PHẦN I CÔNG NGHỆ NUÔI TRỒNG NẤM I ĐỊA ĐIỂM THỰC TẬP:Trung tâm nấm Văn Giang Hưng Yên Người hướng dẫn - Trần Văn Hùng - Nguyễn Duy Hạnh Thời gian: 01/06/2015 - 13/06/2015 Nội dung công việc - Ủ nguyên liệu làm nấm rơm, vào khn, đóng mơ cấy giống nấm rơm - Giũ rơm lên men vào giàn nấm mỡ, xử lý đất phủ giàn nấm mỡ -Đóng bịch làm cổ nút nấm linh chi - Đóng bịch làm cổ nút nấm mộc nhĩ -Ủ phế thải làm nấm sị II QUY TRÌNH NI TRỒNG NẤM RƠM Giới thiệu nấm rơm Nấm rơm hay nấm mũ rơm loại nấm họ nấm lớn sinh trưởng phát triển từ loại rơm rạ Nấm gồm nhiều lồi khác nhau, có đặc điểm hình dạng khác có màu xám trắng, xám, xám đen… kích thước đường kính nấm lớn, nhỏ tùy thuộc loại Là loại nấm giàu dinh dưỡng Nấm rơm chứa nhiều vitamin A, B1, B2, PP, D, E, C chứa loại axit amin, nấm rơm trị nhiều bệnh loại quen thuộc, làng quê thường sử dụng làm thực phẩm Sơ đồ quy trình Rơm xử lý nước vơi Ủ đống Đảo rơm, chỉnh độ ẩm, ủ Đóng mơ, vào khn cấy giống Ươm sợi Chăm sóc, thu hái Công việc tiến hành: Ủ nguyên liệu làm nấm rơm, vào khn, đóng mơ cấy giống nấm rơm a Ủ nguyên liệu làm nấm rơm *Chuẩn bị : + tạ rơm khô + Cào, kệ, cọc tre, vôi bột, nước * Tiến hành: - Bước : Lấy tạ rơm từ kho rũ tơi sân Giũ rơm trải sân - Bước : Dùng vòi phun nước phun cho rơm làm ướt đều,không để khô - Bước : Xếp kệ ( kệ vuông nhựa ) xếp rơm làm ướt lên kệ đặt cọc tre thơng khí vào kệ Xếp rơm lên kệ - Bước : Cứ xếp lớp rơm lên kệ ta lại rắc lớp vôi bột,làm hết tạ rơm vơi bột tiếp xúc với nước sinh nhiệt làm rơm chín - Bước 5: Quây nilon xung quanh đống ủ dùng dây buộc cố định Quây nilon xung quanh đống ủ buộc dây * Chú ý: - Lúc đưa rơm lên kệ phải phun thêm nước vào đống ủ để rơm ngấm đủ nước rắc lớp vôi bột - Phải ấn chặt rơm xếp lên đống ủ Rơm phải ấn chặt xếp lên đống ủ b Đảo lần 1, chỉnh ấm đống nguyên liệu nấm rơm * Chuẩn bị: - Dụng cụ: cào, cuốc - Nguyên liệu: đống rơm ủ ngày, nước * Tiến hành: - Bước 1: Tháo dây nilon xung quanh đống ủ - Bước 2: Cào đống ủ xung quanh cho hết nóng chia đống ủ làm phần: + Phần 1: Toàn phần bề đống ủ + Phần 2: Toàn phần bên đống ủ Cào rơm cho hết nóng - Bước 3: Xếp rơm lên kệ (lần không ấn chặt rơm), toàn phần cho vào đống ủ, phần cho bên đống ủ - Bước 4: Quây nilon lại buộc dây cho cố định lại * Lưu ý: - Đống ủ lúc giũ phải chia làm phần phần đống ủ chín đủ nhiệt, phàn ngồi phần đống ủ chưa chín Vì phải đảo trộn lần rơm chín - Lúc cho rơm lên kệ phải đun thêm nước vào phần phần đống ủ rơm đủ độ ẩm c Đảo lần 2, vào khn, đóng mơ cấy giống nấm rơm * Chuẩn bị: - Dụng cụ: cào, cuốc, xe đẩy, rổ, khuôn đóng mơ có hình thang cụt - Ngun liệu: đống rơm ủ ngày, giống nấm rơm cấp * Tiến hành: - Bước 1: Dỡ đống rơm ủ chiều 4/6, cho hết nóng, sau vận chuyển vào lán - Bước 2: Khn để đóng mơ nấm rơm, khn làm giá gỗ có hình thang cụt có kích thước: + Chiều rộng đáy dưới: 0,4m + Chiều rộng đáy trên: 0,3m + Chiều dài đáy trên: 1,1m + Chiều dài đáy dưới: 1,2m + Chiều cao khuôn: 0,4m - Bước 3: Rải lớp rơm vào khuôn dày 10-12cm lấy giống bẻ rời rắc đường giống xung quanh cách mép khuôn 3-4cm Tiếp tục làm cho đủ lượt giống lớp rơm Lớp giống rải bề mặt dùng lớp rơm dày 3-4cm đậy lên ép nhẹ cho phẳng Nhấc khuôn tiếp tục làm mô khác hết rơm, mô cách 25- 30cm Các mơ nấm rơm đóng III QUY TRÌNH NI TRỒNG NẤM MỠ 1.Giới thiệu nấm mỡ Nấm mỡ có nguồn gốc từ nước có khí hậu ôn đới Là loại nấm phổ biến , trồng 70 quốc gia giới Nấm mỡ loại nấm ăn người tiêu dùng thích khơng hương vị thơm ngon đặc biệt mà cịn giá trị dinh dưỡng cao khả chống bệnh tật phong phú Là thực phẩm lý tưởng dành cho người bị bệnh tim mạch, đái đường, ung thư bệnh lý tuyến tụy Sơ đồ quy trình Rơm, rạ xử lý vơi ngày Ủ đống, bổ sung đạm ngày Đảo lần ngày Đảo lần 2, bổ sung CaCO3 ngày Đảo lần 3, bổ sung lân ngày Đảo lần Lên men phụ 7-8 ngày Vào giàn, vào luống t˚ giảm 28˚ Cấy giống 12-15 ngày Phủ đất 12-15 ngày Chăm sóc, thu hái Chế biến Cơng việc tiến hành: Giũ rơm lên men vào giàn nấm mỡ đập đất phủ giàn nấm mỡ a Giũ rơm lên men vào giàn nấm mỡ *Chuẩn bị: - Dụng cụ: cào, cuốc, khay đựng - Nguyên liệu: rơm lên men 20 ngày đạt tiêu chuẩn * Tiến hành: - Sau 14-16 ngày ( giai đoạn lên men ) ta tiến hành rũ tơi rơm cho vào giàn cấy giống nấm mỡ.Trước giũ tơi rơm cần kiểm tra xem rơm hay compost đạt Yêu cầu : Rơm có màu hạt dẻ,cịn ngun hình sợi rơm ,có mùi dễ chịu khơng có mùi khai amoniac Nắm chặt nguyên liệu dính vào cục đất sét gỡ không bị tơi nát vụn đạt yêu cầu Giũ tơi rơm - Sau ta giũ tơi rơm cho hết nóng đưa vào giàn giống nấm mỡ Vận chuyển đến giàn nấm mỡ b Đập đất phủ giàn nấm mỡ * Chuẩn bị: - Dụng cụ: cuốc, cào, sàng, khay đựng, rổ - Nguyên liệu: đất thịt * Tiến hành: Dùng cuốc, xẻng đập nhỏ đất, lấy sàng có nan thưa lắc nhẹ loại bỏ đất bột, vụn Phần lại hạt ngơ trở lên (kích thươc 0.3 - 1.5m) được,đem phơi khô cho vào giàn nấm mỡ 10 protein, dịch hữu số xếp vào khay để cố định cơ.v.v - Ở nhiệt độ 650C, CTAB có tác dụng làm rách thêm màng tế bào màng nhân để giải phóng tối đa lượng axít nucleic dung dịch làm biến tính số protein, đặc biệt enzym thuỷ phân axít Các ống mẫu 1,5ml xếp theo thứ tự + CTAB: chất tẩy rửa cation làm DNA dễ hòa tan hơn, biến tính protein hình thành phức hợp với polisaccharide, protein,… NaCl có lồng độ cao, tạo phức hợp CTAB - DNA trạng thái hòa tan, CTAB - polisaccharide kết tủa CTAB tăng hiệu hoạt động 650C + EDTA: có tác dụng giữ ion kim loại, ức chế nucleic hoạt động enzyme + Tris: bị ảnh hưởng lớn độ axit kiềm 32 dung dịch sử dụng tách chiết axit làm cho axit nucleic bị gãy, chẳng hạn HCl làm cho DNA bị đứt vị trí purin nồng độ kiềm cao DNA bị tách thành sợi đơn Do mẫu có nhiều axit hữu không bào khe hở tế bào, axit làm thay đổi pH dung dịch gây tổn hại đến phân tử DNA Để loại trừ ảnh hưởng axit kiềm người ta sử dụng Tris để điều chỉnh pH dung dịch bị nhiễm axit kiềm + Proteinase K: enzyme phân giải protein, giúp loại bỏ protein gắn kết với DNA phá hủy enzyme tế bào DNA tách nguyên vẹn + SDS: chất tẩy, có nhiệm vụ loại bỏ phân tử lipid màng, làm đứt gãy màng tế bào màng nhân thành mảnh nhỏ cho phép DNA phóng thích bên ngồi * Giai đoạn 2: Loại bỏ thành phần không - Li tâm xong mong muốn mẫu dung dịch chia thành lớp: lớp thứ - Bước 3: Bổ sung 800µl hỗn hợp chloroform: phần dịch isoamy alcolhol (24 : 1) tiến hành ly tâm 11000v/p có 15 phút máy ly tâm lạnh Khi xếp mẫu vào chứa DNA, lớp thứ hai máy cần xếp đối xứ lớp protein, lớp có chứa chloroform tất thành 33 phần cần loại bỏ khác(polysaccharides , protein,…) Máy ly tâm + Ở chloroform làm biến tính, tan protein pha hữu khơng hịa tan nucleic axit (DNA, RNA) nằm pha nước Ngồi cịn loại bỏ phần tử lipit cải thiện phân tách pha nước pha hữu + Isoamyl alcohol thêm vào có tác dụng loại bỏ bọt ngăn cản tạo bọt dung dịch trộn ổn định pha nước phenol chloroform sau li tâm + Thao tác loại bỏ protein, lipid chất khác tan dung dịch DNA chiết suất bắng phenol - chloroform sau chloroform chloroform - isoamyl alcohol (24:1) + Sau li tâm pha nước chứa DNA nằm phía protein kết tủa thành lớp nằm pha nước pha hữu 34 * Giai đoạn 3: Tủa thu nhận DNA - Bước 4: Dùng pipet hút lấy dịch phần phía cho vào ống đựng mẫu - Ta tiến hành - Bước 5: Bổ sung Isopropanol lắc nhẹ để phơi khô DNA để tủ lạnh sau tiến hành ly tâm 12000v/p tránh trường hợp khoảng 15 phút Việc cho Isopropanol tuyệt đối lạnh mẫu DNA chứa giúp loại bỏ phân tử nước dung môi ethanol ảnh hưởng DNA khó tan so với nước đến DNA tổng số, dẫn đến ảnh hưởng đến kết thao tác sau… - Bước 6: Đổ hết dung dịch lỏng ngoài, úp ngược ống để DNA khô khoảng 30 phút, ta thu DNA đáy ống - Bước 7: Bổ sung TE vào mẫu DNA Dùng tay búng nhẹ vào đáy ống chứa DNA đểhòa tan DNA bảo quản IV ĐIỆN DI DNA Nguyên tắc phương pháp dựa vào tính phân cực phân tử khả di chuyển hướng xác định chịu tác động điện trường Trong dung dịch kiềm trung tính, đại phân tử nucleic acid tích điện âm đồng khắp bề mặt nên điện trường, chúng di chuyển cực dương điện trường Agarose loại polyme tách từ rong biển, cấu tạo monome 35 D-galactose 3,6-anhydro L-galactose, nên sau đun sôi tạo thành mạng lưới cho phép phân tử khác qua tuỳ theo kích thước trọng lượng phân tử Các đoạn DNA kích thước khác chạy với tốc độ khác gel: đoạn ngắn chạy xa, đoạn dài chạy chậm ADN tổng số có kích thước lớn nên chạy chậm chiếm vị trí lớn gel Dụng cụ, hóa chất - Dụng cụ: máy ly tâm, máy chụp hình ảnh sau điện di, pipet có đầu cơn, tủ hút, lị vi sóng, bình tam giác, ống đong 200ml - Hóa chất: TAE 50X, agarose, EtBr, dye 6X, parafilm - Mẫu: DNA tách chiết Cách làm * Điện di DNA gel agarose 1% - Tiến hành pha gel agarose 1%: + Từ dung dịch TAE 50X ta pha thành dung dịch TAE 1X + Cân 0,4g agarose cho vào bình chứa 40ml TAE 1X sau cho vào lị vi sóng đun sơi để hịa tan 36 hết chất Sau đem bổ sung EtBr lắc Thao tác thực tủ hút để tránh khỏi chất độc hại từ EtBr dung dịch nguội nhanh Khi nguội đến 500C đổ dung dịch agarose vào khn điện di có cài sẵn lược Sau khoảng 30 phút gỡ lược đặt gel vào bể điện di Đổ thêm TAE 1X vào bể dung dịch chưa ngập gel - Tra mẫu DNA: + Dùng pipet lấy dye 6X nhỏ thành giọt 0,2 µl tạo thành hàng giấy parafilm + Dùng pipet lấy mẫu DNA khoảng 0,5µl nhỏ gian hút vào giọt dye 6X để trộn Sau lại vào điện di thay đổi phụ pipet thả vào giếng lược vừa tạo Làm tương thuộc vào độ lớn tự với mẫu DNA khác với giọt dye lại Lưu ý - Thời độ nhỏ DNA vào giếng không đặt sâu, ấn pipet từ agarose gel từ Mỗi mẫu phải thay đầu côn pipet cường độ dịng điện khơng mẫu bị lẫn với DNA, nồng Sau chạy điện di - Sau tra mẫu xong bật máy điện di chờ xong gel 15 phút lấy nhẹ khỏi khuôn gel ngâm vào dung dịch EtBr có tác dụng đánh dấu phân tử DNA, hóa chất có khả gắn xen vào base nucleic acid 37 phát huỳnh quang tác dụng tia tử ngoại Máy điện di - Sau 15 phút ta tắt máy điện di thấy DNA chạy thành hàng phía cực dương - Nhấc khuôn agarose đặt vào hệ thống chụp ảnh gel quan sát hình máy tính 38 Máy chụp hình ảnh sau điện di - Kết cho thấy: mẫu nhiều DNA phát sáng nhiều cịn mẫu DNA phát sáng ít, mờ, mẫu khơng có DNA khơng có tượng Những mẫu DNA có phần dải sáng đường thẳng tốt: DNA ngun vẹn khơng bị đứt gãy cịn cong DNA bị đứt gãy Hình ảnh chụp máy tính V PHƯƠNG PHÁP PCR – RAPD PCR kỹ thuật xử lý in vitro chuỗi mã hóa di truyền DNA cách phát triển primer cách đồng loạt dây đơn DNA Tồn tiến trình hoàn thiện biến chất DNA cần thiết, tác động primer đầu dây đơn DNA này, phát triển primer phản ứng DNA polymerase - Với nhiệt độ 39 DNA tạo sợi đơn DNA, hoạt động dây cho trình tổng hợp DNA Dụng cụ, hóa chất - Dụng cụ: pipet có đầu cơn, ống PCR, máy PCR - Hóa chất: buffer, primer, Taq polymerase - Mẫu: mẫu DNA tách chiết Cách làm - Đây giai đoạn quan trọng nhất, giai đoạn này, kiện lai DNA – DNA xảy Nếu nhiệt độ cao, không lai DNA a.Kỹ thuật PCR - Phương pháp PCR cho phép khuếch đại tạo số lượng lớn gen PCR chuỗi phản ứng liên tục bao gồm nhiều chu kỳ nhau, chu kỳ gồm đoạn: + Giai đoạn biến tính: nhiệt độ 90 - 950C (cao Nếu nhiệt độ biến tính DNA khn), làm đứt nhiệt độ thấp, liên kết hydro phân tử DNA, hai mạch phân tử việc lai DNA bị DNA tách rời Đoạn khn DNA có đoạn dài nhiều lỗi Chính gồm nhiều nucleotide giống nhau, tỉ lệ G - C để thiết lập nhiệt cao, có nhiệt độ biến tính (Tm ) cao Do độ cho chu kỳ PCR, cần đặc điểm DNA khuôn để lựa chọn người ta xác định nhiệt độ biến tính phù hợp nhiệt độ nóng chảy Tm với nhóm priner sau: Tm = x (G + C) + x (A + T) 0C + Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ 55 - 650C để mồi bắt cặp với mạch đơn DNA khuôn đầu 3’ theo nguyên lý bổ sung + Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ 70 - 720C thích hợp với điều kiện enzyme DNA polymerase Enzyme xúc tác hoạt động tổng hợp gắn thêm 40 nucleotid vào cuối đoạn mồi, mồi dựa sỏ bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên lý bổ sung tạo nên mạch DNA Giai đoạn gọi giai đoạn polymer hóa Mỗi phản ứng PCA gồm nhiều chu kỳ liên tục sản phẩm tạo chu kỳ trước làm khuôn chu kỳ tiếp theo, nên số lượng tạo thành tăng theo cấp số nhân - Các thành phần tham gia phản ứng PCR: - Hai đoạn mồi đặc hiệu có chiều dài từ 15 – 30 nucleotit + Primer xuôi: Bắt cặp với mạch khuôn DNA kéo dài theo chiều phiên mã + Primer ngược: Bắt cặp với mạch mã DNA sẻ kéo dài ngược theo chiều phiên mã + DNA khuôn: lấy từ mẫu tách chiết DNA Được sử dụng làm khuôn để mồi PCR gắn vào vị trí bổ sung với nó, sau với tham gia thành phần cần thiết, phản ứng tổng hợp diễn tạo nên đoạn DNA giống hệt đoạn DNA nằm vị trí gắn mồi Từ chu kỳ thứ trở đi, ngồi DNA khn ban đầu, đoạn DNA vừa tổng hợp sử dụng làm khuôn cho chu kỳ tổng hợp Lượng DNA khuôn nhỏ khoảng 10 ng 100 ng Do lượng DNA cần thiết nhỏ vậy, nên chuẩn bị DNA khuôn phải ý tránh bị lẫn DNA từ nguồn khác cần phải có DNA có độ nguyên vẹn cao + Mồi PCR: đoạn aligo nucleotide ngắn (6 - 70 nucleotide), mồi ngẫu nhiên ( mồi RAPD ) có 41 chiều dài khoảng 10 nucleotit đa số mồi PCR có chiều dài khoagr 20 - 30 nucleotit + Nồng độ mồi phụ thuộc vào thí nghiệm mục đích nghiên cứu Nếu nồng độ mồi thấp không đủ cho phản ứng nồng độ mồi cao dẫn tới sai lệch kết + Thời gian gắn mồi vào khuôn thường dao động khoảng 30 – 60 giây Nếu thời gian gắn mồi lâu gây sai lệch kết phản ứng gắn mồi không đặc hiệu, kéo dài thời gian phản ứng làm suy giảm hoạt động enzyme Taq + dNTP gồm loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP Nồng độ dNTP thường sử dụng cho phản ứng 200µM Nếu nồng độ dNTP q cao liên kết với Mg2+, ion cần cho hoạt động enzyme tổng hợp dNTP nhạy cảm với thay đổi nhiệt độ, sau 35 chu kỳ PCR dNTP bị suy giảm , mơi trường axit chuyển hóa thành dNDP dNMP Do mà dNTP chất không bền, đặc biệt sử dụng cho PCR + Enzyme tổng hợp DNA phần quan trọng phản ứng PCR Trong điều kiện thích hợp với thành phần cần thiết khác, enzyme hoạt động tổng hợp nên DNA Nồng độ sử dụng enzyme phụ thuộc vào mồi loại enzyme thuộc tính Nếu q nhiều enzyme làm tăng nồng độ glycerol dung dịch phản ứng, dẫn tới 42 q trình tổng hợp khơng đồng cacsvij trí tạo hình ảnh điện di khơng rõ nét Ngược lại, q thiếu enzyme kết nhận sản phẩm tổng hợp không đầy đủ + Dung dịch đệm PCR: dung dịch đệm chung PCR bao gồm thành phần KCl, MgCl Tris Muối KCl góp phần làm tăng hiệu phản ứng, thông thường mồi cho sản phẩm PCR với kích thước lớn hoạt động tốt howntrong mơi trường có nồng độ muối thấp ngược lại cặp mồi cho sản phẩm PCR ngắn hoạt động tốt mơi trường có nồng độ muois cao - Cách tiến hành phương pháp RAPD: + Pha loãng dung dịch chứa DNA xuống 20 lần + Dùng ống đựng pha thành phần phản ứng (µl): H2O 8,4 Buffer 1,5 45 dNTP 0,6 18 Primer 1,5 45 Taq 1,5 45 x 30 252 + Hút 2µl DNA khn pha lỗng + 13µl thành phần cho vào ống PCR Mỗi làm phải thay đầu côn + Xếp ống PCR vào máy PCR, khởi động 43 chương trình chạy khoảng Máy PCR b.Chạy điện di sản phẩm PCR - Kiểm tra kết chạy điện di gel agarose - Các bước pha gel agarose tương tự phương pháp tách chiết DNA ( dùng 0,8g agarose 1% 80ml TAE 1X) - Kết cho thấy: có khác mặt di truyền 44 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR PHỤ LỤC Thời gian Ngày Thời gian 1/6 Chiều 2/6 Sáng Công việc - Ủ đống nguyên liệu làm nấm rơm - Giũ tơi đống rơm lên men đưa vào 45 giàn nấm mỡ Chiều 3/6 Sáng+ chiều 4/6 Sáng Chiều 5/6 - Đóng bịch làm cổ nút nấm linh chi - Giũ đống rơm lên men đưa vào giàn nám mỡ - Giũ đống rơm lên men đưa vào giàn nấm mỡ - Đảo lần đống rơm ủ nấm rơm làm ngày 1/6 Sáng + chiều - Ủ phế thải để làm nấm cao cấp 6-7/6 - Nghỉ Sáng - Vào khn, đóng mơ cấy giống nấm rơm Chiều - Gũi phơi tơi đống bơng ủ ngày 5/6 Sáng - Đóng bịch làm cổ nút nấm mộc nhĩ Chiều - Đập đất phủ giàn nấm mỡ 10/6 Sáng+ chiều - Đập đất phủ giàn nấm mỡ 11/6 Sáng - Đập đất phủ giàn nấm mỡ Chiều - Nghỉ 8/6 9/6 12/6 Sáng +chiều 24/6 - Vào mô cấy giống nấm rơm - Kết thúc đợt thực tập nộp báo cáo 13/6 22/6 - Vận chuyển rơm vào lán cấy giống cho trung tâm nấm Sáng - Pha dung dịch mẹ (Stock) Chiều - Nghỉ Sáng - Pha môi trường nhân nhanh lan trần Chiều - Nghỉ 46 ... 30cm Các mơ nấm rơm đóng III QUY TRÌNH NI TRỒNG NẤM MỠ 1.Giới thiệu nấm mỡ Nấm mỡ có nguồn gốc từ nước có khí hậu ơn đới Là loại nấm phổ biến , trồng 70 quốc gia giới Nấm mỡ loại nấm ăn người... day buộc nút lại * Lưu ý: - Bịch nấm mộc nhĩ không chặt nấm linh chi VI QUY TRÌNH NI TRỒNG NẤM SỊ Giới thiệu nấm sò Nấm sò hay gọi nấm bào ngư loại thức ăn ngon, thực phẩm có giá trị dinh dưỡng... to không nhỏ, to che chỗ cho nấm phát triển lên, nhỏ bị lọt xuống che mát giống làm cho nấm khó phát triển IV QUY TRÌNH NI TRỒNG NẤM LINH CHI Giới thiệu nấm linh chi Nấm linh chi dược liệu mà người