Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng thực vật methyl jasmonate lên khả năng tích lũy asiaticoside trong nuôi cấy huyền phù tế bào rau má (centella asiatica l )

55 1.6K 1
Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng thực vật methyl jasmonate lên khả năng tích lũy asiaticoside trong nuôi cấy huyền phù tế bào rau má (centella asiatica l )

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

1 I HC HU TRNG I HC S PHM ====== TR TH KHNH NHI NGHIN CặẽU ANH HặNG CUA METHYL JASMONATE LN KHA NNG TấCH LUẻY ASIATICOSIDE TRONG NUI CY HUYệN PHUè T BAèO RAU MAẽ (Centella asiatica L.) KHểA LUN TT NGHIP NGANH: SINH HOC GIANG VIấN HNG DN: PGS TS TRN QUễC DUNG ThS NGUYấN THANH GIANG HU, KHểA HC 2011 - 2015 LI CM N Trong sut thi gian hc v hon thnh khúa lun, tụi ó nhn c rt nhiu s giỳp cỏc thy cụ giỏo Khoa Sinh hc, Trng i hc S phm Hu Tụi xin chõn thnh cm n s giỳp quý giỏ ú c bit, tụi xin by t lũng bit n chõn thnh v li cm n sõu sc nht n PGS.TS Trn Quc Dung v ThS Nguyn Thanh Giang, hai thy giỏo ó tn tỡnh hng dn, ch bo v to mi iu kin thun li nht cho tụi sut quỏ trỡnh thc hin khúa lun ny Tụi xin gi li cm n n cỏc thy cụ lónh o Vin Cụng ngh sinh hc, i hc Hu, cỏc cỏn b ca Vin, c bit l TS Hong Tn Qung, v KS Trnh Hu Tn ó cú nhiu s giỳp quý bỏu cho tụi quỏ trỡnh thc hin khúa lun ny Cui cựng tụi xin by t lũng bit n sõu sc n nhng ngi thõn gia ỡnh, bn bố ó ng viờn, giỳp tụi sut thi gian hc cho n hon thnh khúa lun ny Mt ln na tụi xin chõn thnh cm n! Hu, thỏng nm 2015 Tỏc gi Tr Th Khỏnh Nhi DANH MC CC T VIT TT 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid BAP : - benzylamino purine cs : cng s g/L : gam/lớt HCTC : hp cht th cp HPLC : high performance liquid chromatography (sc ký lng hiu nng cao) KIN : kinetin MeJA : methyl jasmonate MS : Murashige v Skoog (1962) mg/L : miligam/lớt mg/g : miligam/gam NAA : Nxb : nh xut bn SA : salicylic acid YE : yeast extract (dch chit nm men) HST : iu hũa sinh trng MS : mụi trng nuụi cy c bn àM : micromol naphthaleneacetic acid DANH MC CC BNG S hiu Tờn bng Trang Sn phm th cp t nuụi cy t bo thc vt so vi cõy t nhiờn Cỏc hp cht th cp ó c sn xut t nuụi cy mụ v t Bng 1.2 bo thc vt (Mulbagal and Tsay 2004) Mt s cht kớch khỏng sinh hc c s dng ci thin Bng 1.3 hiu sut ca cỏc hp cht th cp 13 Bng 3.1 Sinh t bo thu c sau 24 ngy nuụi cy (g) 27 Bng 1.1 Bng 3.2 Bng 3.3 Bng 3.4 Bng 3.5 Bng 3.6 Bng 3.7 Bng 3.8 Sinh ti thu c sau b sung MeJA cỏc nng khỏc (g) Sinh khụ thu c sau b sung MeJA cỏc nng khỏc (g) T l lng sinh sau b sung MeJA so vi i chng (%) nh hng ca nng MeJA lờn kh nng tớch ly asiaticoside ca t bo (g) Sinh ti thu c sau b sung 100 àM MeJA cỏc nng khỏc (g) Sinh khụ thu c sau b sung 100 àM MeJA cỏc nng khỏc (g) nh hng ca thi im b sung MeJA lờn kh nng tớch ly asiaticoside ca t bo rau mỏ 15 30 32 32 33 37 38 40 DANH MC CC BIU S hiu Tờn biu Biu th hin sinh khụ ti ca t bo rau mỏ sau b sung MeJA vo cỏc nng khỏc Biu th hin sinh toi ca t bo rau mỏ sau Biu 3.2 b sung MeJA vo cỏc nng khỏc Biu th hin sinh khụ ti ca t bo rau mỏ Biu 3.3 sau b sung 100 àM MeJA vo cỏc thi im khỏc Biu th hin sinh khụ ca t bo rau mỏ sau Biu 3.4 b sung 100 àM MeJA vo cỏc thi im khỏc Biu 3.1 Trang 31 32 38 39 DANH MC CC HèNH S hiu Tờn bng Trang Hỡnh 3.1 Cỏc loi callus sau 21 ngy nuụi cy 26 Hỡnh 3.2 Huyn phự t bo rau mỏ sau 24 ngy nuụi 27 Hỡnh 3.3 Ph HPLC chun 1mg/mL 29 Hỡnh 3.4 Ph HPLC i chng 29 Ph HPLC ca asiaticoside b sung vo mụi trng nuụi cy 50 àM MeJA Ph HPLC ca asiaticoside b sung vo mụi trng Hỡnh 3.6 nuụi cy 100 àM MeJA Ph HPLC ca asiaticoside b sung vo mụi trng Hỡnh 3.7 nuụi cy 150 àM MeJA Ph HPLC ca asiaticoside b sung vo mụi trng Hỡnh 3.8 nuụi cy 200 àM MeJA Ph HPLC ca dch chit asiaticoside t t bo nuụi trờn Hỡnh 3.9 mụi trng b sung 100 àM MeJA thi im ngy Ph HPLC ca dch chit asiaticoside t t bo nuụi trờn Hỡnh 3.10 mụi trng b sung 100 àM MeJA thi im 10 ngy Ph HPLC ca dch chit asiaticoside t t bo nuụi trờn Hỡnh 3.11 mụi trng b sung 100 àM MeJA thi im 15 ngy Hỡnh 3.5 35 35 36 36 41 41 40 PHN M U Tớnh cp thit ca ti Hin nay, ngi ang chng chi vi mt lot cỏc bnh tt mang tớnh thi i nh bộo phỡ, tiu ng, tim mch, ung th, HIV/AIDS Cụng ngh sn xut dc phm cng vỡ vy m c quan tõm u t nhiu hn Vn quan trng nht nh hng trc tip n cht lng dc phm l ngun cung cp nguyờn liu thiờn nhiờn sch, v an ton Mt nhng i tng cung cp nguyờn liu hiu qu nht l thc vt Cú khong hn 30.000 hp cht c chit xut t thc vt nh alkaloid; terpenoid; phenolic; c bit n nh l cỏc hp cht th cp Cỏc hp cht thng ch c to mt s loi t bo nht nh vi hm lng rt nh [6] Mc dự, húa hc tng hp cỏc cht hu c t nhiu thnh tu quan trng nhiờn nhiu hp cht co hoat tinh sinh hoc cũn khú tng hp hoc cú th tng hp c nhng chi phớ rt t Trờn th gii, vo cui th k XIX, ngi ó s dng k thut nuụi cy mụ t bo thc vt sn xut cỏc cht cú hot tớnh sinh hc ó gii quyt c nan gii trờn Trong i sng ca thc vt, hp cht th cp l sn phm ca cỏc phn ng húa hc ca nú vi mụi trng hoc l s bo v húa hc chng li vi sinh vt v ng vt gõy bnh [4] Cht kớch khỏng bo v thc vt (elicitor) bỏo hiu vic hỡnh thnh cỏc hp cht th cp Vỡ vy tng quỏ trỡnh sn xut hp cht th cp thỡ gii phỏp ti u nht l s dng cỏc cht kớch khỏng ca b mỏy bo v cõy ó cú nhiu cụng trỡnh nghiờn cu trờn nh nghiờn cu tng sn xut silymarin nuụi cy t bo ca Silybum marianum bng cỏc cht kớch khỏng thc vt dch chit nm men (YE) v methyl jasmonate (MeJA) [23] Rau mỏ (Centella asiatica L.) l cõy thõn tho, thng c dựng nhit, li thp, gii , iu tr cỏc bnh gan, tỡ v thn, cha lnh vt thng, khỏng viờm, tn thng niờm mc da [3] Mt s thnh phn húa hc quan trng cú nú nh nhúm triterpens cha asiatic acid, madecassic acid, madecassoside, cht chng oxi húa phenolic v c bit l asiaticoside Asiaticoside cú tỏc dng ln vic chng suy nhc c th, lin vt bng v vt thng tn niờm mc da, cú hot tớnh dit bo ngn chn c s phỏt trin ca mt s dũng t bo ung th [3] T trc n nay, rau mỏ c khai thỏc ch yu t ngun hoang di, thụ s, mang tớnh riờng l, nờn ngun nguyờn liu cung cp chit xut cỏc hp cht th cp cho vic sn xut dc liu cũn hn ch vỡ th cn tỡm cỏc phng phỏp ci thin Nuụi cy t bo rau mỏ cú b sung cht kớch khỏng thc vt l mt nhng phng phỏp ti u nht [11] Xut phỏt t ý ngha trờn, tụi tin hnh ti: Nghiờn cu nh hng ca cht kớch khỏng thc vt methyl jasmonate lờn kh nng tớch ly asiaticoside nuụi cy huyn phự t bo rau mỏ (Centella asiatica L.) Nhm ng dng k thut nuụi cy t bo thc vt tng nhanh quỏ trỡnh sn xut asiaticoside, t ú cung cp ngun dc cht t nhiờn cho cỏc nghiờn cu lnh vc y hc Kt qu ca ti s lm c s cho vic hon chnh quy trỡnh sn xut asiaticoside t sinh t bo ng dng lnh vc dc phm sau ny Mc tiờu ca ti Tng cng kh nng tớch ly asiaticoside quỏ trỡnh nuụi cy huyn phự t bo rau mỏ bng cỏch b sung cht kớch khỏng MeJA PHN NI DUNG NGHIấN CU Chng I: TNG QUAN TI LIU 1.1 Nuụi cy mụ, t bo thc vt 1.1.1 C s khoa hc ca vic nuụi cy mụ, t bo thc vt 1.1.1.1 Nuụi cy mụ, t bo thc vt l gỡ? Nuụi cy mụ, t bo thc vt (plant tissue culture) l k thut a mt b phn, mụ hoc t bo ca thc vt vo mt h thng vụ trựng cú th kim soỏt v thnh phn cht khoỏng, iu hũa sinh trng, cỏc cht hu c cung cp cho s sng ca cõy, cỏc yu t ỏnh sỏng, nhit , m, pH iu khin s phỏt sinh hỡnh thỏi ca t bo thc vt mt cỏch cú nh hng K thut ny da vo hai nguyờn tc chớnh l tớnh ton nng ca t bo v kh nng bit húa v phn bit húa ca t bo [7] 1.1.1.2 Tớnh ton nng ca t bo Mi t bo bt kỡ no c th thc vt u mang y thụng tin di truyn ca c th v cú kh nng phỏt trin thnh mt c th hon chnh gp iu kin thun li [1] 1.1.1.3 S bit húa v phn bit húa ca t bo Mt c th thc vt bao gm rt nhiu loi t bo, chỳng cu to nờn cỏc b phn khỏc ca c th vi nhng chc nng c trng riờng Ton b cỏc t bo ny u bt ngun t mt t bo ban u (t bo hp t) giai on u, t bo hp t phõn chia thnh nhiu t bo phụi sinh cha mang riờng bit (chuyờn húa) Sau ú cỏc t bo phụi ny tip tc c bin i thnh cỏc t bo chuyờn húa c hiu riờng cho cỏc mụ, c quan khỏc ú chớnh l s bit húa t bo Tuy nhiờn, t bo ó phõn húa thnh cỏc t bo cú chc nng chuyờn bit, chỳng khụng hon ton mt i kh nng bin i ny ca mỡnh Trong iu kin thớch hp chỳng cú th tr v dng t bo phụi sinh v phõn chia mnh m Quỏ trỡnh ú gi l quỏ trỡnh phn bit húa t bo 10 Da vo hai c tớnh trờn, ngi ó ng dng vo khoa hc thc tin vo to nờn k thut nuụi cy t bo thc vt 1.1.2 Quy trỡnh nuụi cy mụ, t bo thc vt T vic hiu bit v cỏc nguyờn tc ca nuụi cy t bo thc vt iu kin hon ton sch vi sinh vt, vụ trựng, trờn mụi trng dinh dng nhõn to, ngi ó hỡnh thnh nờn nhiu lnh vc ng dng quan trng Trong ú, nhõn ging vụ tớnh cõy trng in vitro hay vi nhõn ging (micropropagation) l mt lnh vc ng dng hiu qu nht Nú bao gm: - Nuụi cy cõy non v cõy trng thnh - Nuụi cy c quan: r, thõn, lỏ, hoa, qu, bao phn, noón cha th tinh - Nuụi cy phụi: phụi non v phụi trng thnh - Nuụi cy mụ so (callus) - Nuụi cy huyn phự t bo - Nuụi cy t bo trn Trong ti nghiờn cu ny, chỳng s dng hai quy trỡnh nuụi cy mụ, t bo ú l nuụi cy mụ so v huyn phự t bo rau mỏ 1.1.2.1 Nuụi cy mụ so (callus) Nuụi cy callus cho phộp cỏc t bo khụng cú hỡnh dng nht nh tng lờn t sinh trng khụng phõn húa ca mu vt trờn mụi trng dinh dng rn vụ trựng [7] Mụi trng nuụi cy l mụi trng dinh dng c bn cú cht lm rn l agar Mụi trng dinh dng c bn ny cha cỏc cht dinh dng khoỏng a lng, vi lng, ngun carbon v nhiu loi cht HST thc vt nh: auxin, cytokinin, giberelin t c hiu qu nuụi cy callus ti a, cn ỏnh giỏ chớnh xỏc cỏc nh hng ca thnh phn mụi trng dinh dng hoc loi, nng cht HST Cỏc thụng s ph bin nht dựng ỏnh giỏ sinh trng nuụi cy callus bao gm lng ti, lng khụ v ch s sinh trng Mu vt thng l c quan nh hoc mu mụ Cỏc t bo ny khụng tng ng vi bt kỡ mt mụ c trng no ca cõy hon chnh [13] hp th quang (mAU) 41 (mAU) hp th quang Thi gian lu (phỳt) Hỡnh 3.7 Ph HPLC ca asiaticoside b sung vo mụi trng nuụi cy 150àM MeJA Thi gian lu (phỳt) Hỡnh 3.8 Ph HPLC ca asiaticoside b sung vo mụi trng nuụi cy 200àM MeJA 42 3.3.2 nh hng ca thi im b sung methyl jasmonate Sau thm dũ c nng b sung ti u nht l 100 àM MeJA, chỳng tụi tip tc s dng nng ny thm dũ thi im b sung MeJA 3.3.2.1 Sinh t bo thm dũ nh hng ca thi im b sung MeJA lờn s sinh trng v kh nng tớch ly asiaticoside ca t bo rau mỏ, tụi tin hnh nh sau: Ly g callus vng ri cho vo bỡnh tam giỏc cú th tớch 250 mL cha 50 mL mụi trng lng cú thnh phn c bn MS + mg/L NAA + mg/L BAP + 30 g/L sucrose Sau tun nuụi cy, tụi tin hnh thu cỏc t bo ng nht (t bo s cp) Tip tc cy chuyn g t bo s cp trờn vo mụi trng cú thnh phn c bn MS +1 mg/L NAA + mg/L BAP + 30 g/L sucrose, ng thi b sung MeJA 100 àM cỏc thi im 0, 5, 10 v 15 ngy Sau 24 ngy thu sinh t bo xỏc nh lng ti, lng khụ c, sau ú tỏch chit asiaticoside v phõn tớch HPLC T bo 24 ngy tui t sinh cc i, chỳng tụi tin hnh thu mu v cõn lng Mi thớ nghim c lp li ln, kt qu c th hin bng 3.6 v bng 3.7 Bng 3.6 Sinh ti thu c sau b sung 100àM MeJA cỏc thi im khỏc sau (g) Thi im(ngy) Ln Ln Ln Trung bỡnh 5.28 5.36 5.32 5.32 6.42 6.4 6.21 6.34 10 6.54 6.4 6.33 6.43 15 7.32 7.05 7.18 7.18 43 Bng 3.7 Sinh khụ thu c sau b sung 100àM MeJA cỏc thi im khỏc (g) Thi im(ngy) Ln Ln Ln Trung bỡnh 0.54 0.53 0.53 0.53 0.77 0.76 0.76 0.76 10 0.77 0.77 0.77 0.77 15 0.81 0.83 0.83 0.82 Qua s liu bng 3.6 v bng 3.7, cho thy cỏc thi im b sung 100 àM MeJA l 5, 10,15, 20 ngy thỡ sinh thu c cú s chờnh lch nhau, biu din biu 3.3 v 3.4 Biu 3.3 Sinh ti t bo rau mỏ sau b sung 100 àM MeJA cỏc thi im khỏc 44 Biu 3.4 Sinh khụ t bo rau mỏ sau b sung 100 àM MeJA cỏc thi im khỏc Qua biu 3.3 v biu 3.4 cho thy sinh ca t bo tng dn tng ng vi cỏc thi im b sung MeJA ln lt l: 0, 5, 10 v 15 ngy sau nuụi cy, ú b sung MeJA vo ngy th 15 cho hiu qu cao nht vi lng ti thu c t 7.18 g nhng thp hn so vi i chng (8.08 g) Kt qu ca chỳng tụi l tng t vi kt qu ca Nguyn Hong Lc v cs (2010) v Nguyn Hong Lc v cs (2012) Lý vi tớnh cht sinh trng ca t bo nuụi cy m, b sung MeJA vo mụi trng nuụi cy s c ch s sinh trng ca t bo ú s c ch mnh nht nu b sung vo u chu k sinh trng v c ch yu nht nu b sung vo gia pha log (ngy th 15) 3.3.2.2 Kh nng tớch ly asiaticoside ca t bo Chỳng tụi tin hnh tỏch chit v chy HPLC nh tớnh v nh lng asiaticoside ca t bo 24 ngy tui cú b sung 100àM MeJA cỏc thi im khỏc Kt qu chy HPLC c th hin qua hỡnh 3.9-3.11 Phõn tớch HPLC asiaticoside cho thy tt c ph sc ký u cú peak chớnh ging thi gian lu khong 2,03 phỳt, gn trựng vi peak ca asiaticoside chun 45 v mt s peak ph cú din tớch khụng ỏng k Nh vy cỏc mu cú asiaticoside Cỏc peak ny khỏc v chiu cao v rng cỏc thi im b sung MeJA khỏc nhau, hm lng asiaticoside c th hin qua bng 3.8 Bng 3.8 nh hng ca thi im b sung 100 àM MeJA lờn kh nng tớch ly asiaticoside ca t bo rau mỏ Thi im (ngy) Din tớch peak Thi gian lu (phỳt) Hm lng asiaticoside (mg/g) 2945603 2,03 99,69 2908595 2,06 108,6 10 6084305 2,00 205,92 15 5210892 2,05 176,37 i chng 1608494 2,06 54,44 Kt qu bng 3.8 cho thy, hm lng asiaticoside tớch ly t bo nuụi cy trờn mụi trng b sung MeJA nhng thi im khỏc cú s chờnh lch ỏng k Trong ú, kh nng tớch ly asiaticoside ca t bo rau mỏ c nuụi cy trờn mụi trng cú b sung MeJA thi im 10 ngy tt nht vi hm lng asiaticiside t 205,92 mg/g lng khụ, cao gp 3,78 ln so vi i chng Nguyờn nhõn cú th liờn quan n thi gian hot húa cỏc gen mó húa cỏc enzyme chỡa khúa ng sinh tng hp centelloside [18] Kt qu ny ca chỳng tụi khỏc so vi kt qu nghiờn cu ca Bonfic v cs (2010) l kh nng tớch ly centellosides ca t bo rau mỏ c nuụi cy trờn mụi trng cú b sung 100 àM MeJA thi im 15 ngy l ti u nht Lý thi im b sung kớch khỏng MeJA ti u nht tng kh nng tớch l cỏc HCTC l khỏc hp th quang (mAU) 46 Thi gian lu (phỳt) hp th quang (mAU) Hỡnh 3.9 Ph HPLC ca dch chit asiaticoside t t bo nuụi trờn mụi trng b sung 100 àM MeJA thi im ngy Thi gian lu (phỳt) Hỡnh 3.10 Ph HPLC ca dch chit asiaticoside t t bo nuụi trờn mụi trng b sung 100 àM MeJA thi im 10 ngy hp th quang (mAU) 47 Thi gian lu (phỳt) Hỡnh 3.11 Ph HPLC ca dch chit asiaticoside t t bo nuụi trờn mụi trng b sung 100 àM MeJA thi im 15 ngy Thi gian lu (phỳt) Hỡnh 3.11 Ph HPLC ca dch chit asiaticoside t t bo nuụi trờn mụi trng b sung MeJA thi im 15 ngy 48 PHN KT LUN V NGH 4.1 Kt lun - Mụi trng c bn MS b sung mg/L NAA, mg/L BAP, 30 g/L sucrose, pH 5.8 tc lc 120 vũng/ phỳt, cng chiu sỏng 500 lux khong 8-10 gi/ngy l tt nht cho s sinh trng ca t bo rau mỏ vi sinh ti v khụ thu c tng ng ln lt l 8.08 g v 0.92 g; hm lng asiaticoside tớch ly c l 54.44 mg/g lng khụ - Nng MeJA 100 àM l ti u nht b sung vo mụi trng nuụi cy huyn phự t bo rau mỏ thu c hm lng asiaticoside cao nht - B sung 100 àM MeJA thi im ngy th 10 sau nuụi cy cho hiu qu tớch ly asiaticoside tt nht vi hm lng thu c l 205.92 mg/g lng khụ; cao gp 3.78 ln so vi khụng b sung kớch khỏng 4.2 ngh - Thm dũ nh hng ca MeJA lờn kh nng tớch ly asiaticoside ca t bo rau mỏ h lờn men (bioreactor) - Thm dũ nh hng phi hp ca cỏc cht kớch khỏng khỏc nh SA, YA, lờn kh nng tớch ly asiaticoside ca t bo rau mỏ h lờn men (bioreactor) - Phõn tớch biu hin ca mt s gen mó húa cho cỏc enzyme tham gia vo quỏ trỡnh sinh tng hp asiaticose 49 TI LIU THAM KHO Ting Vit Nguyn Th Võn Anh (2010), Nghiờn cu iu kin tỏch chit asiaticoside t rau mỏ v ng dng sn xut tr chc nng t rau mỏ, Lun Thc s K thut sn xut n v thc ung, i hc Nng Vừ Vn Chi (2002), T in thc vt thụng dng, (Tp 1), Nxb Khoa hc v K thut, H Ni Trn Hng Hnh (2007), Rau mỏ, cõy rau v thuc, Tp Sc khe Y hc, (7), tr 54 Trn Vit Hng (1996), Rau mỏ v ung th, Tp Y dc, (5), tr Nguyn Thanh Giang (2012), Nghiờn cu nh hng ca mt s cht kớch khỏng thc vt lờn kh nng tớch ly asiaticoside ca t bo rau mỏ nuụi cy invitro, Lun Thc s Sinh hc thc nghim, Trng i hc Khoa hc, i hc Hu Nguyn Hong Lc (2007), Giỏo trỡnh Cụng ngh t bo, Nxb i hc Hu Nguyn Hong Lc (2007), Giỏo trỡnh Nhp mụn Cụng ngh sinh hc, Nxb i hc Hu Trnh Xuõn Ng (2008), Bi ging Nhp mụn Cụng ngh sinh hc, Nxb i hc Cụng nghip TPHCM Vừ Chõu Tun (2014), Nghiờn cu nuụi cy t bo cõy ngh en (Curcuma zedoaria Roscoe) v kho sỏt kh nng tớch ly mt s hp cht cú hot tớnh sinh hc ca chỳng, Lun ỏn Tin s Sinh hc, Trng i hc Khoa hc, i hc Hu 10 Phựng Th Sinh (2004), nh lng cỏc vitamin rau mỏ bng phng phỏp sc ký lng cao ỏp, Tp Sinh hc, (8), tr 10-12 11 V Vn V (1999), Sinh lý thc vt ng dng, Nxb Giỏo dc, H Ni 50 Ting Anh 12 Aijaz A., Jain S., Hariharan A.G (2011), Effect of elicitation on the production of phyto-constituents through plant tissue culture technique, International Journal of Drug Discovery and Herbal Research, 1(2), pp 84-90 13 Aziz Z.A., Davey M.R., Power J.B., Anthony P., Smith R.M., Lowe K.C (2007), Production of asiaticoside and madecassoside in Centella asiatica in vitro and in vivo, Biologia Plantarum, 51(1), pp 34-42 14 Bonfill M., Managas S., Moyano E., Cusido R.M., Palazún J (2010), Production of centellosides and phytosterols in cell suspension cultures of Centella asiatica, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 104(1), pp 61-67 15 Bouque V., Bourgaud F., Nguyen C., Guckert A (1998), Production of daidzein by callus cultures of Psoralea species and comparison with plants, Plant Cell Tissue and Organ Culture 53, pp 35-40 16 Chong T.M., Abdullah M.A., Lai O.M., NorAini F.M., Laijs N.H (2005), Effective elicitation factors in Morinda elliptica cell suspension culture, Process Biochemistry, 40(11), pp 3397-3405 17 Loc N.H., and Giang N.H (2012), Effects of elicitors on the enhancement of asiaticoside biosynthesis in cell cultures of centella (Centella asiatica L Urban), Hue University, 66(7), pp 642-648 18 Kim O.T., Bang H.K., Shin S.Y., Lee J.M., Jung J.S., Hyun Y.D., Kim C.Y., Seong S.N., Cha W.S., Hwang B (2007), Enhanced production of asiaticoside from hairy root cultures of Centella asiatica (L.) Urban elicited by methyl jasmonate, Plant Cell Reports, 26(11), pp 1941-1949 19 Kim O.T., Kim H.S., Ohyama K., Muranaka T., Choi E.Y., Lee H., Kim Y.M., Hwang B (2010), Upregulation of phytosterol and triterpene biosynthesis in Centella asiatica hairy roots overexpressed ginseng farnesyl diphosphate synthase, Plant Cell Reports, 29(4), pp 403-411 20 Loc N.H., An N.T (2010), Asiaticoside production from Centella (Centella asiatica L.) cell culture, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 15(6), pp 1065-1070 51 21 Mangas S., Moyano E., Osuna L., Cusido R.M., Bonfill M., Palazún J (2008), Triterpenoid saponin content and the expression level of some related genes in calli of Centella asiatica, Biotechnology Letters, 30(10), pp 1853-1859 22 Misawa M (1994), Plant Tissue Culture: An alternative for Production of Useful Metabolite, FAO Agricultural Services Bulletin, vol 108 23 Malarz J., Stojakowska A (2007), Effect of methyl jasmonate and salicylic acid on sesquiterpene lactone accumulation in hairy roots of Cichorium intybus, Acta Physiol Plant, 30(27), pp 127-132 24 Mulabagal V., Tsay H.S (2004), Plant cell cultures-An alternative and efficient source for the production of biologically important secondary metabolites, International Journal of Applied Science and Engineering, 2(1), pp 29-48 25 Seung-Mi-Kang; Ji-Yun; Yong-Duck (2008), Effect of methyl jasmonate and salicylic acid on the production of bilobalide and ginkgolides in cell cultures of Ginkgo biloba, In Vitro Cell, 50(47), pp.44-49 26 Yu Z.Z., Fu C.X., Han Y.S., Li Y.X., Zhao D.X (2005), Salicylic acid enhances jaceosidin and siringin production in cell cultures of Saussurea medusa, Biotechnology Letters, 28(13), pp 1027-1031 PH LC HèNH NH 1.1 T bo huyn phự rau mỏ i chng 1.2 T bo huyn phự rau mỏ 100 àM MeJA 1.3 T bo huyn phự rau mỏ nuụi cy trờn mụi trng cú b sung 100 àM MeJA thi im 10 ngy 1.4 T bo huyn phự rau mỏ nuụi cy trờn mụi trng cú b sung 100 àM MeJA thi im ngy 1.5 Sinh ti 1.6 Callus vng rau mỏ sau nuụi cy 1.7 Mỏy lc 1.9 T cy thc vt 1.11 Cõn in t 1.8 T sy 1.10 Ni hp 1.12 Mỏy o pH PH LC BNG 2.1 Thnh phn húa cht mụi trng nuụi cy c bng MS Dung dch stock MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 KNO3 KH2PO4 NH4NO3 MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O H3BO4 MnSO4.4H2O CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O ZnSO4.4H2O Na2MoO4.2H2O KI FeSO4.7H2O Na2-EDTA Myo-inositol Thiamine.HCl Pyridoxine.HCl Nicotinic acid Glycine Nng (mg/ml) Nng dung dch m (g/l) 1900 170 1650 370 440 6.2 22.3 0.025 0.025 8.6 0.25 0.83 27.8 37.3 100 0.1 0.5 0.5 95 (x10) 8.5 82.5 18.5 (x20) 22 (x20) 0.31 1.115 0.00125 0.00125 0.43 0.0125 0.0415 (x20) 1.39 1.865 (x20) 0.005 0.025 0.025 0.1 Dung tớch dựng cho lớt mụi trng 20 ml 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml 2.2 nh hng ca nng MeJA khỏc lờn sinh t bo rau mỏ Nng MeJA (àM) Sinh ti (g) Sinh khụ (g) 50 6,37b 0,75b 100 5,32c 0,53c 150 4,65d 0,43c 200 2,35e 0,19d i chng 8,08a 0,92a Ghi chỳ: Cỏc ch cỏi khỏc trờn cựng mt ct ch s sai khỏc cú ý ngha thng kờ ca cỏc trung bỡnh mu vi p[...]... Nguyễn Hoàng L c và cs (201 2) đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích kháng thực vật l n khả năng tích l y asiaticoside của tế bào rau má nuôi cấy in vitro, kết luân nồng độ và thời điểm bổ sung tối ưu nhất của YE và SA để tăng quá trình sản xuất CAS l n l ợt l 4 g /L, 100 µM sau 10 ngày nuôi cấy huyền phù tế bào rau má [4] Bảng 1.3 Vai trò của các chất kích kháng l n việc sản xuất hợp chất thứ cấp... asiaticoside của tế bào rau má 3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ methyl jasmonate Để thăm dò ảnh hưởng của nồng độ MeJA l n sinh trưởng và khả năng tích l y asiaticoside của tế bào rau má, l y 3 g callus vàng rời cho vào bình tam giác có thể tích 250 mL chứa 50 mL môi trường l ng có thành phần cơ bản MS + 1 mg /L NAA + 1 mg /L BAP + 30 g /L sucrose Sau 2 tuần nuôi cấy, tiến hành thu các tế bào đồng nhất (tế bào sơ cấp)... (Euphorbia milli) sau 24 l n 17 chọn l c đã tích l y gấp khoảng 7 l n l ợng anthocyanin được tích luỹ từ nuôi cấy tế bào bố mẹ [8] 18 c Sử dụng kích kháng bảo vệ thực vật Sử dụng chất kích kháng bảo vệ thực vật có hiệu quả trong việc tăng cường sự tổng hợp các hợp chất trao đổi trong một số trường hợp, như trong sản xuất paclitaxel bằng nuôi cấy tế bào Taxus và sản xuất tropane alkaloid bằng nuôi cấy tế bào. .. nghiên cứu cho thấy khi bổ sung chất kích kháng vào môi trường nuôi cấy tế bào thực vật đều l m tăng hàm l ợng hợp chất thứ cấp tích l y được Janusz Malarz và cs (200 7) đã nghiên cứu ảnh hưởng của MeJA và SA vào sự tích l y sesquiterpene lactone trong l ng hút ở rễ cây rau diếp xoăn Cichorium intybus Kết luận bổ sung 100 µM MeJA sau 72 giờ l m tăng gấp đôi l ợng sesquiterpene lactone tích l y trong tế bào. .. của các chất dinh dưỡng và một số yếu tố khác l n sự tích l y taxol trong nuôi cấy tế bào Taxus cuspidata Srinivasan và cs (199 5) nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào của T baccata Lee và cs (199 5) đã nghiên cứu sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây T mairei, một loài được tìm thấy tại Đài Loan ở độ cao 2000 m so với mực nước biển Các dòng tế bào thu được từ callus... callus vàng rời l m nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào (Hình 3.3 C) A B Hình 3.1 Các loại callus sau 21 ngày nuôi cấy A Callus xanh B Callus vàng C C Callus vàng rời 32 3.2 Nuôi cấy tế bào L y 3 g tế bào sơ cấp (14 ngày tuổi) nuôi cấy trong bình tam giác có thể tích 250 mL chứa 50 mL môi trường cơ bản MS + 1 mg /L BAP + 1 mg /L NAA + 30 g /L sucrose Sau 24 ngày nuôi cấy, chúng tôi tiến hành thu sinh khối tế. .. trọng của chất kích kháng đối với mục đích tăng khả năng tích l y hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào [9], [15] Thời gian bổ sung chất kích kháng vào môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng tích l y hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào Tuy nhiên, để đạt được mục đích nuôi cấy, việc l a chọn thời điểm bổ sung chất kích kháng đòi hỏi phải có sự hiểu biết về con đường sinh tổng hợp các hợp chất. .. đến l m chậm sự sinh trưởng của tế bào Vì thế, nuôi cấy tế bào huyền phù thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật vì có thể duy trì và thao tác tương tự với các hệ thống l n men vi sinh vật ngập chìm trong môi trường l ng 14 1.2.2.1 Sự tích l y hợp chất thứ cấp trong tế bào nuôi cấy Nuôi cấy tế bào thực vật được nghiên cứu từ năm 1960, có rất nhiều thuận l i, và được xem như l một... dòng callus được sử dụng để nuôi cấy ở mỗi thí nghiệm l khác nhau, vì vậy khả năng tích l asiaticoside ở mỗi dòng l không giống nhau Độ hấp thụ quang (mAU) 34 Thời gian l u (phút) Độ hấp thụ quang (mAU) Hình 3.3 Phổ HPLC của asiaticoside chuẩn 1mg/mL Thời gian l u (phút) Hình 3.4 Phổ HPLC của asiaticoside đối chứng 35 3.3 Ảnh hưởng của methyl jasmonate l n sinh trưởng và khả năng tích l y asiaticoside. .. MS + 1 mg /L NAA + 1 mg /L BAP + 30 g /L sucrose+ 9g /L agar (R 3), thu callus vàng rời l m nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào 2.4.2 Nuôi cấy tế bào huyền phù L y 3 g callus vàng rời cho vào bình tam giác có thể tích 250 mL chứa 50 mL môi trường l ng có thành phần cơ bản MS + 1 mg /L NAA + 1 mg /L BAP + 30 g /L sucrose Sau 2 tuần nuôi cấy, chúng tôi tiến hành thu tế bào (tế bào sơ cấp) dùng l m nguyên liệu cho ... tài: Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích kháng thực vật methyl jasmonate lên khả tích lũy asiaticoside nuôi cấy huyền phù tế bào rau má (Centella asiatica L.) Nhằm ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực. .. NGHIÊN CỨU Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nuôi cấy mô, tế bào thực vật 1.1.1 Cơ sở khoa học việc nuôi cấy mô, tế bào thực vật 1.1.1.1 Nuôi cấy mô, tế bào thực vật gì? Nuôi cấy mô, tế bào thực vật. .. trò chất kích kháng nuôi cấy tế bào thực vật Sử dụng chất kích kháng nuôi cấy tế bào thực vật để cải thiện hiệu suất tích lũy hợp chất thứ cấp hướng phù hợp việc sản xuất tiền chất cho y học, thực

Ngày đăng: 11/04/2016, 09:37

Từ khóa liên quan

Mục lục

  • LỜI CẢM ƠN

  • DANH MỤC CÁC BẢNG

  • DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

  • DANH MỤC CÁC HÌNH

    • Phổ HPLC chuẩn 1mg/mL.

    • Phổ HPLC đối chứng.

    • Phổ HPLC của asiaticoside khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy 50 µM MeJA.

    • Phổ HPLC của asiaticoside khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy 100 µM MeJA.

    • Phổ HPLC của asiaticoside khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy 150 µM MeJA.

    • Phổ HPLC của asiaticoside khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy 200 µM MeJA.

  • PHẦN 1. MỞ ĐẦU

    • 1. Tính cấp thiết của đề tài

    • 2. Mục tiêu của đề tài

  • Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

    • 1.1. Nuôi cấy mô, tế bào thực vật

    • 1.1.1. Cơ sở khoa học của việc nuôi cấy mô, tế bào thực vật

    • 1.1.3. Môi trường nuôi cấy

    • 1.2. Hợp chất thứ cấp, ứng dụng nuôi cấy tế bào để sản xuất hợp chất thứ cấp

    • 1.2.1. Hợp chất thứ cấp là gì?

    • 1.2.2. Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất hợp chất thứ cấp

      • Trong tất cả các ngành công nghiệp, mục tiêu quan trọng nhất là giảm giá thành sản phẩm nhưng chất lượng vẫn không thay đổi hoặc tăng lên. Tất nhiên, ngành công nghiệp sản xuất nguyên liệu dược phẩm, mỹ phẩm cũng không ngoại lệ. Sự phát triển công nghệ nuôi cấy tế bào mà ở đó chúng sản xuất các sản phẩm thứ cấp với giá thành rẻ hơn với chất lượng cao đã đem lại nhiều thành quả đáng tự hào. Một số HCTC đang được sản xuất theo phương pháp này như taxol từ cây thông đỏ, curcumin ở cây nghệ đen, bilobalit từ cây bạch quả. Người ta mong đợi nhiều hợp chất có giá trị sử dụng với giá thành thấp và các sản phẩm nuôi cấy in vitro được thương mại hóa trong thời gian tới [12].

    • 1.3. Ứng dụng chất kích kháng để cải thiện hiệu suất của hợp chất thứ cấp

    • 1.3.1. Chất kích kháng

    • 1.4. Khái quát về cây rau má

    • 1.4.1. Phân loại rau má (Centella asiatica L.)

    • 1.4.2. Phân bố và đặc điểm hình thái

    • 1.4.3. Thành phần hóa học

    • 1.5. Khái quát asiaticoside

    • 1.5.1 Khái niệm

    • 1.5.2. Tính chất lý hóa của asiaticoside

    • 1.5.3. Tác dụng dược lý của asiaticoside

    • 1.5.3. Con đường sinh tổng hợp asiaticoside

  • Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

    • 2.1. Đối tượng nghiên cứu

    • Rau má (Centella asiatica L.) hay còn gọi là tích tuyết thảo, lôi công thảo, liên tiền thảo [6].

    • 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

    • 2.3.1.Nguyên liệu nghiên cứu

    • 2.3.2. Hóa chất

    • 2.3.3. Môi trường

    • 2.3.4. Trang thiết bị

    • 2.4. Phương pháp nghiên cứu

    • 2.4.1. Nuôi cấy callus

    • 2.4.2. Nuôi cấy tế bào huyền phù

    • 2.4.3. Thăm dò nồng độ và thời gian bổ sung chất kích kháng MeJA

    • 3.1. Nuôi cấy callus

    • 3.2. Nuôi cấy tế bào

    • 3.2.1. Sinh trưởng của tế bào

    • 3.2.2 Khả năng tích lũy asiaticoside của tế bào

    • 3.3. Ảnh hưởng của methyl jasmonate lên sinh trưởng và khả năng tích lũy asiaticoside của tế bào rau má

    • 3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ methyl jasmonate

  • 17. Loc N.H., and Giang N.H. (2012), Effects of elicitors on the enhancement of asiaticoside biosynthesis in cell cultures of centella (Centella asiatica L. Urban), Hue University, 66(7), pp. 642-648.

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan