2 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN ĐỨC HÀO THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merrill] LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2013 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN ĐỨC HÀO THIẾT KẾ VECTOR MANG CẤU TRÚC GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merrill] Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2013 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa có công bố công trình khác Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Nguyễn Đức Hào ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Lò Thanh Sơn, Trường Đại học Tây Bắc đóng góp ý kiến quý báu tận tình bảo, giúp đỡ trình tiến hành thí nghiệm để hoàn thành đề tài luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô, cán Bộ môn Di truyền&Sinh học đại, khoa Sinh-KTNN, trường Đại học Sư phạm –Đại học Thái Nguyên, cảm ơn cán phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập, thực thí nghiệm đề tài Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu trường THPT Phù Lưu, Tuyên Quang tạo điều kiện thuận lợi cho học tập hoàn thành khoá học Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bè bạn động viên khuyến khích giúp đỡ trình làm luận văn Tác giả luận văn Nguyễn Đức Hào iii MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG .v DANH MỤC HÌNH .vi CÁC KÝ HIỆU DÙNG TRONG LUẬN VĂN .vi MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Chọn giống đậu tương theo định hướng nâng cao khả chịu hạn 1.1.1 Chọn giống đậu tương chịu hạn đột biến thực nghiệm .4 1.1.2 Chọn dòng đậu tương chịu hạn công nghệ tế bào thực vật .5 1.1.3 Chọn dòng đậu tương chịu hạn kỹ thuật chuyển gen .6 1.2 Gen liên quan đến tính chịu hạn gen GmEXP1 đậu tương 1.2.1 Các gen liên quan đến tính chịu hạn đậu tương 1.2.2 Gen GmEXP1 protein EXP1 đậu tương 10 1.2.3 Vector chuyển gen thực vật 11 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Vật liệu thiết bị 14 2.1.1 Vật liệu 14 2.1.2 Hoá chất thiết bị 15 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu .16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Phân lập gen 16 2.2.2 Phương pháp chuyển gen vào thuốc .22 2.3 Phương pháp thiết kế vector .24 3.1 Phân lập gen GmEXP1 kỹ thuật RT- PCR 26 3.1.1 Nhân đoạn mã hoá gen GmEXP1 26 3.1.2 Tách dòng đoạn mã hoá (cDNA) gen GmEXP1 .26 3.1.3 Kiểm tra plasmid trước đọc trình tự 31 3.2.2 Kết cắt mở vòng plasmid pRTRA7/3 .37 3.2.3 Tạo plasmid pRTRA7/3 tái tổ hợp mang gen GmEXP1 38 3.2.4 Kết cắt plasmid pRTRA7/3 tái tổ hợp HindIII 39 3.2.5 Kết cắt plasmid pCB301 HindIII .40 3.2.6 Tạo vector chuyển gen pCB301 mang cấu trúc GmEXP1 41 3.2.7 Kết tạo dòng vi khuẩn A tumefaciens mang cấu trúc gen GmEXP1 42 iv 3.3 Kiểm tra hoạt động vector mang cấu trúc GmEXP1 thuốc mô hình 44 3.3.1 Kết chuyển cấu trúc GmEXP1 vào thuốc .44 3.3.2 Kết kiểm tra thuốc mang gen GmEXP1 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO .50 Tài liệu tiếng Việt 50 6.Chu Hoàng Mậu (2001), Nghiên sử dung phương pháp đột biến thực nghiêm để tạo dòng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông bắc Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội 50 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Sản xuất đậu tương Việt Nam từ 2007 đến 2013 Bảng 2.1 Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA 17 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 18 Bảng 2.3 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 18 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng colony – PCR 19 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng colony – PCR 19 Bảng 2.6 Thành phần gắn gen GmEXP1 vào vector tách dòng pBT 20 Bảng 2.7 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid .20 Bảng 2.8 Thành phần dung dịch đệm tách chiết DNA 23 Bảng 3.1 Kết tạo thuốc chuyển gen GmEXP1 45 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Ảnh hạt giống đậu tương SL1 14 Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc vector sử dụng nghiên cứu .15 Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn mã hoá gen GmEXP1; Giếng 1-4: mẫu cDNA; M: thang chuẩn 1kb 27 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm gel đoạn mã hoá gen GmEXP1; M: thang chuẩn 1kb .27 Hình 3.3 Ảnh khuẩn lạc 29 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR; Giếng 1-9: khuẩn lạc; M: thang chuẩn 1kb .30 31 31 Hình 3.5 Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp; Giếng 1-9: dòng plasmid tái tổ hợp 31 Hình 3.6 Hình ảnh điện di kiểm tra plasmid trước đọc trình tự; Giếng 1-3: dòng plasmid; M: thang chuẩn 1kb 32 32 Hình 3.7 Sơ đồ so sánh trình tự đoạn mã hoá gen GmEXP1 giống đậu tương SL1 AF516879 .34 Hình 3.8 Sơ đồ so sánh trình tự amino acid protein EXP1 giống SL1 AF516879 35 Hình 3.9 Ảnh điện di sản phẩm cắt pBT/EXP1; M: thang chuẩn kb 36 Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pRTRA7/3 NotI + NcoI; M: thang chuẩn 1kb .37 Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pRTRA7/3 HindIII; M: thang chuẩn 1kb 39 Hình 3.12 Ảnh cắt pCB301 HindIII; M: thang chuẩn 1kb 40 Hình 3.13 Hình điện di sản phẩm colony- PCR; Giếng 1-10: dòng khuẩn lạc; M: thang chuẩn kb .42 Hình 3.14 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR; Giếng 1-6: dòng khuẩn lạc; M: thang chuẩn kb 44 Hình 3.15 Hình ảnh minh họa giai đoạn chuyển gen vào thuốc 46 Hình 3.16 Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ thuốc lá; Giếng 1-22: mẫu thuốc 47 Hình 3.17 Hình điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmEXP1 từ thuốc lá; Giếng 1-22: mẫu thuốc lá; M: thang chuẩn kb 48 CÁC KÝ HIỆU DÙNG TRONG LUẬN VĂN BAP 6- benzyl amino purine bp Base pair DDT Dichloro-diphenyl-trichloroethane DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid đtg Đồng tác giả E coli Escherichia coli GM Germination medium - Môi trường nảy mầm hạt GMO Genetically modified organism - Sinh vật biến đổi gen GMP Genetically modified plant - Thực vật biến đổi gen HSG Heat Shock Granules HSP Heat Shock protein - Protein sốc nhiệt IBA Indole - butyric acid IPTG Isopopyl β-D-1 thiogalactopyranoside kb Kilo base LB Luria Bertani MS Môi trường nuôi cấy mô theo Murashige Skoog MSI Dung dịch I (muối đa lượng) dùng để pha môi trường MS MSII Dung dịch II (muối đa lượng) dùng để pha môi trường MS MSIII Dung dịch III (sắt) dùng để pha môi trường MS MSIV Dung dịch IV (muối vi lượng) dùng để pha môi trường MS MSV Dung dịch V (vitamin) dùng để pha môi trường MS NST Nhiễm sắc thể Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn OD Optical density Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn mRNA Sản phẩm cắt gel bảo quản nhiệt độ - 20 0C để dùng cho nghiên cứu 3.2.5 Kết cắt plasmid pCB301 HindIII Thành phần phản ứng cắt plasmid pCB301 gồm: H 2O: µl; Red Buffer: µl; HindIII: µl; plasmid pCB301 : 23 µl Ủ 370C 16 Với enzyme HindIII plasmid pCB301 bị cắt điểm 5295 5355 đoạn bị cắt bỏ có kích thước 60 bp băng plasmid pCB301 mở vòng có kích thước 5,502 kb Sản phẩm cắt điện di gel agarose 0,8% (Hình 3.12) ~5,502 kb Hình 3.12 Ảnh cắt pCB301 HindIII; M: thang chuẩn 1kb Kết không thấy xuất băng có kích thước 60 bp, nguyên nhân có kích thước nhỏ nên nhanh chóng di chuyển môi trường thoát khỏi băng điện di Kết hình ảnh cho thấy xuất đoạn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn băng mong muốn có kích thước khoảng 5,502 kb có băng lớn 10 kb, có dạng siêu xoắn plasmid chúng di chuyển chậm gel agarose môi trường điện di Chúng tiến hành cắt băng mong muốn gel tinh sạch, bảo nhiệt độ - 20 0C để phục vụ cho việc thiết kế vector chuyển gen sau 3.2.6 Tạo vector chuyển gen pCB301 mang cấu trúc GmEXP1 Plasmid pCB301 dạng Ti-plasmid Agrobacterium tumefaciens cải biến cách loại bỏ gen gây độc gắn vào gen kháng sinh để chọn lọc để phù hợp với việc chuyển gen vào tế bào thực vật Cả hai cấu trúc plasmid pCB301 GmEXP1 xử lý loại enzyme HindIII, đo chúng dễ dàng ghép nối lại với nhờ enzyme T4 ligase Thành phần phản ứng ghép nối gồm: H2O: µl; BufferT4: µl; T4 ligase: µl; GmEXP1: µl; plasmid pCB301 : µl Phản ứng thực 22 0C khoảng thời gian từ Sau đó, tiến hành biến nạp phương pháp sốc nhiệt vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli DH5α để chọn lọc, nhân nhanh plasmid với số lượng lớn Kết biến nạp vào E coli DH5α có nhiều khuẩn lạc sống sót môi trường có kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l, chứng tỏ việc biến nạp thành công Kết kiểm tra vector tái tổ hợp phản ứng colony-PCR Chúng tiến hành chọn 10 khuẩn lạc riêng rẽ, tròn đều, từ đĩa khuẩn để tiến hành tách plasmid, sau thực phản ứng PCR plasmid với mồi đặc hiệu Kết colony PCR kiểm tra điện di gel agrose (Hình 3.13) cho thấy, 6/10 mẫu plasmid tách chiết từ E coli DH5α biến nạp vector tái tổ hợp pCB301/GmEXP1 cho kết dương Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn tính, xuất băng vạch có kích thước khoảng 768 bp Như mẫu plasmid mang cấu trúc pCB301/GmEXP1 sử dụng tốt cho thí nghiệm Từ khuẩn lạc kiểm tra dương tính, tiến hành nuôi môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50 mg/l, khuẩn nuôi máy lắc 200 v/p nhiệt độ 37 0C thời gian 16 Sau 16 tiến hành tách plasmid bảo - 20 0C để sử dụng biến nạp tiếp vào A tumefaciens làm công cụ chuyển gen ~768bp 750bp Hình 3.13 Hình điện di sản phẩm colony- PCR; Giếng 1-10: dòng khuẩn lạc; M: thang chuẩn kb 3.2.7 Kết tạo dòng vi khuẩn A tumefaciens mang cấu trúc gen GmEXP1 Plasmid pCB301/GmEXP1 sau thiết kế thành công biến nạp vào A tumefaciens phương pháp xung điện Đây phương pháp biến nạp có hiệu quả, có thời gian thí nghiệm ngắn Sản phẩm trình biến nạp nuôi chọn lọc môi trường LB đặc có Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn chứa 50 mg/l kanamycin 100 mg/l rifamycin, ủ petri đĩa 28 o C thời gian 48 Các dòng khuẩn lạc A tumefaciens tạo nhờ xung điện chứa Ti-plasmid tái tổ hợp phát phương pháp chọn lọc môi trường chứa kháng sinh chọn lọc (kanamycin 50 mg/l 100 mg/l rifamycin) Chỉ có khuẩn lạc A tumefaciens biến nạp thành công Plasmid pCB301/GmEXP1 sống môi trường chọn lọc Để kết luận chắn dòng khuẩn lạc mang vector chuyển gen, tiến hành kiểm tra phản ứng colony-PCR Chọn ngẫu nhiên dòng khuẩn lạc A tumefaciens mọc đĩa thạch để tiến hành phản ứng colony-PCR cặp mồi đặc hiệu Phản ứng thực với nhiệt độ gắn mồi 56 0C, lặp lại 30 chu kỳ Sản phẩm phản ứng điện di kiểm tra gel agarose 0,8%, kết thể (Hình 3.14) Kết điện di cho thấy có 6/6 dòng khuẩn lạc lựa chọn cho kết dương tính thực phản ứng PCR với băng có kích thước khoảng 768 bp Với kết PCR đạt tỷ lệ 100%, khẳng định biến nạp thành công vector pCB301/GmEXP1 vào vi khuẩn A tumefaciens Các chủng vi khuẩn 1, 2, 3, 4, 5, phục vụ cho việc chuyển gen vào thực vật 750bp ~ 768bp Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 3.14 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR; Giếng 1-6: dòng khuẩn lạc; M: thang chuẩn kb 3.3 Kiểm tra hoạt động vector mang cấu trúc GmEXP1 thuốc mô hình 3.3.1 Kết chuyển cấu trúc GmEXP1 vào thuốc Sau biến nạp thành công vector vào vi khuẩn A tumefaciens, tiếp tục tiến hành chuyển gen GmEXP1 thông qua việc lây nhiễm chủng vi khuẩn A tumefaciens mang cấu trúc gen GmEXP1 vào tế bào mảnh thuốc Nicotiana tabacum K326 cắt tổn thương cạnh nuôi cấy môi trường cảm ứng GM trước ngày Để chuẩn bị cho việc biến nạp song song với việc nuôi lỏng A tumefaciens mang cấu trúc gen GmEXP1 đồng thời gây tổn thương mảnh trước hai ngày Sau hai ngày khuẩn nuôi phục hồi môi trường LB lỏng kháng sinh, sau tiến hành đo OD đạt số từ 0,6 đến sử dụng khuẩn để tiến hành biến nạp Sau hai ngày đồng nuôi cấy tối (Hình 3.15.A), tiến hành rửa khuẩn cefotaxim 500 mg/l, cấy chuyển mảnh sang môi trường GM có bổ sung cefotaxim 500 mg/l, kanamycin 50 mg/l BAP mg/l (Hình 3.15.B) Sau 2-3 tuần xuất chồi nhỏ (Hình 3.15.C) Số mảnh sống sót môi trường chọn lọc kháng sinh 125/150 Từ mảnh lá, tiến hành tách chồi nhỏ cấy lên môi trường MS có bổ sung cefotaxim 500 mg/l, kanamycin 50 mg/l để nhân nhanh chồi Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Sau 4-5 tuần, thu nhiều chồi từ mảnh cảm ứng tạo mô sẹo, chồi phát triển cao khoảng cm cắt chuyển sang môi trường RM ( MS + sucrose 30g/l + Agar 8g/l + IBA) RM có bổ sung cefotaxim 250 mg/l, kanamycin 50 mg/l (Hình 3.15.D) Tỷ lệ chọn lọc sơ mảnh môi trường chọn lọc qua lần biến nạp thể Bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết tạo thuốc chuyển gen GmEXP1 Biến nạp Số mảnh Số mảnh Số mảnh Tổng lá mảnh sống sót sống sót sống sót sau sau sau tuần tuần tuần Số mảnh Số cảm rễ môi ứng tạo trường chồi chọn lọc Lần 50 46 43 40 40 30 Lần 50 45 42 39 37 32 Lần 50 43 40 38 31 30 Tổng 150 134 125 117 108 92 Bảng 3.1 cho thấy số lượng mảnh sống sót môi trường chọn lọc giảm dần theo thời gian, điều cho thấy khả mảnh tồn phát triển mô mang tế bào chuyển gen Sau - tuần, có 117/150 mảnh sống sót môi trường chọn lọc qua lần biến nạp Sau – tuần, 92 thuốc chuyển gen hoàn chỉnh tạo thành (Hình 3.15.F) Hình 3.15 mô tả toàn trình chuyển gen tạo thuốc mang cấu trúc gen GmEXP1 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 3.15 Hình ảnh minh họa giai đoạn chuyển gen vào thuốc A: Mảnh sau nhiễm khuẩn cấy môi trường GM B: Mảnh chuyển sang môi trường GM có bổ sung cefotaxim 500 mg/l, kanamycin 50 mg/l C: Các cụm chồi tạo thành sau hai tuần nuôi cấy môi trường GM có bổ sung cefotaxim 500 mg/l, kanamycin 50 mg/l D: Các chồi màu xanh tách môi trường tạo rễ RM có bổ sung cefotaxim 250 mg/l, kanamycin 50mg/l E: Chồi chuyển gen sau tuần môi trường tạo rễ RM có bổ sung cefotaxim 250 mg/l, kanamycin 50 mg/l 3.3.2 Kết kiểm tra thuốc mang gen GmEXP1 Để kiểm tra có mặt gen chuyển thuốc chuyển gen, tiến hành tách DNA tổng số từ mẫu 22 thuốc chuyển gen GmEXP1 ngẫu nhiên Kết tách DNA tổng số thể (Hình 3.16) Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 3.16 Ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số tách từ thuốc lá; Giếng 1-22: mẫu thuốc Kết điện di (Hình 3.16) khẳng định mẫu tách chiết DNA tổng số sử dụng cho phản ứng PCR Để kiểm tra có mặt gen GmEXP1 cây, dùng phương pháp PCR để nhân gen cặp mồi đặc hiệu Phản ứng có nhiệt độ gắn mồi 560C Vì số gen thường so với mẫu vi khuẩn nên phản ứng PCR phải kéo dài hơn, thí nghiệm cho lặp lại phản ứng 40 chu kỳ Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR thể hình 3.17 750bp ~ 768bp Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 3.17 Hình điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmEXP1 từ thuốc lá; Giếng 1-22: mẫu thuốc lá; M: thang chuẩn kb Kết thể (Hình 3.17) cho thấy, sản phẩm PCR điện di có 22/22 mẫu có sản phẩm PCR, kích thước khoảng 0,77 kb Kích thước hoàn toàn phù hợp với chiều dài cấu trúc GmEXP1 gen chuyển Vì vậy, khẳng định gen GmEXP1 chuyển vào thuốc Như vậy, bước đầu thu thuốc chuyển gen mang cấu trúc pCB301/GmEXP1 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Đã phân lập đoạn mã hoá gen GmEXP1 có kích thước 768 bp từ mRNA đoạn mã hoá gen GmEXP1 có sai khác vị trí nucleotit so với trình tự gen GmEXP1 mang mã số AF516879 công bố ngân hàng gen quốc tế 1.2 Thiết kế thành công vector chuyển gen mang cấu trúc pCB301/GmEXP1 biến nạp vào chủng vi khuẩn A Tumefaciens 1.3 Đã tạo thuốc mang gen GmEXP1 phòng thí nghiệm phương pháp chuyển gen gián tiếp qua Agrobacterium tumefaciens Đề nghị 2.1 Tiếp tục phân tích, đánh giá khả phát triển hệ rễ dòng thuốc chuyển gen 2.2 Chuyển gen GmEXP1 vào số giống đậu tương chịu hạn chuyển vào loại trồng có rễ củ làm tăng kích thước rễ củ qua làm tăng giá trị kinh tế loại trồng Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Trần Thị Cúc Hòa (2007), “Nghiên cứu khả đáp ứng chuyển nạp gen giống đậu tương trồng Việt Nam’’ Tạp chí Nông nghiệp Phát triển nông thôn, 18, 11-16 Nguyễn Thị Thuý Hường (2011), Phân lập, tạo đột biến điểm gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn thử nghiệm chuyển vào đậu tương Việt Nam, Luận án tiến sỹ Di truyền học, Đại học Thái Nguyên Trần Đình Long, Đoàn Thanh Nhàn (1995) “Kết nghiên cứu giống đậu tương M103’ Kết nghiên cứu khoa học câu đậu đỗ 1991-1995: 52-56 Trần Thị Phương Liên (2010) Protein tính chống chịu thực vật, NXB Khoa hoc tự nhiên Công nghệ: 82-140 Chu Hoàng Mậu (2001), Nghiên sử dung phương pháp đột biến thực nghiêm để tạo dòng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông bắc Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học Viện Công nghệ sinh học, Hà Nội Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả chịu hạn chọn dòng tế bào chịu hạn lúa công nghệ tế bào thực vật, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật- nghiên cứu ứng dụng NXB Nông nghiệp, Hà Nội Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu tiếng Anh Ahn J.H., Choi Y., Kim S.G., Kwon Y.M., Choi Y.D., Lee J.S (1998), “Expression of a Soybean Hydroxyproline-Rich Glycoprotein Gene Is Correlated with Maturation of Roots”, Plant Physiol, pp 671 - 679 10.Close T.J.(1997), “Dehydrin: Emergence biochemical role family plant dehydrin proteins’’, Physiologia plantarum, 795-803 11.Cosgrove D J., Li Z C., 1993 Role of expansin in cell enlargement of oat coleoptiles Plant Physiol., 103: 1321-1328 12.Cosgrove D J., 1996 Plant cell enlargement and the action of expansin BioEssays., 18: 533-540 13.Cosgrove D J., 1998 Cell wall loosening by expansin Plant Physiol., 118: 333-339 14.Cosgrove D J., 1999 Enzymes and other agent that enhance cell wall extensibility Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol., 50: 391-417 15.Cosgrove D J., 2000 Expansinve grouth of plant cell walls Plant Physiol Biochem., 38: 109-124 16.Csonka LN, Gelvin SB, Goodner BW, Orser CS, Siemienak D, and Slightom JL (1988), “Nuleotid sequence of a mutation in the proB gene of Escherichia coli that confers proline overproduction and enhanced tolerance to osmotic stress’’ Gene 64(2): 199-205 17.Dix PJ, (1986) “Plant cell culture culture technology’’ Yeoman M.M (eds), Oxford, Blackwell Scientific Publications 143-201 18.HamiltonIIIEW,HeckathornSA (2001) MitochondrialadaptationstoNaCL com plex I is protected by prolinee and small heat shock proteins, whereas 19.Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumasho T (1994), “Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis the boundaries the T-DN’’, The plant Journal 271-181 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 20.Hiroaki Fujii and Jian-Kang Zhu (2009) an auto phosphorylation site of the protein kinase SOS2 is important for salt telerance in Arabidopsis Molecular Plant, doi: 10.1093/mp/ssn087 21.Kam M.J., Yun H S., Kanfman P B., Chang S C., Kim S C., 2005 Two expansin, EXP1 and EXPB2, are correlated with the growth and develomet of maize root J Plant Physiol., 48(3): 304-310 22.Kodym A, Afza R (2003) “Physical and chemical mutagenesis, plant functional genomics Eric Grotewold(Ed.), Humana Press 189-204 23.Lee D.K., Ahn J.H., Song S.K., Choi Y.D., Lee J.S (2003), “expression of an expansin Gene Is Correlated with Root Elongation in Soybean”, Plant Physiology, (131), pp 985 - 997 24.Li Y., Darley C.P., OngaroV., Fleming A., Schipper O., Baldauf S L., McQueen-Mason S J., 2000 Plant expansins are a Complex multigene family with an ancient eVolationary origin J Plant Physiol., 128(3): 854-864 25.Nong V.H., Arahira M., Phan V.C., Kim C.S., Zhang D., Udaka K., Fukazawa C (1997), “Glycine max cct - d gen (cDNA) for group IIchaperonin delta-subunit complete cds”, Genbank/EBI/DDBJ databases, Acc No AB004233 26.SabehatA, LurieS, WeissD (1998) Expression of small heat shock proteins at low temperatures Plant Physiology, 177: 651-658 27.Porcel R, azconR, Rui- Lozano JM (2005), “Evaluation of the role of genes encoding for dehydrin proteins (LEA D-11) during drought stress in arbuscular mycorrhizal Glycene max and Lactuca sativaplants” Journal of Experimental Botany, 56(417): 1933-42 Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 28.Thomashow MF (1998) Role of cold responsive genes in plant freezing tolerance Plant Physiology, 118: 1-7 29.Umezawa T, Yoshida R, Maruyama K, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K and Thomashow MF (2004) SRK2C, a SNF1-Related protein kinase 2, improves drought tolerance by controlling stressresponsive gene expression in Arabidopsis thaliana Proceeding of National Academy of Science, 101 (49): 17306-17311 30.Vierling E, Kimpe JA (1992) Plant responses to environmental stress Current Opinion in Biotechnology, 3: 164-170 31.www Vietrade.gov.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn [...]... xúc của hệ rễ phục vụ tạo dòng đậu tương chuyển gen có hệ rễ phát triển, chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành đề tài luận văn là: Thiết kế vector mang cấu trúc gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ phục vụ chuyển gen ở cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)” 2 Mục tiêu nghiên cứu Tạo được vector chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ đậu tương và chuyển vào cây thuốc... dụng kỹ thuật chuyển gen trên cây đậu tương mới chỉ tập trung nghiên cứu quy trình chuyển gen đối với một số giống đậu tương trong nước và nhập khẩu (Trần Thị Cúc Hòa (2007) [2], tạo cây chuyển gen mang cấu trúc gen P5CS của Nguyễn Thị Thuý Hường năm 2009 [3], … 1.2 Gen liên quan đến tính chịu hạn và gen GmEXP1 ở cây đậu tương 1.2.1 Các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương Trong những năm... giả đã có nhận xét là sự phát triển của bộ rễ có sự tương quan mật thiết với các cơ chế kháng hạn Sự thích nghi linh hoạt của hệ rễ là một yếu tố quan trọng để duy trì sự sống trong điều kiện hạn hán Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu phân lập các gen liên quan đến tính chịu hạn, chịu nóng của cây đậu tương Nghiên cứu phân lập và đọc trình tự gen chaperonin từ giống đậu tương chịu lạnh Bonminori... P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam (2011) [3] Hạn hán luôn là thử thách lớn đối với sự sinh trưởng, phát triển của cây đậu tương, ảnh hưởng lớn tới năng suất sinh học cũng như năng suất kinh tế của cây đậu tương Để khắc phục thực trạng trên thì việc nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương theo hướng tăng cường khả năng biểu hiện của gen liên quan đến tính chịu... diện tích đậu tương chuyển gen thì 75% được trồng ở Bắc Mỹ Riêng ở Mỹ, diện tích đậu tương kháng thuốc diệt cỏ chiếm 85% diện tích trồng cây đậu tương Còn ở châu Á, đậu tương kháng thuốc diệt cỏ chiếm 6% tổng sản phẩm cây trồng biến đổi gen Năm Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 2004, đậu tương kháng thuốc diệt cỏ đạt đến diện tích 48,4 triệu ha chiếm 60% diện tích cây trồng biến đổi gen Ở Việt... sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương Chính vì vậy nghiên cứu tuyển chọn giống đậu tương chịu hạn và nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương là rất cần thiết Theo hướng nghiên cứu này, Nguyễn Thị Thuý Hường và đtg (2009) đã phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam [3] Năm 2003, Lee và đtg đã phân lập được gen GmEXP1... so với các rễ chính Rất có thể, sự biểu hiện của gen Sb-HRGP3 liên quan đến việc chấm dứt sự kéo dài của rễ [9] Khi nghiên cứu về gen TCS (gen hai thành phần hệ thống có chức năng chống hạn) ở đậu tương các tác giả Dung Tien Le, Rie Nishiyama, Yasuko Watanabe và đtg (2011) nhận thấy, cơ chế kháng hạn là một trong hai cơ chế liên quan đến rễ và chồi Khảo sát hình thái của 29 hệ rễ cây đậu tương các tác... tổng số và tạo cDNA từ mRNA; 3.2 Nhân gen GmEXP1 từ cDNA, tách dòng và xác định trình tự đoạn mã hoá của gen GmEXP1 phân lập từ cây đậu tương; 3.3 Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1 và biến nạp vector chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1 vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 3.4 Chuyển gen GmEXP1 vào cây thuốc lá Nicotiana tabacum K326 và kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng PCR Tài liệu chia sẻ... chịu được quan tâm Trong những năm gần đây do ảnh hưởng của biến đổi khí hậu toàn cầu cũng như hạn hán đã làm ảnh hưởng tới tình hình phát triển cây đậu tương ở Việt Nam Từ năm 2007 đến nay, diện tích trồng đậu tương có sự biến động và có xu hướng tăng vào năm 2012, 2013, nhưng năng suất và sản lượng đậu tương gần như không tăng đáng kể (Bảng 1.1) Bảng 1.1 Sản xuất đậu tương ở Việt Nam từ 2007 đến 2013... nhiều gen liên quan đến tính chịu hạn đã được phân lập như P5CS, DREB2, DREB5, TCS, CCTδ, Sb-HRGP3, GmEXP1, GmEXP2… đây sẽ là nguồn nguyên liệu làm cơ sở để tạo cây chuyển gen nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương 1.2.2 Gen GmEXP1 và protein EXP1 ở cây đậu tương Lee và đtg (2003) đã nghiên cứu phân lập gen GmEXP1 từ mRNA của cây đậu tương với kích thước 1089 bp và năm 2011 ông và các cộng sự ... hoá gen GmEXP1 phân lập từ đậu tương; 3.3 Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1 biến nạp vector chuyển gen mang cấu trúc GmEXP1 vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 3.4 Chuyển gen GmEXP1. .. chuyển gen .6 1.2 Gen liên quan đến tính chịu hạn gen GmEXP1 đậu tương 1.2.1 Các gen liên quan đến tính chịu hạn đậu tương 1.2.2 Gen GmEXP1 protein EXP1 đậu tương 10 1.2.3 Vector chuyển gen. .. 3.2.6 Tạo vector chuyển gen pCB301 mang cấu trúc GmEXP1 41 3.2.7 Kết tạo dòng vi khuẩn A tumefaciens mang cấu trúc gen GmEXP1 42 iv 3.3 Kiểm tra hoạt động vector mang cấu trúc GmEXP1