Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VŨ THỊ THU THỦY TẠO DÒNG CHỊU HẠN VÀ PHÂN LẬP GEN CYSTAIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở CÂY LẠC (Arachis hypogaea L.) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.70.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2011 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Lạc (Arachis hypogaea L.) thực phẩm, công nghiệp lấy dầu, nhiều quốc gia giới có nhu cầu ngày mở rộng phát triển sản xuất Cây lạc thuộc nhóm đậu đỗ có khả chịu hạn So với nhiều trồng khác, lạc có nhu cầu đặc biệt nước rễ lạc lông hút, lạc hình thành đất Kết thống kê cho thấy, nước ta sản suất lạc chiếm khoảng 40% tổng diện tích đất gieo trồng công nghiệp ngắn ngày, có 2/3 diện tích trồng lạc phụ thuộc vào nước trời Đối với nhiều địa phương, lạc trồng chính, nhiên việc đầu tư cho phát triển ngành sản xuất lạc đánh giá chưa tương xứng với tiềm vốn có Có nhiều phương pháp cải tạo giống trồng, nuôi cấy mô tế bào thực vật kỹ thuật hiệu quả, cho phép ứng dụng cải tiến nhiều đặc tính trồng Trong trình nuôi cấy ảnh hưởng môi trường, tế bào bị biến đổi vật chất di truyền Nếu kết hợp với tác nhân gây đột biến tần số phát sinh đột biến tăng lên đáng kể Điều có ý nghĩa việc tạo nguồn vật liệu cho trình chọn giống Hiệu việc ứng dụng công nghệ tế bào thực vật để nâng cao tính chống chịu với điều kiện bất lợi ngoại cảnh liên tục khẳng định Ở Việt Nam, đời giống lúa DR1 DR2 có khả chịu hạn, chịu lạnh tốt minh chứng cho khả Tiếp sau công trình nghiên cứu cải thiện khả chịu hạn, chịu muối mía Yadav đtg (2006), tăng khả chịu hạn lúa mỳ Abdelsamad đtg (2007) … Khả chịu hạn thực vật tính trạng nhiều gen quy định, việc tìm kiếm phân tích gen liên quan đến đặc tính chịu hạn nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Một số gen liên quan đến tính chịu hạn trồng phân lập công bố như: gen LEA đậu tương đậu xanh, gen P5CS đậu tương, gen cystatin đậu xanh, gen DREB Arabidopsis Gen cystatin (CYS) thực vật công bố lúa Abe đtg (1987) Đến nay, gen CYS phân lập nhiều loài thực vật bậc cao, mầm hai mầm (CYS đậu xanh, gen CYS khoai tây, gen CYS ngô) Các nghiên cứu gen cystatin bàn luận nhiều mối liên quan với khả chống chịu hạn, lạnh, mặn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Từ lý xuất phát từ nhu cầu thực tiễn việc chọn tạo giống lạc theo hướng nâng cao khả chịu hạn, tiến hành đề tài luận án: “Tạo dòng chịu hạn phân lập gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn lạc (Arachis hypogaea L.)” Mục tiêu nghiên cứu - Tạo dòng lạc có khả chịu hạn cao giống gốc công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật − Xác định khác biệt trình tự gen cystatin dòng lạc chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo giống lạc có khả chịu hạn khác Nội dung nghiên cứu − Sàng lọc dòng mô sẹo chịu nước tác động thổi khô tác động chiếu xạ tia gamma kết hợp với thổi khô − Phân tích biến động số tính trạng số lượng, chất lượng hạt khả chịu hạn dòng chọn lọc − So sánh xác định sai khác hệ gen dòng chọn lọc kỹ thuật RAPD − Khuếch đại, tách dòng xác định trình tự gen cystatin dòng lạc chọn lọc giống gốc Những đóng góp luận án i) Luận án xây dựng quy trình chọn dòng lạc chịu hạn theo cách sử dụng kết hợp phương pháp nuôi cấy mô tế bào, gây đột biến tia gamma sử dụng thị phân tử RAPD; tách dòng so sánh khác biệt trình tự gen cystatin liên quan đến tính chịu hạn Quy trình rút ngắn thời gian cần thiết nâng cao hiệu cho công tác chọn giống lạc ii) Xử lý mô sẹo tia gamma làm giảm chiều cao tỷ lệ tái sinh cây, biến đổi màu sắc hình dạng Phát thị RAPD đặc trưng cho hai dòng lạc chọn lọc RM47 RM48: RM48/OPA07-750bp; RM48/OPA08-500bp; RM48/OPB05-900bp; RM48/UPC348-200bp; RM47/OPH08-250bp Phát gen cystatin lạc thuộc nhóm I phytocystatin, có có tương đồng cao với cystatin đậu xanh (81,3%), thấp với cystatin kiwi (42,9%) Gen có chứa intron exon mã hóa cho protein có 98 amino acid Cystatin dòng RM48 có nguồn gốc từ mô sẹo xử lý tia gamma kết hợp với thổi khô Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn có vị trí amino acid sai khác so với giống gốc L18 Sự thay amino acid dòng RM48 amino acid giống gốc vị trí 29 (Glu →Asp), 30 (His→Thr), 31 (Asn→Thr), 32 (Lys →Arg), 33 (Lys →Asn), 34 (Glu →Arg), 36 (Gly →Ala) iii) Xác định khác biệt so với giống gốc L18 khả chịu hạn ba dòng lạc RM48, RM47, R46 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu nước xử lý tia gamma (2krad) kết hợp với thổi khô liên tục hệ thống nuôi cấy in vitro Ý nghĩa khoa học thực tiễn 5.1 Ý nghĩa khoa học i) Kết nghiên cứu luận án cung cấp dẫn liệu khoa học ứng dụng công nghệ tế bào thực vật để cải tiến khả chịu hạn lạc Kỹ thuật chọn dòng tế bào chịu nước xử lý mô sẹo để tăng tần số phát sinh đột biến Cách tiếp cận phương pháp đánh giá khác biệt dòng lạc chọn lọc so với giống gốc phương diện hình thái, biểu tính trạng cấu thành suất, khả chịu hạn, đặc điểm hóa sinh hạt sai khác hệ gen ii) Cung cấp thông tin cystatin gen cystatin lạc Xử lý mô sẹo chiếu xạ kết hợp với thổi khô gây nước tác nhân làm xuất đột biến gen cystatin minh chứng sai khác trình tự gen dòng RM48 (có nguồn gốc từ mô sẹo chịu chiếu xạ kết hợp với thổi khô) so với dòng R46 (có nguồn gốc từ mô sẹo chịu thổi khô) giống gốc L18 5.2 Ý nghĩa thực tiễn Những kết đánh giá toàn diện khả chịu hạn lạc mức độ mô sẹo, hạt nảy mầm non làm để đánh giá ứng dụng biện pháp cải thiện khả chịu hạn lạc Kết chọn tạo dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu xử lý chiếu xạ thổi khô ưu việt khả chịu hạn số đặc điểm nông sinh học, hoá sinh hạt bồi dưỡng thành giống làm vật liệu cho lai giống Cấu trúc luận án Luận án gồm 128 trang (kể tài liệu tham khảo), chia thành phần: Phần Mở đầu gồm có trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 39 trang; Chương 2: Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Vật liệu Phương pháp, 14 trang; Chương 3: Kết thảo luận, 54 trang; Phần Kết luận đề nghị: trang; Các công trình công bố liên quan đến luận án: trang Tài liệu tham khảo: 15 trang với 145 tài liệu tham khảo tiếng Việt tiếng Anh Luận án có 22 bảng số liệu, 20 hình Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tổng kết 34 tài liệu nước 98 tài liệu nước với nội dung liên quan, bao gồm: (1) Cây lạc đặc tính chịu hạn lạc; (2) Nghiên cứu nâng cao khả chịu hạn trồng công nghệ tế bào thực vật; (3) Phân tích, đánh giá dòng chọn lọc có nguồn gốc từ nuôi cấy mô sẹo (4) Gen liên quan đến tính chịu hạn lạc; (5) Cystatin vai trò cystatin thực vật Với dẫn liệu thu thập được, kết phân tích khẳng định, lạc có giá trị vị trí quan trọng kinh tế nhiều nước giới Xu biến đổi khí hậu làm thay đổi yếu tố điều kiện môi trường, ngày có nhiều nghiên cứu đánh giá, chọn tạo giống lạc theo hướng nâng cao tính chống chịu thực Cũng giống trồng khác, phương pháp sử dụng chọn tạo giống lạc bao gồm lai giống, tạo giống đột biến, chọn lọc từ quần thể sử dụng công nghệ sinh học đại Ứng dụng kỹ thuật đại công nghệ sinh học để nâng cao tính chống chịu trồng tiến hành theo hai hướng, chọn dòng biến dị soma chuyển gen Thành công kỹ thuật chuyển gen công bố nhiều loại trồng nhiều đặc tính liên quan đến khả chịu hạn thực vật cải thiện Kỹ thuật chọn dòng tế bào thực vật bậc cao ứng dụng dựa sở hiểu biết tính toàn tế bào; không đồng mô quần thể tế bào nuôi cấy; ảnh hưởng môi trường nuôi cấy trình hình thành thể hoàn chỉnh làm cho quần thể tế bào nuôi cấy coi quần thể tế bào thực vật, sàng lọc cá thể nhanh hiệu phương pháp chọn giống thông thường áp dụng nguyên vẹn Chọn dòng theo hướng tăng cường khả chống chịu yếu tố bất lợi ngoại cảnh thành công số đối tượng lúa nước, lúa cạn, lúa mỳ, thuốc Đây Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn gợi ý để lựa chọn kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nâng cao khả chống chịu hạn lạc Tính chịu hạn thực vật tính trạng nhiều gen định Xu hướng tìm kiếm gen chịu hạn mối quan tâm nghiên cứu nhiều tác giả Các gen liên quan đến khả chịu hạn lạc công bố năm gần như: gen LEA liên quan đến nước tế bào Nghiên cứu Su đtg (2010) giống lạc Luhua 14 phát có loại gen LEA Gen AhNCED mã hóa tổng hợp 9-cis epoxycarotenoid dioxygenase xác nhận có liên quan với khả chống chịu thực vật, lạc AhNCED phân lập Wan đtg (2005) có kích thước 2486bp, mã hóa protein gồm 610 amino acid Gen PLD mã hóa phospholipase D khẳng định có liên quan đến hạn phát lạc gồm hai loại AhPLD1 AhPLD2 nhờ nhóm nghiên cứu Nakazwa (2006) Cystatin thực vật gọi phytocystatin, gồm có hai nhóm, khác biệt kích thước, khối lượng vùng gắn với cysteine proteinase Từ năm 1987, gen cystatin phân lập lúa, đến gen cystatin phân lập nhiều loài thực vật, nhiên lạc biết đến Nghiên cứu chức cystatin, nhiều tác giả bàn luận mối liên quan cystatin với tính chống chịu thực vật Sự phức tạp cấu trúc gen cystatin, khả biểu gen giai đoạn sinh trưởng khác trồng mối liên quan với tính chống chịu yếu tố bất lợi ngoại cảnh Một số công bố biểu gen cystatin liên quan đến khả chịu hạn minh chứng đậu cove, rau giền, cải biển, lúa mỳ đông để tiếp tục tìm phân tích gen cystatin lạc Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu thực vật Luận án sử dụng 10 giống lạc làm vật liệu nghiên cứu Trong đó, giống (L05, L16, L18, L23, L24, V79, MD7, MD9) cung cấp Trung tâm Nghiên cứu phát triển đậu đỗ, Viện Cây lương thực Cây thực phẩm Việt Nam Giống SD30 Trung tâm khuyến nông tỉnh Nam Định cung cấp giống lạc đỏ (Đỏ BG) Trung tâm phát triển đậu đỗ huyện Việt Yên, Bắc Giang cung cấp Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 2.2 Hoá chất thiết bị Sử dụng loại hóa chất tinh khiết chuyên dụng có nguồn gốc từ hãng có uy tín như: chất kích sinh trưởng hãng Sigma; Taq-polymerase, EDTA, SDS, agarose hãng Invitrogen 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro Để tạo dòng lạc kỹ thuật nuôi cấy in vitro, trình nuôi cấy gồm bước: Tạo mô sẹo môi trường tối hoàn toàn (10 ngày); tiến hành gây nước luồng khí vô trùng box cấy chiếu xạ sau kết hợp gây nước xử lý thổi khô; tái sinh cây; tạo hoàn chỉnh theo mô tả Nguyễn Thị Tâm đtg (2006) 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu đồng ruộng Đánh dấu riêng dòng tái sinh từ mô sẹo Thực chế độ trồng chăm sóc dòng giống theo dẫn Bộ Nông nghiệp phát triển Nông thôn Các tiêu nông học suất xác định vào thời kỳ chín 2.3.3 Phương pháp sinh lý, hoá sinh Định lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry; định lượng lipid theo phương pháp Soxhlet; Xác định hoạt độ α-amylase theo phương pháp Heinkel; Định lượng đường phương pháp vi phân tích Đánh giá khả chịu nước mô sẹo phương pháp nhuộm màu tế bào với TTC Towill đtg (1975) Đánh giá khả chịu hạn giai đoạn hạt nảy mầm phương pháp gây hạn với sorbitol 7%; xác định khả chịu hạn thông qua xác định hoạt độ αamylase, hàm lượng đường Đánh giá khả chịu hạn giai đoạn non phương pháp gây hạn nhân tạo theo Lê Trần Bình đtg (1998) 2.3.3 Phương pháp sinh học phân tử Tách chiết DNA tổng số theo phương pháp Gawell đtg (1991) Phân tích đa hình DNA kỹ thuật RAPD theo William đtg (1990) Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Phân lập gen kỹ thuật PCR Tách dòng gen theo phương pháp Sambrook đtg (2001) Trình tự gen xác định máy tự động Viện Công nghệ Sinh học 2.3.4 Phương pháp phân tích số liệu Phân tích trị số thống kê phần mềm Excel theo Chu Hoàng Mậu (2008); Phân tích số liệu RAPD phần mềm NTSYSpc version 2.0; Kết phân tích gen phần mềm BioEdit DNAstar 2.4 Địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm tiến hành trường Đại học Sư phạm; Trường Đại học Khoa học; Viện Khoa học Sự Sống- thuộc Đại học Thái Nguyên Chiếu xạ tia gamma Trung tâm chiếu xạ Quốc gia, Từ Liêm- Hà Nội Trình tự DNA xác định Viện Công nghệ Sinh học Thí nghiệm đồng ruộng đặt Tổ Rừng Vầu, Phường Quang Vinh- Thành phố Thái Nguyên Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ TẠO DÒNG CHỊU HẠN BẰNG KỸ THUẬT XỬ LÝ MÔ SẸO TRONG HỆ THỐNG NUÔI CẤY IN VITRO 3.1.1 Sàng lọc dòng mô sẹo chịu tác động thổi khô 3.1.1.1 Khả tạo mô sẹo độ sinh trưởng mô sẹo 10 giống lạc nghiên cứu Với mục đích đánh giá khả tạo mô sẹo giống lạc hệ thống nuôi cấy in vitro làm sở cho nghiên cứu tạo dòng lạc chịu hạn công nghệ tế bào thực vật, tiến hành thăm dò khả tạo mô sẹo từ tế bào phôi mầm hạt tốc độ sinh trưởng mô sẹo 10 giống lạc nghiên cứu Kết nghiên cứu cho thấy: Tỷ lệ tạo mô sẹo từ phôi mầm 10 giống lạc dao động từ 82,71% (L18) đến 98,55% (V79) Các giống lạc có tỷ lệ tạo mô sẹo đạt 97% giống MD7, MD9, V79 Giống có tỷ lệ tạo mô sẹo thấp 90% gồm giống L18, L23, Đỏ BG Trong đó, tỷ lệ tạo mô sẹo thấp giống L18 (82,71%) Khối lượng mô sẹo giống lạc tạo thành dao động từ Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 115,00mg (L18) đến 198,00mg (V79) Các giống L05, L23, MD7, MD9, SD30, V79 có khối lượng mô sẹo đạt 180mg Bốn giống L16, L18, L24 Đỏ BG có khối lượng mô sẹo tạo thành nhỏ 160mg Kết thu cho thấy, khả tạo mô sẹo sinh trưởng mô sẹo 10 giống lạc đáp ứng cho nghiên cứu chọn dòng tế bào 3.1.1.2 Khả chịu nước mô sẹo giống lạc nghiên cứu Khả chịu nước mô sẹo xác định thông qua độ nước, qua kết đánh giá nhanh sức sống mô sẹo phương pháp nhuộm TTC xác định tỷ lệ sống sót mô sẹo sau xử lý thổi khô Kết xác định tỷ lệ sống sót mô sẹo sau xử lý thổi khô thể sức chịu đựng tế bào sở để sàng lọc dòng tế bào Các mô sẹo chịu nước thu nguồn nguyên liệu để thực tái sinh phục vụ chọn dòng lạc chịu hạn Kết nghiên cứu khả tái sinh mô sẹo chịu nước cho thấy, tất giống lạc tham gia thí nghiệm có khả tái sinh từ mô sẹo sống sót Các mô sống sót cho tỷ lệ tái sinh từ 83,33% đến 100,00% Căn vào kết nghiên cứu, chọn thời điểm mô 84% nước so với khối lượng tươi ban đầu tỷ lệ mô sống sót khoảng từ 10% đến 20% ngưỡng sàng lọc dòng Xử lý mô sẹo lạc kỹ thuật thổi khô mô sẹo, xác định giống lạc L18 có khả chịu nước lựa chọn mức thổi khô làm ngưỡng sàng lọc Kết đánh giá khả chịu nước mô sẹo, kết hợp với đánh giá khả chịu hạn 10 giống lạc giai đoạn hạt nảy mầm bị hạn sinh lý giai đoạn non bị hạn nhân tạo cho thấy, 10 giống lạc nghiên cứu, giống L18 có khả chịu nước nhất, có hoạt độ α- amylase hàm lượng đường nhóm thấp ngày hạt nảy mầm bị hạn, có số chịu hạn thấp Kết phù hợp với công bố Trung tâm Đậu đỗ, Viện Cây lương thực Cây thực phẩm Việt Nam cung cấp 3.1.2 Ảnh hưởng tia gamma kết hợp với thổi khô đến tỷ lệ sống sót tái sinh giống lạc L18 Giống lạc L18 xác định giống có khả chịu hạn, chịu nước nước số 10 giống lạc nghiên cứu Bên cạnh đó, giống L18 có suất cao Vì vậy, với mục tiêu cải thiện khả chịu hạn giống lạc Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn suất cao này, tiến hành thăm dò ảnh hưởng kết hợp chiếu xạ tia gamma với sàng lọc dòng chịu nước kỹ thuật thổi khô mô sẹo giống lạc L18 Kết thăm dò ảnh hưởng tia gamma thực liều lượng chiếu xạ mức: 0,5krad; 1,0krad; 2,0krad; 3,0krad; 4,0krad kết hợp với thổi khô mô sẹo Kết xác định tỷ lệ mô sống sót tái sinh thành cho thấy, khả tái sinh mô sẹo chịu ảnh hưởng kết hợp chiếu xạ với thổi khô dao động từ 21,30% đến 88,87% So với khả tái sinh mô sống sót chịu thổi khô, việc xử lý mô sẹo chiếu xạ kết hợp với thổi khô làm giảm tỷ lệ tái sinh Sự khác biệt quan trọng tái sinh chịu tác động chiếu xạ kết hợp với thổi khô biểu rõ nét đặc điểm hình thái, đặc biệt màu sắc hình dạng Với liều chiếu xạ thấp (0,5krad; 1krad; 2krad), có màu xanh đối chứng Nhưng với liều chiếu xạ cao 3krad 4krad màu xanh xuất khoảng 1-2 tuần đầu sau bắt đầu chuyển màu vàng úa Hình thái nhỏ xuất hiện tượng xoăn Tốc độ sinh trưởng tỷ lệ nghịch với cường độ liều chiếu xạ Ở liều chiếu xạ cao có tượng lụi dần, thân cằn cỗi Chiều cao tái sinh thấp nhiều so với đối chứng Bảng 3.6 Ảnh hưởng chiếu xạ kết hợp với thổi khô đến tỷ lệ sống sót tái sinh mô sẹo giống lạc L18 Liều chiếu xạ kết Tỷ lệ mô sống sót hợp thổi khô (% ) 0,5krad 34,23 ± 0,37 1,0krad 33,65 ± 0,52 2,0krad 28,42 ± 0,43 3,0krad 18,87 ± 0,59 4,0krad 12,51 ± 0,42 Tỷ lệ tái sinh (% ) Hình thái tái sinh 47,63 ± 2,37 88,87 ± 5,57 38,87 ± 5,54 26,17 ± 4,97 Bình thường Bình thường Bình thường Lá nhỏ, mép xoăn, vàng rụng Lá nhỏ, mép xoăn, vàng rụng 21,30 ± 6,03 Từ kết đánh giá khả sống sót tái sinh mô sẹo sau xử lý mô sẹo chiếu xạ tia gamma xác định liều tới hạn mô sẹo Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn (2) Cây tạo kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật có số nhánh/ so với giống gốc Quần thể R0 đạt nhánh/cây, quần thể RM0 đạt 6,75 nhánh/cây, giống gốc có 8,33 nhánh/cây (3) Quần thể R0 có 22,80 quả/cây, nhiều giống gốc (đạt 110,30% so giống gốc), quần thể RM0 có số quả/cây giống gốc, có 14,00 quả/cây (đạt 67,73% so giống gốc) (4) Hệ số biến động di truyền tiêu nghiên cứu quần thể tạo kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật lớn so với giống gốc Từ kết đánh giá hệ R0, RM0, chọn dòng có nguồn gốc từ giống lạc L18, dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu ảnh hưởng thổi khô R44, R46, R48 dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu ảnh hưởng chiếu xạ kết hợp với thổi khô RM46, RM47, RM48, RM49 làm vật liệu khởi đầu để đánh giá, chọn lọc hệ 3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH DÒNG LẠC CHỌN LỌC QUA CÁC THẾ HỆ 3.2.1 Đặc điểm nông sinh học dòng lạc chọn lọc hệ thứ Nhất, thứ Ba So với trồng khác, hạt lạc khó bảo quản tỷ lệ nảy mầm thấp thời gian bảo quản kéo dài Số lạc hệ đầu không đủ lớn để thực nghiên cứu liên quan đến khả chịu hạn Vì vậy, toàn hạt dòng lạc chọn lọc quần thể R0, RM0 trồng vào vụ trồng năm Kết đánh giá ổn định tính trạng nông học chiều cao thân chính, số nhánh/ cây; số quả/ cây; số chắc/cây hệ R1, RM1 trồng vụ thu đông năm 2008 (bảng 3.8); hệ R3, RM3 trồng vụ thu đông năm 2009 (bảng 3.9) cho thấy ổn định tính trạng nông sinh học dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo góp phần khẳng định giá trị kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật tạo giống rút ngắn thời gian tạo giống, tăng hiệu trình chọn giống 3.2.2 Đánh giá dòng lạc chọn lọc hệ thứ Năm Chúng tiến hành đánh giá dòng chọn lọc hệ thứ Năm thông qua phân tích số tính trạng số lượng tiêu hóa sinh; đánh giá khả chịu hạn giai đoạn hạt nảy mầm, giai đoạn non sai khác hệ gen kỹ thuật RAPD 12 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 3.2.2.1 Đặc điểm nông sinh học chất lượng hạt Kết đánh giá ổn định tính trạng nông học dòng chọn lọc hệ thứ Năm trồng vụ Thu Đông năn 2010 cho thấy, tiêu nông sinh học có biến động thấp, khoảng 1,66% đến 7,23% Chúng tiến hành đánh giá phân tích đặc điểm suất, chất lượng hạt lạc dòng chọn lọc hệ thứ Năm thông qua xác định yếu tố cấu thành suất khối lượng 100 quả, khối lượng 100 hạt; đánh giá chất lượng hạt phương diện hóa sinh thông qua xác định hàm lượng protein, hàm lượng lipid Kết nghiên cứu đặc điểm nông sinh học, chất lượng hạt dòng lạc chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu nước mô sẹo chịu ảnh hưởng chiếu xạ kết hợp với xử lý gây nước, chọn dòng có đặc điểm bật, bao gồm: (1) Dòng R46 có khối lượng 100 hạt cao; (2) Dòng RM47 có hàm lượng protein cao; (3) Dòng RM48 dòng có hàm lượng lipid cao 3.2.2.2 Kết đánh giá khả chịu hạn Khả chịu hạn thực vật nói chung lạc nói riêng tính trạng khó kiểm soát đồng ruộng Do vậy, tiến hành đánh giá khả chịu hạn dòng lạc chọn lọc hệ thứ Năm giai đoạn hạt nảy mầm giai đoạn non Gây hạn dòng lạc chọn lọc hệ thứ Năm giai đoạn hạt nảy mầm cách xử lý hạt với sorbitol 7%, sau xác định khả chịu hạn thông qua hoạt độ α-amylase hàm lượng đường Kết cho thấy hoạt độ αamylase hàm lượng đường hạt nảy mầm có xu hướng tăng từ ngày tuổi đến ngày tuổi sau giảm dần giai đoạn ngày tuổi (hình 3.6 3.7) 0,6 1,8 0,5 1,6 % hạt nảy mầm Đ VH Đ /m g h ạt n ảy m ầm 0,7 0,4 0,3 0,2 0,1 1,4 1,2 0,8 0,6 0,4 0,2 Ngày tuổi nảy m ầm R44 R44 R46 R48 RM46 RM48 RM49 L18 L23 R46 R48 RM46 RM47 RM48 RM49 L18 L23 RM47 ngày ngày Hình 3.6 Sự biến động hoạt độ Hình 3.7 Sự biến động hàm lượng đường α-amylase điều kiện hạn sinh lý điều kiện hạn sinh lý 13 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Phân tích mối tương quan biến động hoạt độ α-amylase hàm lượng đường giống lạc L18, L23 dòng chọn lọc giai đoạn hạt nảy mầm bị hạn sinh lý, kết trình bày bảng 3.11 Bảng 3.11 Tương quan hoạt độ α-amylase hàm lượng đường giai đoạn hạt nảy mầm STT Giống dòng chọn Phương trình hồi Hệ số tương quan lọc quy R44 1,13x + 0,72 0,9881 R46 1,61x + 0,57 0,8972 R48 1,04x + 0,77 0,8379 RM46 1,83x + 0,34 0,9811 RM47 0,54x + 1,04 0,9945 RM48 2,66x + 0,66 0,9999 RM49 1,04x + 0,68 0,9862 L18 1,07x +0,70 0,8466 L23 2,26x + 0,19 0,9983 Bảng 3.11 cho thấy, hàm lượng đường phụ thuộc tuyến tính vào hoạt độ α-amylase, với hệ số tương quan (R) dao động từ 83,79% đến 99,99% Hoạt độ α-amylase cao làm trình phân giải tinh bột thành đường xảy mạnh mẽ, đảm bảo cung cấp chất dinh dưỡng cho trình nảy mầm hạt, đặc biệt điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào điều kiện cực đoan Sự sai khác hoạt độ α-amylase đường dòng, giống lạc thời điểm hạt nảy mầm khác liên quan đến khả chịu hạn chúng Đánh giá khả chịu hạn giai đoạn non dòng chọn lọc hệ thứ Năm cách xác định tỷ lệ không héo, phục hồi thời điểm đến ngày hạn xác định số chịu hạn tương đối Dòng RM48 có số chịu 14 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn hạn cao (10089,20), sau đến dòng R46 giống lạc L23, thấp dòng R44, RM49 giống gốc L18 Trong dòng lạc chọn lọc giống gốc L18 có dòng chọn lọc có số chịu hạn tương đối cao, dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu thổi khô (R46; R48) dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu ảnh hưởng chiếu xạ kết hợp với thổi khô (RM46; RM47; RM48) 3.2.2.3 Kết so sánh sai khác hệ gen dòng chọn lọc giống gốc Kết phân tích phản ứng RAPD với 25 mồi ngẫu nhiên thu tổng số 1254 phân đoạn, kích thước ước đoán phân đoạn khoảng từ 0,2kb đến 4,2kb Tổng số phân đoạn đa hình 255 phân đoạn, chiếm 20,33% số phân đoạn nhân Kết so sánh tỷ lệ sai khác mức phân tử hệ gen cặp dòng chọn lọc giống gốc cho thấy, tất dòng chọn lọc có sai khác hệ gen so với giống gốc Tám hệ gen có tỷ lệ sai khác từ 1,521% đến 9,143% Mức độ sai khác lớn dòng RM48 dòng R48 (tỷ lệ sai khác 9,143%) Thiết lập mối quan hệ dòng chọn lọc giống gốc mức phân tử dựa số liệu đa hình RAPD với 25 mồi ngẫu nhiên thể sơ đồ hình 3.10 L18 RM46 II R44 R46 RM47 RM49 R48 RM48 I Hình 3.10 Sơ đồ mô tả mối quan hệ dòng chọn lọc với giống gốc L18 mức phân tử 15 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Kết cho thấy, dòng lạc chọn lọc giống gốc L18 phân thành nhóm với khoảng cách di truyền 12% Nhóm I: Chỉ có dòng RM48, dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu tác động kết hợp chiếu xạ thổi khô, có khoảng cách di truyền so với dòng lại giống gốc nhánh 12% Nhóm II: gồm dòng R48, RM49, RM47, R46, R44, RM46 giống gốc L18 Khoảng cách di truyền dòng chọn lọc giống gốc L18 9,5% (1 0,905 = 0,095) Nhóm II chia làm hai nhánh, nhánh thứ giống gốc (L18); nhánh thứ hai, chia thành nhiều nhánh nhỏ bao gồm dòng chọn lọc RM46, R44, R46, RM47, RM44, R48 Hai dòng R44, R46 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu nước có độ sai khác so với giống gốc mức thấp 1,521% 1,522% Hệ số đa dạng di truyền (HRAPD) dòng chọn lọc phạm vi 25 mồi ngẫu nhiên mức phân tử xác định: HRAPD = 11,09% Đã xác định thị phân tử RAPD đặc trưng dòng lạc chọn lọc với mồi ngẫu nhiên dòng RM48 xuất kích thước đặc trưng với mồi Trong đó, mồi OPA07 kích thước đặc trưng xuất 750bp (RM48/OPA07750bp); mồi OPA08 kích thước đặc trưng xuất 500bp (RM48/OPA08500bp); mồi OPB05 có kích thước đặc trưng 900bp (RM48/OPB05-900bp); mồi UPC348 kích thước đặc trưng xuất 200bp (RM48/UPC348-200bp) Mồi OPH08 xuất đặc trưng kích thước 250bp với dòng RM47 (RM47/OPH08-250bp) Tập hợp kết phân tích đặc điểm nông sinh học, chất lượng hạt, khả chịu hạn đặc điểm sinh học phân tử dòng chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu thổi khô mô sẹo chịu chiếu xạ kết hợp với thổi khô giống L18 trình bày bảng 3.16 hình 3.11 16 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bảng 3.16 Một số đặc điểm dòng chọn lọc giống L18 Đặc điểm RM48 Nguồn gốc Cây tái sinh từ Chiều cao (cm) Khối lượng 100 (g) Khối lượng 100 hạt (g) RM47 R46 Cây tái sinh từ Cây tái sinh từ L18 Nhập từ mô sẹo chịu mô sẹo chịu mô sẹo chịu Trung Quốc, chịu chiếu xạ + chiếu xạ + thổi khô năm 2004 thổi khô thổi khô 35,46 ± 1,02 41,63 ± 0,54 45,77 ± 0,79 30,62 ± 0,84 108,27 ± 6,98 103,43 ± 4,46 145,12 ± 5,05 116,59 ± 2,84 46,53 ± 2,89 41,11 ± 2,50 56,27 ± 1,32 47,81 ± 0,55 27,72 ± 1,96 38,97 ± 4,25 32,08 ± 2,54 34,47 ± 2,85 38,67 ± 0,88 36,89 ± 0,89 34,67 ± 0,77 36,00 ± 2,67 10089,20 5272,80 7662,38 4725,09 Hàm lượng protein (% KLK) Hàm lượng lipid (% KLK) Chỉ số chịu hạn Chỉ thị RAPD RM48/OPA07-750bp; RM48/OPA08-500bp; đặc trưng RM48/OPB05-900bp; RM48/UPC348-200bp; RM47/OPH08-250bp; 17 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn RM48 RM48 RM47 RM47 R46 R46 L18 L18 Hình 3.11 Hình ảnh hạt dòng chọn lọc hệ thứ Năm 18 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 3.3 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN CYSTATIN TỪ CÂY LẠC 3.3.1 Khuếch đại gen cystatin từ DNA hệ gen lạc Sau tách chiết DNA tổng số, tinh pha nồng độ thích hợp, tiến hành nhân gen cystatin phương pháp PCR từ DNA hệ gen dòng chọn lọc, giống L18, giống L23 Kết nhân gen kiểm tra gel agarose 1% với marker (hình 3.12) L23 RM49 RM48 RM47 RM46 R48 R46 R44 L18 M Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm nhân gen cystatin từ lạc Sản phẩm phản ứng PCR thu hình 3.12 cho thấy, có băng DNA, kích thước khoảng gần 500bp, phù hợp với tính toán lý thuyết kích thước gen cystatin mà Yan đồng tác giả công bố (2004) gen phân lập từ mARN Do đó, hy vọng rằng, kết phản ứng PCR với cặp mồi Cys-AraF/ Cys-AraR nhân từ DNA hệ gen giống lạc L18, L23 dòng chọn lọc có mặt gen cystatin hệ gen lạc Tuy nhiên, để khẳng định xác gen cystatin, thực tách dòng, xác định trình tự so sánh với trình tự gen cystatin công bố Tiến hành tách dòng xác định trình tự gen cystatin dòng R46, RM48 (2 dòng có khả chịu hạn cao nhất), giống gốc L18 (khả chịu hạn kém) giống L23 (có khả chịu hạn tốt), nghiên cứu nhằm mục đích so sánh trình tự gen cystatin dòng giống lạc 19 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 3.3.2 Kết tách dòng xác định trình tự gen cystatin Kết tách dòng khuẩn lạc mang gen cystatin kiểm tra phản ứng clony-PCR Trình tự nucleotide thu từ plasmid mẫu nghiên cứu xử lý phần mềm DNAstar cho thấy, gen cystatin giống lạc L18, L23, dòng R46 RM48 có kích thước 461 nucleotide So sánh trình tự với trình tự nucleotide phân lập từ cDNA gen cystatin lạc ngân hàng gen quốc tế có mã số AY722693 trình tự dùng để thiết kế mồi trình tự mang mã số EU723567, nhận thấy gen mã hoá protein cystatin mà phân lập gồm exon intron Đoạn exon thứ gen gồm 102 nucleotide vị trí đến 102 đoạn exon thứ hai có 195 nucleotide, từ vị trí 267 đến 461; vùng intron có 164 nucleotide, từ vị trí 103 đến 266 3.3.3 Kết so sánh trình tự gen protein cystatin 3.3.3.1 So sánh trình tự nucleotide gen cystatin Kết so sánh trình tự nucleotide gen cystatin giống lạc L18, L23 với hai dòng lạc R46, RM48 tạo công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật có sai khác Trong đó, trình tự nucleotide giống L18 dòng R46 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu nước giống hoàn toàn Dòng RM48 có 19 vị trí nucleotide sai khác so với giống gốc (L18) Nucleotide gen cystatin giống lạc L18 có 14 vị trí sai khác so với giống L23 Gen cystatin đậu xanh tương đối bảo thủ, sai khác gen cystatin giống chịu hạn tốt giống chịu hạn [17] Kết xác định sai khác nucleotide gen cystatin lạc (bảng 3.17) cho thấy sai khác gen cystatin lạc xuất vùng exon vùng intron Trong vùng exon 1, giống L18 có vị trí sai khác với L23 12 vị trí sai khác với dòng RM48 Ở vùng exon 2, giống L18 có vị trí sai khác với giống L23 có vị trí sai khác so với dòng RM48 Ngoài ra, gen cystatin giống L23 RM 48 có 11 vị trí sai khác nằm đoạn intron Như vậy, có nguồn gốc từ giống L18, hai dòng lạc chọn lọc có sai khác trình tự nucleotide gen cystatin, đồng thời biểu sai khác giống có khả chịu hạn (L18) với giống có khả chịu hạn tốt (L23) Kết nghiên cứu chứng tỏ, hiệu việc xử lý tia 20 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn gamma kết hợp với thổi khô làm tăng tần số đột biến gen cystatin so với mô sẹo chịu thổi khô 3.3.2.2 So sánh trình tự nucleotide vùng mã hóa Vì gen cystatin phân lập từ DNA lạc có chứa vùng intron không tồn trình dịch mã, nên tiến hành loại bỏ intron ghép nối đoạn exon, kết thu đoạn mã hóa cystatin dài 297 nucleotide So sánh với trình tự đoạn mã hóa protein gen cystatin thực vật có kích thước tương đương công bố ngân hàng gen quốc tế Kết đánh giá thông qua phân tích độ sai khác, độ tương đồng (bảng 3.18) nhận thấy trình tự đoạn mã hóa gen cystatin lạc có mức tương đồng với trình tự cystatin trồng khác công bố ngân hàng gen quốc tế từ 45,9% đến 100% Các trình tự nucleotide lạc có độ tương đồng từ 98,0% đến 100% Đặc biệt, sai khác nucleotide giống lạc L18 với dòng chọn lọc R46 trình tự nucleotide giống Arachis hypogaea L ngân hàng gen quốc tế (mã số AY722693) Bảng 3.18 Độ tương đồng độ sai khác đoạn mã hoá số trình tự gen cystatin Độ tương đồng 1.Giống lạc L18 Dòng R46 Dòng RM48 Giống lạc L23 Lạc (mã số gen AY722693) Lúa (mã số gen: S49967) Kiwi (mã số gen AY390352) Lúa (mã số gen AB125973) Đậu xanh (mã số gen: AM721476) 10 Đại mạch (mã số gen Y12068) Độ sai khác Thiết lập mối quan hệ di truyền đoạn mã hóa gen cystatin 10 trình tự, sơ đồ mối quan hệ đoạn mã hóa gen cystatin phân thành nhóm chính: Nhóm I phân thành nhóm phụ lớn nhiều nhóm phụ nhỏ, gồm giống lạc loại trồng khác, dòng giống lạc phân bố nhóm Nhóm dòng giống lạc (R46, RM48, L18, L23, AY722693) có quan hệ gần với cystatin đậu xanh (mã 21 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn số AM712476), sau đến cystatin giống lúa- mã số S49967, đại mạch Y12068 lúa-AB125973 Nhóm II có khoảng cách xa với nhóm lại có trình tự đoạn mã hóa gen cystatin phân lập từ kiwi (AY390352), có tỷ lệ sai khác với cystatin lạc 41,5% 3.3.2.3 So sánh trình tự amino acid protein cystatin Trình tự nucleotide đoạn mã hoá gen cystatin giống lạc L23, L18 dòng lạc R46, RM48 dịch mã phần mềm DNAstar tạo phân tử protein gồm 98 amino acid, với mã mở đầu AUG quy định tổng hợp methionine (M) mã kết thúc UAA Kết so sánh trình tự nghiên cứu phần mềm chuyên dụng BioEdit biểu diễn hình 3.16 Hình 3.16 So sánh trình tự amino acid mẫu nghiên cứu So sánh trình tự amino acid dòng lạc nghiên cứu, phát trình tự amino acid chứa vùng bảo thủ nhóm LARFAV QVVAG Vị trí cụ thể hai đoạn bảo thủ là: L22A23R24F25A26V27 Q49V50V51A52G53 Đối chiếu với cách phân loại gen cystatin Margis đtg (2008), Martinez đtg (2008), phát gen cystatin dòng giống lạc nghiên cứu thuộc nhóm phân loại I phytocystatin Kết hợp với kết phân tích gen, kết nghiên cứu cho thấy: vị trí glutamine 34 (Q34) asparagine 35 (N35) cặp amino acid mã hoá ba phía đầu đoạn nối exon cystatin Vị trí tương ứng với vị trí arginine 34 (R34) asparagine 35 (N35) cystatin dòng RM48 Glutamine arginine vị trí 34 amino acid khác đặc điểm cấu tạo gốc R, glutamine amit glutamic acid; khác với arginine amino acid thuộc nhóm amino acid kiềm Sự sai khác có liên quan đến 22 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn cấu trúc phân tử hoạt động cystatin ức chế hoạt động cysteine proteinase, gợi ý cho nghiên cứu cystatin lạc Bên cạnh sai khác amino acid vị trí 34, kết so sánh trình tự amino acid giống lạc L23, L18 dòng R46, RM48 phát thêm vị trí sai khác chuỗi amino acid, nâng tổng số amino acid thay đổi cystatin lạc vị trí Sự sai khác cụ thể thể vị trí số 29, 30, 31, 32, 33, 34 36 dòng giống nghiên cứu (hình 3.16) Nếu lấy cystatin giống L18 so sánh, nhận thấy, giống lạc L23 có vị trí sai khác vị trí amino acid 36, alanine thay glycine Sự sai khác lớn cystatin giống lạc L18 cystatin dòng RM48 (7 vị trí sai khác) Phân tích mối liên quan khác trình tự amino acid dòng, giống phân tích với mức độ chịu hạn khác biệt cho thấy, giống L23 có khả chịu hạn tốt, sai khác với trình tự nhóm chịu hạn vị trí 36, cystatin dòng RM48 có sai khác Ở vị trí 29, 30, 31, 32, 33, 34 vị trí lân cận vùng CYS dòng RM48 có khác biệt với trình tự nghiên cứu, khác biệt góp phần làm tăng độ lực chất ức chế với trung tâm hoạt động enzyme, làm tăng cường khả chống chịu hạn chống chịu với yếu tố bất lợi khác ngoại cảnh Kết phân tích thành phần amino acid cystatin giống lạc L23, L18 dòng lạc chọn lọc R46, RM48 cho thấy có khác biệt lớn amino acid dòng giống lạc Thống kê tổng số amino acid ưa nước, kị nước hay nhóm amino acid thiết yếu cho người không nhận khác biệt dòng giống chọn lọc Lượng amino acid kị nước chiếm tỷ lệ tương đối lớn thành phần cystatin lạc (45,92%) cho phép dự đoán cư trú cystatin liên quan đến tính chịu hạn lạc Rõ ràng protein kị nước phân bố màng tế bào hệ màng, protein ưa nước tan dịch nguyên sinh Do đó, với chức ức chế hoạt động cysteine proteinase cystatin lạc tham gia bảo vệ màng tế bào có hiệu điều kiện thiếu nước cực đoan 23 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Xử lý mô sẹo 10 giống lạc kỹ thuật thổi khô liên tục giờ, giờ, 11 xác định giống lạc L18 có khả chịu nước thấp Ở ngưỡng chọn lọc kết hợp với chiếu xạ tia gamma 2krad làm giảm tỷ lệ tái sinh cây, làm xuất kiểu hình thấp biến đổi màu sắc, hình dạng lạc Đã tái sinh 198 dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu nước xử lý thổi khô tia gamma (2krad) kết hợp với thổi khô liên tục giống lạc L18 hệ thống nuôi cấy in vitro Tuyển chọn dòng lạc RM48, R46 RM47 có khác biệt rõ rệt cao giống gốc L18 khả chịu hạn Dòng RM48 có khoảng cách di truyền so với giống gốc L18 12%, dòng RM47 dòng R46 có khoảng cách di truyền so với giống gốc L18 9,5% Hệ số đa dạng di truyền dòng lạc chọn lọc hệ thứ Năm 11,09% Có thị RAPD đặc trưng phát dòng lạc RM48 RM47: RM48/OPA07-750bp; RM48/OPA08-500bp; RM48/OPB05900bp; RM48/UPC348-200bp; RM47/OPH08-250bp Tách dòng thành công gen cystatin từ DNA hệ gen số dòng lạc chọn lọc giống gốc Gen cystatin lạc có 461 nucleotide, có exon intron, thuộc nhóm I phytocystatin Đoạn mã hóa gen cystain dòng, giống lạc nghiên cứu có tương đồng cao với cystatin đậu xanh (81,3%), thấp với cystatin kiwi (42,9%) Protein gen cystatin mã hóa có 98 amino acid, 45,92% amino acid kị nước, 54,08% amino acid ưa nước 28,57% amino acid thiết yếu so với tổng amino acid protein cystatin Cystatin dòng RM48 có nguồn gốc từ mô sẹo xử lý tia gamma kết hợp với thổi khô có sai khác lớn so với giống gốc L18 amino acid Sự thay amino acid cystatin dòng RM48 vị trí 29 (Glu →Asp), 30 (His→Thr), 31 (Asn→Thr), 32 (Lys →Arg), 33 (Lys →Asn), 34 (Glu →Arg), 36 (Gly →Ala) gợi ý để tiếp tục tìm kiếm mối liên quan cystatin với khả chống chịu hạn lạc ĐỀ NGHỊ Tiếp tục theo dõi, phân tích bồi dưỡng dòng lạc ưu việt R46, RM47, RM48 để giới thiệu khảo nghiệm giống Thiết kế vector mang gen cystatin chuyển vào lạc loại trồng khác để nghiên cứu ảnh hưởng cystatin đến khả chịu hạn số đặc tính khác thực vật 24 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Vũ Thị Thu Thuỷ, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2009), Chọn dòng tế bào chịu hạn lạc (Arachis hypogaea L) phương pháp nuôi cấy in vitro, Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn, 7: 14-19 Vũ Thị Thu Thuỷ, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Tâm (2009), Phân tích trình tự gen cystatin giống lạc L18 (Arachis hypogaea L.), Báo cáo Hội nghị Sinh học toàn quốc: 397-400 Vũ Thị Thu Thuỷ, Đinh Tiến Dũng, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2010), Kết chọn lọc số dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu nước giống lạc L18, Tạp chí KH & CN, Đại học Thái Nguyên, 72(10):122-126 Vũ Thị Thu Thuỷ, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2011), Nghiên cứu đặc điểm trình tự gen cystatin số dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu chiếu xạ xử lý nước (Arachis hypogaea L), Tạp chí Sinh học, 33(1): 86-95 Vũ Thị Thu Thuỷ, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2011), Chọn lọc dòng biến dị chịu nước chiếu xạ lạc, Tạp chí Công nghệ Sinh học, (3): 349-356 Công bố 04 trình tự gen cystatin ngân hàng gen quốc tế (1) Vu,T.T.T., Nguyen,T.V.T., Chu,M.H and Nguyen,T.T (2010), Arachis hypogaea cystatin gene 1, exons 1-2, EMBL, GenBank, Accession FN811133 (2) Vu,T.T.T., Chu,M.H., Nguyen,T.T.V and Nguyen,T.T (2010), Arachis hypogaea cystatin gene for cystein proteinase inhibitor, cultivar L23, EMBL, GenBank, Accession FR691053 (3) Vu,T.T.T., Nguyen,T.T., Chu,M.H and Nguyen,T.T.V (2010), Arachis hypogaea cystatin gene for cystein proteinase inhibitor, cultivar L18, EMBL, GenBank, Accession FR745399 (4) Vu,T.T.T., Chu,M.H., Nguyen,T.T.V and Nguyen,T.T.(2011), Arachis hypogaea cys gene for cystatin, cultivar L18, isolated from R46 line, EMBL, GenBank, Accession HE578279 25 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Công trình hoàn thành Bộ môn Di truyền & Sinh học đại, Khoa Sinh– Kỹ thuật nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Chu Hoàng Mậu PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Họp Trường Đại học Sư phạm- Đại học Thái Nguyên Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2011 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc Gia - Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên - Thư viện Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên 26 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn [...]... năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của các dòng chọn lọc thế hệ thứ Năm bằng cách xác định tỷ lệ cây không héo, cây phục hồi ở các thời điểm 1 đến 5 ngày hạn và xác định chỉ số chịu hạn tương đối Dòng RM48 có chỉ số chịu 14 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn hạn cao nhất (10089,20), sau đó đến dòng R46 và giống lạc L23, thấp nhất là các dòng R44, RM49 và. .. 7 dòng chọn lọc là sự có mặt của gen cystatin trong hệ gen cây lạc Tuy nhiên, để khẳng định chính xác là gen cystatin, chúng tôi thực hiện tách dòng, xác định trình tự và so sánh với trình tự gen cystatin đã công bố Tiến hành tách dòng và xác định trình tự gen cystatin của 2 dòng R46, RM48 (2 dòng có khả năng chịu hạn cao nhất), giống gốc L18 (khả năng chịu hạn kém) và giống L23 (có khả năng chịu hạn. .. vector mang gen cystatin và chuyển vào cây lạc cũng như các loại cây trồng khác để nghiên cứu ảnh hưởng của cystatin đến khả năng chịu hạn và một số đặc tính khác ở thực vật 24 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1 Vũ Thị Thu Thuỷ, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2009), Chọn dòng tế bào chịu hạn ở lạc (Arachis... vitro của giống lạc L18 bằng thổi khô liên tục 9 giờ và chiếu xạ ở liều lượng 2krad kết hợp thổi khô liên tục 9 giờ đã thu được 167 dòng mô, từ đó có 198 dòng lạc được tạo ra 3.1.3 Đặc điểm nông sinh học của các dòng lạc ở thế hệ R0 và RM0 Nghiên cứu quần thể lạc R0 (cây tái sinh từ mô sẹo chịu thổi khô), RM0 (cây tái sinh từ mô sẹo chịu chiếu xạ kết hợp với thổi khô) nhận thấy các dòng lạc chuyển từ... 10 Đại mạch (mã số gen Y12068) Độ sai khác Thiết lập mối quan hệ di truyền của đoạn mã hóa gen cystatin của 10 trình tự, sơ đồ mối quan hệ của các đoạn mã hóa gen cystatin được phân thành 2 nhóm chính: Nhóm I phân thành 3 nhóm phụ lớn và nhiều nhóm phụ nhỏ, gồm các giống lạc và các loại cây trồng khác, trong đó các dòng và giống lạc phân bố trong cùng một nhóm Nhóm các dòng và giống lạc (R46, RM48, L18,... Đặc điểm nông sinh học các dòng lạc chọn lọc ở thế hệ thứ Nhất, thứ Ba So với các cây trồng khác, hạt lạc là rất khó bảo quản và tỷ lệ nảy mầm thấp khi thời gian bảo quản kéo dài Số quả trên cây lạc ở những thế hệ đầu không đủ lớn để thực hiện các nghiên cứu liên quan đến khả năng chịu hạn Vì vậy, toàn bộ hạt của 7 dòng lạc chọn lọc ở quần thể R0, RM0 chúng tôi trồng kế tiếp vào các vụ trồng trong năm... chung và của cây lạc nói riêng là một tính trạng khó kiểm soát ở ngoài đồng ruộng Do vậy, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng lạc chọn lọc thế hệ thứ Năm ở giai đoạn hạt nảy mầm và giai đoạn cây non Gây hạn các dòng lạc chọn lọc thế hệ thứ Năm ở giai đoạn hạt nảy mầm bằng cách xử lý hạt với sorbitol 7%, sau đó xác định khả năng chịu hạn thông qua hoạt độ của α-amylase và hàm lượng... đa dạng di truyền của các dòng lạc chọn lọc ở thế hệ thứ Năm là 11,09% Có 5 chỉ thị RAPD đặc trưng được phát hiện ở 2 dòng lạc RM48 và RM47: RM48/OPA07-750bp; RM48/OPA08-500bp; RM48/OPB05900bp; RM48/UPC348-200bp; RM47/OPH08-250bp 4 Tách dòng thành công gen cystatin từ DNA hệ gen của một số dòng lạc chọn lọc và giống gốc Gen cystatin của cây lạc có 461 nucleotide, có 2 exon và 1 intron, thuộc nhóm I... các dòng lạc chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước và mô sẹo chịu ảnh hưởng chiếu xạ kết hợp với xử lý gây mất nước, chúng tôi chọn được 3 dòng có đặc điểm nổi bật, bao gồm: (1) Dòng R46 có khối lượng 100 quả và hạt cao; (2) Dòng RM47 có hàm lượng protein cao; (3) Dòng RM48 là dòng có hàm lượng lipid cao 3.2.2.2 Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn Khả năng chịu hạn của thực vật nói chung và của... của giống lạc L18, L23, dòng R46 và RM48 đều có kích thước 461 nucleotide So sánh các trình tự này với trình tự nucleotide phân lập từ cDNA của 2 gen cystatin ở cây lạc trên ngân hàng gen quốc tế có mã số AY722693 là trình tự dùng để thiết kế mồi và trình tự mang mã số EU723567, chúng tôi nhận thấy gen mã hoá protein cystatin mà chúng tôi phân lập gồm 2 exon và 1 intron Đoạn exon thứ nhất của gen gồm