TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG  PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN CLOSTRIDIA SINH DUNG MÔI ACETONE – BUTANOL – ETHANOL Giảng viên hướng dẫn: TS HOÀNG QUỐC KHÁNH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2009 TÓM TẮT PHẠM THỊ PHƯƠNG, Đại học Tôn Đức Thắng, Tp Hồ Chí Minh Tháng12/2009 “PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH VI KHUẨN CLOSTRIDIA SINH DUNG MÔI ACETONE – BUTANOL – ETHANOL” Giảng viên hướng dẫn: TS HOÀNG QUỐC KHÁNH Clostridia nhiều nhà khoa học quan tâm chúng có khả lên men sinh dung môi acetone, butanol, ethanol có tiềm lớn sản xuất nhiên liệu sinh học Nghiên cứu liên quan đến việc phân lập clostridia từ 20 mẫu đất, nước thải phân bò thu thập từ nhiều địa điểm khác Nghiên cứu tiến hành từ tháng đến tháng 12/2009 phòng Vi sinh Ứng dụng thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới Mẫu xử lý sơ trước phân lập sau tăng sinh môi trường T6 có bổ sung natri thioglycolate parafin, ủ 37oC vòng ngày Tiếp theo, clostridia phân lập môi trường RCM – agar điều kiện kị khí Việc chọn lọc vi khuẩn kị khí dựa thử nghiệm catalase, kết thu 21 chủng vi khuẩn kị khí Vi khuẩn sinh dung môi tuyển chọn dựa vào khả sinh acetone Qua thử nghiệm này, 21 chủng vi khuẩn kị khí có khả sinh acetone chứng tỏ vi khuẩn có khả sinh dung môi Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn kính hiển vi cho thấy: 14 chủng vi khuẩn có dạng hình que, gram dương, hình thành bào tử Cuối cùng, chủng clostridia chọn lọc dựa tiêu chuẩn: khả đông tụ sữa, lên men số loại đường, thử nghiệm indol, khả khử sulfite mẫn cảm với Rifampicin ii MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách hình vii Danh sách bảng ix CHƯƠNG I MỞ ĐẦU CHƯƠNG II TỔNG QUAN 2.1 Khái quát Clostridium 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Giới thiệu 2.1.3 Lịch sử phát 2.1.4 Điều kiện sinh trưởng 2.1.5 Cấu trúc tế bào 2.1.6 Bào tử clostridia 2.1.6.1 Điều kiện hình thành bào tử 2.1.6.2 Đặc tính bào tử 2.1.6.3 Sự nảy mầm bào tử 2.2 Khái quát dung môi acetone, butanol, ethanol 2.2.1 Acetone 2.2.2 Butanol 2.2.3 Ethanol 2.3 Clostridia lên men sinh dung môi ABE 10 2.3.1 Cơ chất lên men ABE 10 2.3.2 Con đường trao đổi chất lên men ABE clostridia 11 2.3.3 Mối quan hệ trình sinh dung môi phát triển tế bào, hình thành bào tử 16 2.4 Ứng dụng clostridia 18 2.4.1 Trong công nghiệp 18 2.4.1.1 Acetone 18 iii 2.4.1.2 Ethanol 18 2.4.1.3 Butanol 20 2.4.2 Trong y học 20 2.4.3 Trong nông nghiệp 21 CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 22 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 22 3.2 Vật liệu thiết bị 22 3.2.1 Dụng cụ 22 3.2.2 Thiết bị 22 3.2.3 Vật liệu hóa chất 22 3.2.3.1 Đối tượng nghiên cứu 22 3.2.3.2 Hóa chất 23 3.2.3.3 Thành phần môi trường 25 3.3 Phương pháp nghiên cứu 27 3.3.1 Quy trình thực 27 3.3.2 Phương pháp 29 3.3.2.1 Phương pháp lấy mẫu 29 3.3.2.2 Phương pháp phân lập 29 3.3.2.3 Phương pháp bảo quản chủng phân lập 31 3.3.2.4 Thử nghiệm catalase 31 3.3.2.5 Phương pháp định tính acetone 31 3.3.2.6 Phương pháp nhuộm Gram 32 3.3.2.7 Phương pháp nhuộm bào tử 33 3.2.2.8 Thử nghiệm đông tụ sữa 34 3.2.2.9 Thử nghiệm khả lên men đường 34 3.3.2.10 Thử nghiệm indol 35 3.3.2.11 Thử nghiệm sinh H2S 36 3.3.2.12.Thử nghiệm Rifampicin 37 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 4.1 Kết 38 4.1.1 Phân lập vi sinh vật từ đất, nước thải phân bò 38 4.1.2 Thử nghiệm khả lên men sinh acetone 42 4.1.2.1 Khả lên men sinh acetone mẫu 42 4.1.2.2 Khả lên men sinh acetone chủng 42 iv 4.1.3 Nhuộm Gram nhuộm bào tử 43 4.1.4 Các thử nghiệm sinh hoá 45 4.1.4.1 Thử nghiệm đông tụ sữa 45 4.1.4.2 Thử nghiệm khả lên men đường 46 4.1.4.3 Thử nghiệm indol 48 4.1.4.4 Thử nghiệm khử sulphite 48 4.1.4.5 Thử nghiệm Rifampicin 49 4.2 Thảo luận 50 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 5.1 Kết luận 52 5.2 Kiến nghị 52 Tài liệu tham khảo Phụ lục v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Acetyl – CoA Acetyl – Coenzyme A ABE Acetone – butanol – ethanol ATP Adenosine triphosphate Bdh Butanol dehydrogenase BC Trước công nguyên CPE Clostridium perfringens enterotoxin C Clostridium DNA Acid deoxyribonucleic NAD Nicotinamide adenine dinucleotide EMP Embden – Meyerof - Parnas PCR Polymerase chain reaction p – DMABA P – Dimethylaminobenzaldehyde RCM Reinforced Clostridia Medium PTS Phosphotransferase system SASP Small acid soluble protein TNFα Tumor necrosis factor α UV Ultra violet vi DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Clostridium Hình 2.2 Nhà bác học Hippocrates (460 – 370 BC), Louis Pasteur (1882 – 1895), Prazmowski (1821 – 1885) Chaim Weizmann (1874 – 1952) Hình 2.3 Bào tử clostridia Hình 2.4 Cấu trúc acetone Hình 2.5 Cấu trúc butanol Hình 2.6 Cấu trúc ethanol 10 Hình 2.7 Cellulose 10 Hình 2.8 Con đường trao đổi chất C acetobutylicum 11 Hình 2.9 Cơ chế lên men sinh dung môi ABE C acetobutylicum 12 Hình 2.10 Sự hấp thu chuyển hóa carbohydrate clostridia 14 Hình 2.11 Quá trình thay đổi hình thái, sinh dung môi kết hợp hình thành bào tử C acetobutylicum 17 Hình 2.12 Cây xăng E85 thành phố Lexington, Mỹ 19 Hình 2.13 Cây xăng với E10 (10% ethanol) California 19 Hình 3.1 Quy trình thực 28 Hình 3.2 Các bước tiến hành nhuộm Gram 33 Hình 3.3 Các bước tiến hành nhuộm bào tử 34 Hình 4.1 Hiện tượng sinh sau ủ mẫu ngày môi trường T6 có bổ sung sodium thioglycolate parafin 39 Hình 4.2 Kết trải đĩa mẫu NTV 39 Hình 4.3 Hình thái tế bào M1 41 Hình 4.4 Bảo quản chủng thạch nghiêng 41 Hình 4.5 Bảo quản lạnh âm (-20oC) 41 Hình 4.6 Thử nghiệm khả sinh acetone mẫu phân bò 42 Hình 4.7 Thử nghiệm khả sinh acetone chủng vi khuẩn phân lập từ đất mía đất trồng lúa 43 vii Hình 4.8 Vi khuẩn gram dương, hình que M1 45 Hình 4.9 Bào tử hình thành mẫu M1 45 Hình 4.10 Hiện tượng đông tụ sữa chủng chọn lọc 46 Hình 4.11 Thử nghiệm khả lên men đường mannitol 14 chủng vi khuẩn chọn lọc 47 Hình 4.12 Thử nghiệm indol chủng vi khuẩn chọn lọc 48 Hình 4.13 Khuẩn lạc môi trường màu đen chủng B2 49 Hình 4.14 Vòng ức chế phát triển chủng B2 49 viii DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Các enzyme liên quan đến trình lên men ABE C acetobutylicum 13 Bảng 3.1 Các mẫu phân lập 23 Bảng 4.1 pH loại mẫu phân lập 38 Bảng 4.2 Mô tả hình thái 21 vi khuẩn kị khí phân lập từ mẫu 40 Bảng 4.3 Hình dạng, kích thước vị trí bào tử 44 Bảng 4.4 Kết thử nghiệm khả lên men đường 47 ix CHƯƠNG I MỞ ĐẦU Nhiên liệu sinh học vấn đề quan tâm nhiều quốc gia giới Các quặng dầu mỏ, khí đốt giới ngày cạn kiệt, nhiên phụ thuộc người vào ngày gia tăng phương tiện lại, vận chuyển đến công việc hàng ngày nấu ăn thiếu nhiên liệu (ga, xăng, dầu…) Sử dụng nhiên liệu xăng dầu không làm cạn kiệt nguồn lượng dầu mỏ mà gây tình trạng ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Do vậy, việc nghiên cứu sản xuất loại lượng nhằm thay phần hay toàn nhiên liệu xăng dầu, không gây ô nhiễm môi trường trở thành vấn đề quan trọng định hướng nghiên cứu cho nhà khoa học Butanol, acetone, ethanol loại dung môi có khả sử dụng làm nhiên liệu thay cho xăng dầu Hiện nay, ethanol sử dụng nhiều, nhiên người ta ý đến butanol cấu tạo có bốn nguyên tử carbon nên nặng dẫn đến bay đồng thời có khả tạo lượng cao ethanol acetone Butanol, ethanol acetone phát triển suốt chiến tranh giới lần I nguồn chất lên men đường mía củ cải dẫn đến giá thành cao, triển vọng cạnh tranh với công nghiệp hoá dầu Gần đây, người ta ý đến nguồn phế thải nông nghiệp rơm rạ khô, chất xơ từ xác thực vật (có chứa cellulose, lignocellulose, hemicellulose) làm nguồn chất sản xuất dung môi với giá rẻ, mang lại nhiều lợi ích cho nhà sản xuất phục vụ cho nhu cầu người tiêu dùng ngày cao Những giống vi khuẩn thuộc clostridia nhà khoa học quan tâm chúng có khả lên men sinh dung môi Các chủng có khả lên men tạo butanol cao, đặc biệt số loài có khả sử dụng cellulose làm nguồn chất lên men Các chủng Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharoperbutylacetonicum… vi sinh vật tiềm Để tìm hiểu vi khuẩn clostridia có tiềm sản xuất dung môi, đề tài nghiên cứu thực với mục đích: “Phân lập xác định vi khuẩn clostridia sinh dung môi acetone – butanol – ethanol” TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Hiền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2003 Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2, thí nghiệm vi sinh vật học Nhà xuất Đại học Quốc Gia TPHCM Trần Linh Thước, 2002 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm Nhà xuất giáo dục TIẾNG NƯỚC NGOÀI Bahl, H., Durre, P., 2001 Clostridia Biotechnology and Medical Application, p 49 – 84 Castano, D.M., 2003 Anaerobic, solvent – producing bacteria: Molercular Characterisation, polysaccharolytic activity and agroindustrial waste degradation, p 23 – 31 Cato, E.P., George, W.L., and Finegold, S.M., 1986 Genus Clostridium Prazmowski 1880 in Bergey’s Manual of Systermatic Bacteriology, Vol.2, p 1141 - 1200, Williams and Williams, Baltimore 11 Durre, P., 2009 Practical Handbook of Microbiology The Genus Clostridium nd edition, p 339 – 350, CRC, Florida Hippe, H., Andreesen, J.R., and Gottschalk, G., 1992 The genus Clostrium – nonmedical The prokaryotes 2nd edition, p 1800 – 1866, Springe _ Verlag, New York Hsu, E.J., and Ordal, Z J., 1969 Sporulation of C thermosaccharolyticum Appl Microbiol 18: 958 – 960 Hyun, H.H., Zeikus, J G, Longin, R., Millet, J., and Ryter, A., 1983 Utrastructure and extreme heat resistance of spores from Clostridium thermophitic species J Bacterriol 156: 1332 – 1337 Morag, E., Bayer, E.A., and Lamed, R., 1990 Relationship of cellulose – degrading enzymes J Bacteriol 172: 6098 – 6105 10 O’ Brien, R.W., and Morris, J.G., 1971 Oxygen and the growth and metabolism of Clostridium acetobutylicum J Gen Microbiol 68: 307 – 318 12 Setlow, P., and Johnson, E.A., 1997 Spores and their significance Food Microbiology fundmentals and Fontiers, p 30 – 65, DC: ASM Press, Washington 13 Strasdine, G.A, 1972 The role of intracellulase glucan in endogenus fermention and spore maturation in Clostridium botulinum type E Can J Microbiol 18: 211 – 217 TÀI LIỆU INTERNET 14 http://timnovate.wordpress.com/2009/06/ 15 http://www.vnexpress.net/GL/The-gioi/Tu-lieu/2009/05/3BA0EAD4/ 16 http://www.superstock.com/stock-photography/Louis+Pasteur 17 http://en.wikipedia.org/wiki/File:Adam_Prazmowski.jpg 18 http://de.wikiquote.org/wiki/Chaim_Weizmann 19 http://www.cdiff-support.co.uk/ 20 http://en.wikipedia.org/wiki/Wikipedia_talk:Manual_of_Style_(chemistry) 21 http://alternativefuels.about.com/od/thedifferenttypes/a/biobutanol.htm 22 http://www.thecartorialist.com/?m=200712 23 http://www.drgaryseeman.com/resources/arel.php 24 http://scienceray.com/biology/carbohydrates-2/ 25 http://www.ovsclub.com.vn/show_article.php?aid=11229&lg=vn 26 http://www.hoangvi.com/tin-tuc/o-to-xe-hoi-mo-to/5-nhien-lieu-sach-thay-thexang-cho-xe-hoi.html 27 http://www.khoahoc.net/baivo/tranvandat/240408-nangluongsinhhoc.htm 28 http://www.meddean.luc.edu/lumen/DeptWebs/microbio/med/gram/tech.htm PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết trải đĩa mẫu NTV 100 10-1 10-2 Phụ lục 2: Thử nghiệm catalase 27 mẫu phân lập R1 R2 R3 R4 R6 R5 P1 P2 P3 B1 P4 P5 P6 B2 P7 N1 B3 B4 N3 N4 P8 N2 N5 Phụ lục 3: Thử nghiệm định tính acetone mẫu đất mía, phân bò 21 chủng chọn lọc (-) (-) MBC BTT MHT BBC MLB BLT MLH BTN M1 M2 (-) M3 N1 R1 N2 R4 N3 R5 N4 (-) N5 Phụ lục 4: Hình thái tế bào 21 vi khuẩn kị khí phân lập M1 R1 M2 R4 M3 R5 B1 B2 B3 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 N1 N3 N4 N2 N5 Phụ lục 5: Hình nhuộm Gram 21 mẫu chọn lọc M1 R1 B1 M2 M3 R4 R5 B2 B3 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 N1 N2 N3 N4 N5 Phụ lục 6: Hình nhuộm bào tử 16 chủng chọn lọc M1 M2 R1 R4 B1 B2 P3 P4 M3 R5 P1 P5 P6 N2 N3 N4 Phụ lục 7: Thử nghiệm khả đông tụ sữa 14 chủng chọn lọc P3 P4 P6 N2 (-) N3 N4 (-) M1 M2 M3 R1 R4 R5 B2 P1 Phụ lục 8: Thử nghiệm khả lên men đường 14 chủng chọn lọc a Đường manitol (-) M1 M3 R1 R4 R5 B2 P3 P6 N2 N3 N4 M2 P1 P4 (-) b Đường mantose (-) M1 M3 R1 R5 B2 P3 P6 R4 R5 B2 N2 N3 N4 M2 R4 P1 P4 (-) c Đường saccharose M1 M2 M3 R1 P3 P6 N2 N3 N4 P1 P4 (-) d Đường lactose M1 M3 R1 R5 B2 P3 R5 B2 P6 N2 N4 M2 R4 P1 N2 N3 N4 M2 P4 N3 (-) e Đường glucose M1 M3 R1 R4 P3 P6 P1 P4 (-) Phụ lục 9: Thử nghiệm Indol 11 chủng chọn lọc (+) M1 M2 R1 R4 R5 B2 P3 P6 N2 N3 N4 (-) Phụ lục 10: Thử nghiệm sinh H2S M1 R1 R5 B2 P3 P6 N2 N4 (-) Phụ lục 11: Thử nghiệm sinh Rifampicin M1 R5 P6 N2 Phụ lục 12: Bình ủ kị khí thị kị khí a Bình ủ kị khí b Chỉ thị kị khí: B2 N4 [...]...Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm:  Phân lập các chủng vi khuẩn clostridia từ mẫu đất, nước thải và phân bò  Chọn lọc các chủng có tiềm năng sinh dung môi  Khảo sát đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn  Chọn lọc các chủng vi khuẩn clostridia bằng các thử nghiệm sinh hoá 2 CHƯƠNG II TỔNG QUAN 2.1 Khái quát về Clostridium 2.1.1 Phân loại Theo hệ thống phân loại trong Bergey’s... lên men ABE ở clostridia C acetobutylicum lên men sinh dung môi ABE ở 35 – 37 oC Acetone – butanol – ethanol thường được tạo ra với tỉ lệ 3: 6: 1 Trong suốt quá trình lên men, C acetobutylicum tạo ba sản phẩm chính là acid (acid acetic, acid lactic, acid butyric), dung môi (acetone, butanol, ethanol) và khí (CO2, H2) Lúc đầu, clostridia lên men sinh acid với acetate, butyrate… Khi pH môi trường giảm... sử dụng làm dung môi hòa tan sơn nhanh chóng phục vụ cho sơn phủ ôtô Trong những năm 1913 - 1915, Weizmann đã thực hiện thành công lên men acetone – butanol – ethanol bằng C acetobutylicum Chu trình 4 này sau đó được gọi là lên men ABE, chính là vi t tắt của acetone – butanol – ethanol Đến thế kỷ XX, người ta đã phân lập hơn 100 loài khác nhau Nó có tác động to lớn về cả mặt công nghệ sinh học cũng... nghiên cứu về vi khuẩn này chỉ bắt đầu từ năm 1861 khi nhà vi sinh vật học nổi tiếng người Pháp, Louis Pasteur khám phá ra sự tồn tại của những vi sinh vật mà sự sinh trưởng và phát triển của chúng không cần oxy Ông cho rằng acetone, butanol, ethanol được hình thành trong suốt quá trình lên men và clostridia có khả năng tổng hợp được dung môi này Điều này được xem như một cuộc cách mạng vào thời điểm... của clostridia trong giai đoạn đầu nhằm acid hóa môi trường Vi khuẩn kị khí không giữ pH cơ thể ổn định mà nó sẽ giảm song song với môi trường nhưng kém hơn một đơn vị pH Trong phạm vi pH môi trường là 4 đến 4.5, acid từ môi trường sẽ khuyếch tán vào tế bào và bị phân giải ở đây Kết quả là kênh proton trên màng tế bào sẽ bị gãy và tế bào sẽ chết Vi c biến đổi acid thành 16 sản phẩm trung tính (dung môi. .. kiện thuận lợi, tế bào sẽ quay trở lại dạng tế bào sinh dưỡng và chu kỳ được lặp lại 17 2.4 Ứng dụng của clostridia 2.4.1 Trong công nghiệp Ứng dụng chủ yếu của clostridia trong công nghệ sinh học là lên men acetone – butanol – ethanol bởi C acetobutylicum Các dung môi này có vai trò vô cùng quan trọng trong công nghiệp 2.4.1.1 Acetone Acetone là dung môi quan trọng được sử dụng nhiều trong các ngành... bào và DNA (Durre, 2005) Giai đoạn nảy mầm và tăng sinh được thực hiện trong túi bào tử và kết quả là tế 8 bào sinh dưỡng được phóng thích ra ngoài [5][7][12][13] 2.2 Khái quát về dung môi acetone, butanol, ethanol 2.2.1 Acetone Acetone còn có tên là dimetylcetone (CH3COCH3) là chất lỏng, không màu, trong với mùi hắc đặc trưng, khó bị oxi hoá, dễ bị khử Vì acetone ít độc nên được dùng làm dung môi. .. tạo chất thơm… Ngoài ra, acetone còn được sử dụng trong phân tích hoá học và trong nghiên cứu khoa học Một lượng lớn acetone được dùng làm dung môi tẩy rửa trong sản xuất sợi thủy tinh, dung môi lau chùi trong công nghiệp điện tử, là dung môi tẩy nhờn cho len lụa và là thuốc rửa móng tay Nó cũng được sử dụng làm dung môi trong sản xuất dược phẩm và mỹ phẩm, trong quá trình chiết và sản xuất phấn không... đã phát hiện thấy enzyme butanol – ethanol – isopropanol dehydrogenase, acetone sẽ được khử thành isopropanol nhờ enzyme này  Acetoacetyl – CoA  butyryl – CoA  butanal  butanol Acetoacetyl – CoA chuyển hoá thành β – hydroxybutyryl CoA sau đó chuyển thành crotonyl – CoA Nhờ enzyme butyryl – CoA dehydrogenase, crotonyl – CoA được chuyển thành butyryl – CoA Butyryl – CoA chuyển nhóm CoA tạo thành butyric... loài sinh trưởng theo con đường tự dưỡng, một số loài trao đổi chất trong phạm vi cơ chất hẹp với các quá trình phân giải khác nhau Một số loài có tiềm năng lớn trong công nghệ sinh học, sản xuất dung môi butanol, acetone, ethanol như C acetobutylicum Bên cạnh đó, một vài loài lại gây bệnh nguy hiểm cho người và động vật như C perfringens gây bệnh đường ruột, C difficile gây bệnh tiêu chảy và vi m ... NH VI KHUN CLOSTRIDIA SINH DUNG MễI ACETONE BUTANOL ETHANOL Ging vi n hng dn: TS HONG QUC KHNH Clostridia ang c nhiu nh khoa hc quan tõm vỡ chỳng cú kh nng lờn men sinh dung mụi acetone, butanol, ... nhng vi sinh vt tim nng nht tỡm hiu vi khun clostridia cú tim nng sn xut dung mụi, ti nghiờn cu ny c thc hin vi mc ớch: Phõn lp v xỏc nh vi khun clostridia sinh dung mụi acetone butanol ethanol. .. 2.2 Khỏi quỏt v dung mụi acetone, butanol, ethanol 2.2.1 Acetone 2.2.2 Butanol 2.2.3 Ethanol 2.3 Clostridia lờn men sinh dung mụi ABE