằng methanol 1% trong. .. sử dụng biểu hiện thành công nhiều loại protein ngoại lai Tuy nhiên, cần chú ý khi cảm ứng biểu hiện bằng methanol phải đảm bảo các điều kiện an toàn vì methanol là một độc tố và có thể gây cháy nổ 6.2 Giới thiệu về vector pPICZα A Hầu hết các vector biểu hiện trong P pastoris đều là plasmid được thiết kế phù hợp để có thể tích hợp vào hệ gen của P pastoris, chỉ một số ít hệ biểu hiện trong P pastoris. .. Sau khi xử lý và tinh sạch thu được enzyme tái tổ hợp EGI dạng hoạt động với nồng độ 18,3 mg/ml trong môi trường nuôi cấy Enzyme tái tổ hợp này (rEGI) có hoạt tính phân giải CMC đạt 67,8% so với dạng tự nhiên (nEGI) [44] Năm 2001, Karlsson và cs cũng đã nghiên cứu sự biểu hiện gen và tinh sạch enzyme Cel61A (EGIV) của T reesei Enzyme được biểu hiện ở nồng độ cao với đuôi histidine ở đầu C-terminus... cảm ứng bằng methanol 1% trong 96 giờ thu được endo- β-1,4-glucanase có hoạt độ đạt 72,5 u/ml [38] Samanta và cs (2012) đã tiến hành phân lập gen endoglucanase II từ T reesei và biểu hiện trong P pastoris dưới sự điều hòa của promoter AOX1 nhằm tránh có mặt của những hợp phần cellulase khác Dạng đột biến Mut + có mức biểu hiện cao được chọn và sự biểu hiện trong môi trường BMMH (100 mM potassium phosphate... gen này trong một đối tượng khác nhằm khai thác tối đa hiệu suất của glucanase đã được quan tâm nghiên cứu Các vật chủ thường được chọn để biểu hiện gen này là các vi sinh vật có khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh như E coli, nấm men Hai gen mã hóa endo- β-1,4-glucanase, egl1 và egl3, từ nấm sợi T reesei được Penttila và cs (1987) biểu hiện trong nấm men S cerevisiae dưới sự điều hòa của promoter... Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy Chủng P pastoris chứa vector tái tổ hợp mang trình trình tự gene endo- β-1,4 glucanase được nuôi cấy trong môi trường YPD ở các nhiệt độ khác nhau: 20 oC, 25oC, 30 o C, 35 oC Dịch enzyme được thu ở 96 giờ để xác định hoạt tính .2.3 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy Chủng P pastoris chứa vector tái tổ hợp mang trình trình tự gene endo- β-1,4glucanase được khảo sát trong các... đã tạo dòng và biểu hiện gen endoglucanase B (EGLB) từ A niger BCR31494 trong P pastoris Theo phân tích trình tự, khung đọc mở (ORF) của gen gồm 1.217 bp với 5 intron và enzyme EGLB được xác định là cellulase thuộc glycosyl hydrolase họ 5 Việc tổng hợp enzyme tái tổ hợp được cảm ứng bằng 0,5% methanol và hoạt tính tối ưu của nó thể hiện ở 70 oC (pH 4) EGLB ổn định trong 3 giờ ở nhiệt độ dưới 60oC duy ... môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế Thời gian: Từ 1/2015-12/2015 [Đề tài khoa học] Page Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 4.1 Ý nghĩa khoa học Cải thiện mức... giúp đỡ nhiệt tình quý thầy cô giáo Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học Huế Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế tạo điều kiện tốt để chúng em thực đề tài này, chúng... hợp cellulase đánh giá tính chất lý hóa cellulase", Luận văn Thạc sỹ Khoa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội [7] Trịnh Đình Khá Nguyễn Sỹ Lê Thanh (2011), "Tinh sơ