PGS TS Cao Minh Nga BM Vi sinh - Khoa Y - ĐH Y Dược TP HCM I Mở đầu II Phương pháp Vi sinh học III Phương pháp Miễn dòch học IV Phương pháp Sinh học phân tử V Kết luận I Mở đầu  Vi sinh vật (VSV): - gây nhiều bệnh nhiễm nguy hiểm - gây dịch, đại dịch  Các bệnh nhiễm VSV: - thường có triệu chứng lâm sàng điển hình VD: bệnh tả, sốt xuất huyết, … - số khác: khơng có triệu chứng điển hình VD: viêm gan virus A, B, C, D, E G, …  Xét nghiệm chẩn đốn () đóng vai trò quan trọng:   (+) bệnh lý cụ thể là tiêu chuẩn vàng:  nhiều bệnh nhiễm VSV I Mở đầu (tt)  Các phương pháp (pp)  bệnh nhiễm VSV chính: - pp vi sinh học: soi, nhuộm, cấy - pp miễn dịch học: phản ứng kháng ngun – kháng thể - pp sinh học phân tử: phát gen đặc hiệu  Các pp   (sinh hóa, huyết học, giải phẫu bệnh, … )  Cần chọn lựa pp thích hợp tùy loại bệnh lý, giai đoạn bệnh  , theo dõi diễn tiến bệnh nhiễm VSV II Phương pháp Vi sinh học  Quan sát trực tiếp: Soi tươi Nhuộm  Ni cấy vi vi khuẩn (VK): Ni cấy - Phân lập VK Kháng sinh đồ  Ni cấy virus Định danh Định typ huyết thanh, … II PP Vi sinh học (tt)  Quan sát trực tiếp: Soi tươi: phát VSV sống, di động VD: VK tả, VK giang mai, Leptospira Nhuộm: nhiều pp - nhuộm Gram: quan sát hình thể & cách bắt màu Gram VK II PP Vi sinh học (tt)  Quan sát trực tiếp: Soi tươi Nhuộm: - nhuộm Gram - Nhuộm kháng acid - Nhuộm bạc: M tuberculosis phết nhuộm Legionella_Silver_Stain II PP Vi sinh học (tt)  Quan sát trực tiếp  Ni cấy vi khuẩn: Ni cấy  phân lập VK: mơi trường thích hợp Mơi trường BA - S aureus Mơi trường EMB - E coli II PP Vi sinh học (tt)  Quan sát trực tiếp  Ni cấy vi khuẩn: II PP Vi sinh học (tt)  Quan sát trực tiếp  Ni cấy vi khuẩn: Phân lập VK Kháng sinh đồ: 2.1 Phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Kirby Bauer) III PP Sinh học phân tử (tt) Ứng dụng  bệnh nhiễm VSV (tt): 1.1 Phát VSV gây bệnh  Xác định tác nhân gây bệnh VD: HCV (1989), HGV (1995), virus SARS (2003), …  VSV khơng thể khó ni cấy thường qui  virus: HBV, HCV, HIV, HPV, …  VK: Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, … III PP Sinh học phân tử (tt) Ứng dụng  bệnh nhiễm VSV (tt): 1.1 Phát VSV gây bệnh (tt)  VSV cho KQ chậm / ni cấy: M tuberculosis  VSV khó ni cấy có / BP,  KS - Lao thất bại ni cấy, - Viêm màng não mủ, lậu  KS Phát sản phẩm PCR/  lao • • • • Điện di gel agarose (1,5%) Nhuộm ethidium bromide (10mg%) Đo thang DNA (DNA ladder) Sản phẩm PCR có kích thước 450 bp và/ 225 bp T 10 Giếng T: Thang chuẩn 100bp Giếng 1-8: Mẫu (+) MTB Giếng 9-10: Mẫu (-) MTB III PP Sinh học phân tử (tt) Ứng dụng  bệnh nhiễm VSV (tt): 1.2 Định lượng VSV gây bệnh  Đánh giá tình trạng bệnh lý Vd: HCV, HBV, …  Theo dõi điều trị Vd: HCV, HBV, HIV, …  Phát sớm kháng thuốc điều trị Vd: HBV, HIV, … Real-Time PCR Là kỹ thuật PCR sử dụng chất huỳnh quang để phát & đònh lượng nhiều trình tự DNA đích phản ứng PCR III PP Sinh học phân tử (tt) Ứng dụng  bệnh nhiễm VSV (tt): Phát gen sinh độc tố VSV gây bệnh  Gen mã hóa cho độc tố LT E coli  Gen mã hóa cho độc tố SEA, SEB S aureus (pp Multiplex PCR)  Gen mã hóa cho độc tố CT V cholerae … III PP Sinh học phân tử (tt) Ứng dụng  bệnh nhiễm VSV (tt): Xác định kiểu gen (genotype) VSV gây bệnh  Định typ dựa trình tự nucleic acid: Sự khác biệt >10% : loại (type) – 10%: thứ type (subtype) < 2% : biến thể (variant) VD: - HCV có genotyp (1-6), - HPV có 100 genotype, … * Real-time RT-PCR xác định Genotype HCV Đọc KQ: Genotype HCV Mẫu Chứng âm Nếu mẫu dương tính (có chu kỳ ngưỡng vượt qua Threshold Position) với probe Reverse Dot-Blot xác đònh genotype HPV • Nguyên lý: - PCR phát HPV-DNA: dùng cặp primer (181 bp)  gen L1 / HPV genome (trình tự đích) - Lai phân tử: sản phẩm PCR đánh dấu + mẫu dò đặc hiệu cho 24 typ HPV cố đònh sẵn / màng lai nylon + typ Low-risk : 6, 11, 42, 43, 61, 70, 71 & 81 + 16 typ High-risk: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 82 - Phản ứng tạo màu: (+) tính Ngun tắc phương pháp lai Reverse Dot blot (Lai phân tử) Reverse Dot-Blot xác đònh genotype HPV • Đọc kết màng lai: Từ sơ đồ typ màng lai hộp RDB biết => Đọc kết quả: đònh genotype HPV Ví dụ: Chứng +: Dương tính Mẫu đồng nhiễm type 6, 11, 81, 16, 18, 33, 58, 66, 68 III PP Sinh học phân tử (tt) Ứng dụng  bệnh nhiễm VSV (tt): Xác định gen kháng thuốc VSV gây bệnh  Lao: PCR phát đột biến (ĐB) - kháng rifamicin / gen rpoB - kháng INH thiếu gen catalase (gen Kat G)  Staphylococcus aureus: Multiplex PCR phát gen kháng methicillin  Streptococcus pneumoniae: pp PCR-SSCP khảo sát đột biến kháng penicillin / gene pbp 2X III PP Sinh học phân tử (tt) Ứng dụng  bệnh nhiễm VSV (tt): Xác định gen kháng thuốc VSV gây bệnh (tt)  HBV: phát ĐB kháng Lamivudin, kháng Adefovir, …  HIV: phát ĐB kháng thuốc khác … pp: Real-Time PCR, PCR-RFLP, Sequencing III PP Sinh học phân tử (tt) Ứng dụng  bệnh nhiễm VSV (tt): Xác định kiểu gen ký chủ VD: Đối với bệnh nhân viêm gan C  phát điểm đa hình đơn nucleotide (SNP – Single Nucleotide Polymorphism) nằm gần gen IL28B nhiễm sắc thể 19 người  KQ: - Kiểu gen đáp ứng thuốc tốt: đồng hợp tử - Kiểu gen đáp ứng thuốc kém: dị hợp tử V Kết luận  Có nhiều pp chẩn đốn xác định bệnh nhiễm VSV  Cần chọn lựa pp chẩn đốn phù hợp với: - tình trạng bệnh lý - mục đích chẩn đốn - điều kiện trang thiết bị, tay nghề nhân viên - tình hình nhu cầu thực tiễn  Nâng cao hiệu quả: chẩn đốn & điều trị bệnh, kiểm sốt dịch bệnh [...]... định MIC bằng phương pháp pha lỗng 104 cfu mg/ml 4 2 1 0,5 0,25 0,12 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) = 0,5mg/ml (Minimum inhibitory concentration - MIC) 0 II PP Vi sinh học (tt)  Quan sát trực tiếp  Ni cấy vi khuẩn  Ni cấy virus:  Định danh bằng kỹ thuật Miễn dịch hoặc Sinh học phân tử II Phương pháp Miễn dòch học  Khái niệm  Phân loại  Các phản ứng miễn dịch (MD) thường dùng trong Vi sinh lâm sàng:... IF) VD:  RSV, thể négri / bệnh dại, Chlamydiae, … * Đếm tế bào dòng chảy (flow cytometry): đếm & phân loại TB 2 MD men (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA) VD:  HBV, HCV, HIV, Rubella, … 1 PƯ MD huỳnh quang: nguyên lý Định týp virus DEN bằng IF với KT đơn dòng (thuốc nhuộm fluorescein) Virus sởi tạo hợp bào từ các tế bào Vero bị nhiễm Chất huỳnh quang gắn vào KT kháng virus sởi đã biết (thuốc... representing the course of acute rubella infection from the time of initiation of the infection by droplet spray III Phương pháp Sinh học phân tử (khuếch đại đoạn gen đặc hiệu)  Mở đầu: - 1985: Kary Mullis California, USA - 1993: giải Nobel Hóa học  Ứng dụng kỹ thuật SHPT trong chẩn đốn bệnh nhiễm VSV ... (Ouchterlony) - MD điện di (Immuno electrophoresis ) 20 Ngưng kết: - trực tiếp - gián tiếp - ngưng kết vi khuẩn 10 3 50 0,5 0,001 0,001 Cố định bổ thể (CF) 0,1 Miễn dịch huỳnh quang (IF) 0,1 Định lượng MD phóng xạ (RIA) 0,0001 Định lượng MD enzym (EIA) 0,0001 II PP Miễn dòch học (tt)  Các phản ứng MD thường dùng / Vi sinh lâm sàng: A Phản ứng ngưng kết (agglutination reaction): - Ngưng kết: nhóm máu, nhóm VKĐR,... lượng KN hoặc KT hòa tan / dòch sinh học * Nguyên lý cơ bản: KT/pha rắn + KN/mẫu + KTE + Subtrate KN/pha rắn + KT/mẫu + Kháng KTE + Subtrate  màu: So màu (mắt / máy đo OD) * Kỹ thuật thực hiện: - "Cạnh tranh” - "Không cạnh tranh" a.MD Cạnh tranh ELISA: Phản ứng màu tỉ lệ nghịch với nồng độ kháng thể ỏ TMB  ỏ H2SO4 E E E E E E E E E E E E E E E b ELISA theo phương pháp “sandwich” c ELISA “Tóm bắt”:... (agglutination reaction): KN hữu hình B Phản ứng dựa trên hoạt động sinh học của KT: 1 Kết hợp bổ thể (complement binding reaction) 2 Trung hòa (neutralization reaction) C Phản ứng MD đánh dấu: 1 MD huỳnh quang (immunofluorescence reaction) 2 MD men (enzyme linked immunosorbent assay – ELISA) 3 MD phóng xạ (radio immmuno assay - RIA) Các phản ứng MD có độ nhạy khác nhau Loại phản ứng MD Ngưỡng phát... II PP Miễn dòch học (tt)  Nhận định kết quả: 1 Độ nhạy (ngưỡng phát hiện hàm lượng KN & KT): Mỗi phản ứng có ngưỡng phát hiện  nhau  nên định lượng 2 Hiệu giá ranh giới: ranh giới giữa bình thường & bệnh lý VD: hiệu giá ranh giới của ASLO là 1:200 (200 đơn vị/ml huyết thanh)  (+) khi  400 đ.v/ml II PP Miễn dòch học (tt)  Nhận định kết quả (tt): 3 Kết quả (+) tính giả:  thường dùng nhiều phản... Miễn dòch học (tt)  Khái niệm: 1 ĐN: Là phản ứng kháng ngun - kháng thể (KN - KT) 2 Mục đích: Xác định hoặc / và - chuẩn độ một KN - định lượng hiệu giá một KT - đo lường một phức hợp KN-KT - đo lường các nhân tố  tham gia / hệ thống MD VD: kiểm tra hoạt tính của bổ thể • Điểm quyết định KN (epitope): phần trên phân tử KN có khả năng liên kết đặc hiệu vào phần liên kết với KN trên phân tử KT Kháng