MƠN KĨ THUẬT PHÂN TÍCH VSV Đề tài: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH & ĐỊNH TÍNH CLOSTRIDIUM PERFRINGENS Tp HCM, ngày 04 tháng 11 năm 2015 GVHD: THS TRẦN QUỐC HUY - SVTH: NHÓM NHÓM STT HỌ VÀ TÊN MSSV TRẦN THỊ HẰNG 2008120153 TRẦN HOÀI TÂM 2008120179 ĐÀM THỊ ĐÀO 2008120156 PHẠM THỊ DIỆU 2008120176 MẠC THỊ MỸ NỮ 2008120127 NGUYỄN THỊ VIỆT PHƯƠNG 2008120142 NGUYỄN THỪA NGỌC CHÂU 2008120150 NGUYỄN THỊ TRƯỜNG AN 2008120163 NỘI DUNG II IIII Tổng quan PP truyền thồng (đếm khuẩn lạc) PP Không truyền thống IIIIII IIVV (PCR, RT – PCR,…) Tài liệu tham khảo I TỔNG QUAN - Gây bệnh qua thực phẩm: ăn trực tiếp bào tử VK độc tố nguồn gốc từ VK - Độc tố đa dạng: sinh bào tử, ko sinh bào tử, ko di động, Vi khuẩn hiếu khí, kị khí tùy ý,… nội/ ngoại độc tố VD: Clostridium botulinum  độc tố botulin (thịt) VD: Vibrio cholerae độc tố cholera (cholera toxin) 4 I TỔNG QUAN (TT) Gram (+), hình que, kị khí, sinh bào tử, đa số di động - Thủy Hiệngiải diệnsaccharide đất protein  nhận lượng - Gây bệnh cho người – động vật, hư hỏng thực phẩm - Thủy giải saccharide: Lênmàu menđen, polysaccharide  acid Khử sulphite sulphur  mùi khó chịu - acetic, butyric, rượu Điển hình: C botulinum, C perfringens, C novyi, C septicum, C Sordellii,… Thủy giải protein & chuyển hóa Ko hồn tồn acid amin 1.1 Clostridium  mùi khó chịu 1.1.1 Sơ lược Clostridium perfringens C perfringens Có: Đất, nước, chất thải, đường tiêu hóa Gây nhiễm độc máu, viêm ruột tiêu chảy, ngộ độc cho người o PT: 12 -50 C; PT o ; chậm: 20 C PT cực nhanh: 43 – o 47 C pH – 8; thời Kị khí ko B.buộc; gian hệ: 8-10 p; sống MT khắc nghiệt kiểu k.nguyên A-F (A ngộ độc) C perfingens Hệ thống phân loại Hình thái sinh lý - Khuẩn lạc C perfringes: Giới: Bacteria + Tròn, nhẵn bóng; Ngành: Firmicutes - Trực khuẩn thẳng, hai đầu trịn, khíđộc tuyệttốđối + Bao vịng bên dung huyết hồn tồnkị(do theta) vịng Lớp: Clostridia - Bắt màu Gram +; có vỏ kết nang; Bộ: Clostridiales bên ngồi khơng dung huyết hồn tồn (do độc tố alpha)  Hiện tượng dung - ko lông roi, ko di động; Họ: Clostridiaceae huyết beta môi trường ni cấy có bổ sung máu động vật - Ssản: phân đơi tb Chi: Clostridium Lồi: C perfringens C perfringens C perfringens C perfringens Dung huyết Beta Các type độc tố khả gây bệnh C perfringens Phương pháp truyền thốngphương pháp đếm khuẩn lạc Nguyên tắc Mật độ vi khuẩn Clostridium xác định cách sử dụng môi trường chứa ferri o ammonium citrate disodium sulphite, ủ 37 C 1-2 ngày Trên môi trường khuẩn lạc Clostridium có màu đen phản ứng ion sulphide(S2-) ion sắt (Fe2+) có mơi trường • • Các giai đọan phản ứng PCR Phản ứng PCR chuỗi nhiều chu kì (cycle) nối tiếp MỖI CHU KÌ GỒM BƯỚC 1-Biến tính 2-Lai 3-Kéo dài Các giai đoạn phản ứng PCR • • Quy trình phân tích Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn Sử dụng pppháp sốc nhiệt để tách chiết DNA C perfringens phân lập theo ppháp giám định đặc tính sinh vật hóa học • Các bước tách chiết DNA:  Bước 1: Hút 200 µl dd mẫu (canh khuẩn môi trường Fluid Thioglycolate) cho vào ống o eppendort Ly tâm 5000 vòng/phút phút C Hút bỏ dịch nổi, giữ lại cặn có chứa xác vi khuẩn • Quy trình phân tích Bước 2: Thêm 200 µl nước cất vào ống chứa cặn, tiến hành đồng mẫu Đun cách o o thủy 100 C 10 phút Làm lạnh nhanh ngăn đông tủ lạnh (4 -8 C) thời gian phút o Bước 3: Ly tâm C, tốc độ 4000 vòng/phút thời gian phút Thu dịch có chứa o DNA dùng làm DNA mẫu cho phản ứng PCR Sau DNA bảo quản -20 C • Quy trình phân tích Nhân đoạn gene 16S RNA vi khuẩn C perfringens kỹ thuật PCR Sử dụng DNA tách từ chủng vi khuẩn C perfringens phân lập để làm DNA khuôn, cặp mồi đặc hiệu (16S – F) (16S – R) với kích thước sản phẩm 658 bp chu trình nhiệt cài đặt để nhân gene 16S RNA chủng C perfringens phân lập thơng qua phản ứng PCR • Quy trình phân tích Chu trình nhiệt phản ứng PCR Quy trình phân tích Chuẩn bị thạch Đổ gel Điện di Sản phẩm phản ứng PCR phát kỹ thuật điện di gel agarose nồng độ 0,8 - 2% • Đọc kết Dựa vào phổ điện di sản phẩm PCR máy đọc gel kết nối với máy tính tia tử ngoại (UV) tiến hành đọc kết quả: Nếu phổ điện di xuất băng có kích thước khoảng 658 bp, trùng với kích thước sản phẩm cặp mồi đoạn gene 16S RNA nhà thiết kế mồi đưa  phản ứng PCR nhân đặc hiệu đoạn gene 16S RNA có kích thước mong muốn • • • • • Đọc kết Kết giám định lồi vi khuẩn C perfringenes Chú thích: M: Marker (+): Đối chứng dương (-): Đối chứng âm 1, 2, 3, 6, 7, 12, 13, 14: chủng vi khuẩn C perfringens phân lập • Ưu nhựơc điểm phương pháp Ưu điểm + Thời gian thực nhanh, độ xác cao +Thực đơn giản tốn + Yêu cầu độ tinh mẫu khơng cần cao + Phương pháp tạo dịng invitro, không cần diện tế bào + PCR khuếch đại nhanh nhiều đoạn DNA mà khơng qua tạo dịng + Tách chủng vi khuẩn khiết với chi phí thấp • Ưu nhựơc điểm phương pháp Nhựơc điểm +Trong thực nghiệm kích thước trính tự cần khuếch đại giới hạn +Trong thực nghiệm kích thước trính tự cần khuếch đại giới hạn +Các sai sót gây Taq polymerase Phản ứng Multiplex PCR (PCR khuếch đại nhiều giai đoạn) - Dạng cải tiến phản ứng PCR thông thường, - >2 locus nhân lên phản ứng - Sử dụng cặp mồi chuyên biệt cho gene khác  cần phản ứng xác định đồng thời nhiều tác nhân vi sinh vật dựa nguyên lý sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA đích chúng Phản ứng Multiplex PCR (PCR khuếch đại nhiều giai đoạn) - Để thiết kế Multiplex PCR  phải thiết kế mồi có nhiệt độ bắt cặp lên DNA đích, mồi không bắt cặp với độ nhạy phát tác nhân đích khơng bị giảm mà tương đương độ nhạy PCR đơn mồi - Phương pháp áp dụng thành cơng nhiều lĩnh vực thí nghiệm DNA: phân tích đoạn, đột biến, đa hình phương pháp định lượng kỹ thuật PCR chép ngược (RT - PCR) V TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước Trần Quốc Huy Vi sinh vật học thực phẩm Nxb Trường Đại học Công Nghiệp Thực Phẩm TP HCM, 2013 Lê Thanh Mai cộng Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 2009 Trần Linh Thước (2004), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm, Nhà xuất Giáo dục, Tp Hồ Chí Minh Đào Trọng Đạt, Trần Thị Hạnh, Đặng Phương Kiệt (1998), Phân lập vi khuẩn C perfringens số hộ gia đình tỉnh Vĩnh Phú, Tạp chí thơng tin Y dược số 10, Bộ Y tế Lê Lập, Nguyễn Đức Tân (2006), Phân lập xác định type độc tố (toxinotype) vi khuẩn Clostridium perfringens động vật nhai lại kỹ thuật Multiplex PCR, Tạp chí nơng nghiệp phát triển nơng thơn 2007, số V TÀI LIỆU THAM KHẢO Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Đỗ Ngọc Thúy Nguyễn Bá Hiên (2009), Một số đặc tính sinh học vi khuẩn Clostridium perfringens phân lập từ bò lợn mắc hội chứng tiêu chảy Hà Nội vùng phụ cận, Khoa học kỹ thuật thú y, tập XVI, số Tài liệu nước Ilenia Drigo, Fabrizio Agnoletti, Cosetta Bacchin, Francesca Bettini, Monia Cocchi, Tiziana Ferro, Barbara Marcon, Luca Bano (2008), Toxin genotyping of Clostridium perfringens field strains isolated from healthy and diseased chickens, Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Treviso, Italy Jesus G.M Silvia G.A., Ana I.A., Francisco R.V (1999), Use of 16S -23S ribosomal genes spacer region in studies of prokaryotic diversity, Journal Microbiol Methods, 36: 55 - 64 Môn CNSH Thực phẩm GVHD: THS ĐỖ THỊ HIỀN ... Ssản: phân đôi tb Chi: Clostridium Loài: C perfringens C perfringens C perfringens C perfringens Dung huyết Beta Các type độc tố khả gây bệnh C perfringens Phương pháp truyền thốngphương pháp. .. tính 2-Lai 3-Kéo dài Các giai đoạn phản ứng PCR • • Quy trình phân tích Phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn Sử dụng pppháp sốc nhiệt để tách chiết DNA C perfringens phân lập theo ppháp giám định. .. Phẩm TP HCM, 2013 Lê Thanh Mai cộng Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 2009 Trần Linh Thước (2004), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm