1 Bài 1: CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT 1.1 Khái quát Muốn có sản phẩm tốt, quy trình công nghệ khâu giống quan trọng nhất, định chất lượng sản phẩm giá trị kinh tế quy trình công nghệ sản xuất Trong công nghệ lên men, người ta sử dụng rộng rãi nhiều loại vi sinh vật thuộc nhóm Prokaryote (vi khuẩn, xạ khuẩn, vi khuẩn lam) nhóm Eukaryote (nấm men, nấm mốc, tảo) Quá trình chọn lọc giống vi sinh vật bao gồm: - Phân lập từ tự nhiên, Gây đột biến, Phát dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn, Bảo quản giống Việc phát dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn dựa vào: - Chất chuyển hóa tạo ra: ví dụ kháng sinh, sắc tố, … Enzym ngoại bào tác động lên chất môi trường Sự thay đổi đặc tính sinh trưởng vi sinh vật Sự thay đổi hình thái Một chủng giống vi sinh vật dùng cho công nghiệp cần phải đáp ừng nhu cầu sau: - Chủng vi sinh vật phải thuần, không chứa vi sinh vật gây nhiễm khác - Phải đảm bảo khả tạo thành sản phẩm với suất cao, chất lượng tốt, không tạo sản phẩm phụ không mong muốn - Khả sử dụng nguyên liệu dễ kiếm rẻ tiền Trên chất vi sinh vật phải mọc nhanh sản sinh lượng lớn sinh khối ổn định Khả tách dễ dàng tế bào hay sản phẩm tạo qua trình lên men - Phải thể tính không mẫn cảm với vi sinh vật tạp nhiễm thực khuẩn thể - Cùng với thời gian chủng sản xuất phải bảo toàn đặc tính hoá sinh ban đầu - Chủng vi sinh vật có khả thay đổi đặc tính kỹ thuật đột biến, kỹ thuật gen đểkhông ngừng nâng cao suất 1.2 Một số phương pháp bảo quản giống: Có nhiều phương pháp bảo quản giống vi sinh vật, cách hoàn hảo Việc lựa chọn cách bảo quản vi sinh vật thường mang tính kinh nghiệm a Giữ giống thạch Cấy chuyền định kỳ vi sinh vật sang môi trường Phương pháp hay áp dụng tốn nhiều công sức dẫn đến thoái hóa chủng Khi sử dụng phương pháp cần ý thành phần môi trường để tránh thoái hóa chủng Giống bảo quản nhiệt độ phòng – 0C Thời gian cấy chuyền thường từ tuần đến tháng, tùy theo chủng b Giữ giống lớp dầu khoáng: Khi giữ giống – 0C, môi trường thường có tượng bị khô làm giống bị chết giảm hoạt tính Để khắc phục người ta cho lên bề mặt môi trường lớp dầu trơ (dầu khoáng, parafin, vaselin, …) Thực sau: giống sau chọn lọc nuôi cấy môi trường đặc lỏng điều kiện tối ưu đến giai đoạn logarit đến bào tử chín Sau phủ lớp dầu khoảng 10 mm bề mặt môi trường, gắn kín nút parafin Giữ nhiệt độ phòng – 0C Dưới lớp dầu khoáng, vi sinh vật trì sống chủng hiếu khí sinh trưởng với tốc độ chậm Và trình bảo quản lấy chủng cách chọc que cấy qua lớp dầu mà không làm hỏng tình trạng chủng Cách giữ chủng lâu, lên đến nhiều năm, phải nghiên cứu điều kiện môi trường để đảm bảo dự trữ dinh dưỡng chống sản phẩm chuyển hóa hay acid tạo trình sinh trưởng Thường chọn môi trường giàu protein có lượng đường tối thiểu c Giữ giống cát: Phương pháp thường áp dụng cho việc bảo quản bào tử Do đặc tính chủng có khả chịu đựng điều kiện khắc nghiệt gặp điều kiện thuận lợi nảy mầm thành dạng dinh dưỡng Thực cách: cát sông rửa nước cho bụi, rửa cách đun với HCl rửa lại nước Rây để lấy hạt mịn Sấy khô cát 120 0C – Phân thành liều nhỏ ống nghiệm tiệt trùng tủ sấy 160 – 180 0C – 120 0C hai lần cách ngày, lần Kiểm tra độ vô trùng cát Chủng nuôi cấy đến bào tử chín, đổ cát trùng vào cho bào tử bám vào cát Đổ cát có dính bào tử vào ống nghiệm khô vô trùng, hút kiệt ẩm nút kín Bảo quản nhiệt độ phòng – 0C d Đông lạnh: Là làm lạnh ống môi trường chứa vi sinh vật phát triển từ từ đến độ lạnh sâu -20 đến -30 0C, tốt -80 0C Khi làm lạnh cần ý tốc độ làm lạnh thích hợp phải thêm tác nhân bảo vệ chống đông thích hợp glycerin (10 – 15%), sữa (~5%), lòng trắng trứng, … Tùy độ lạnh mà thời gian bảo quản khác nhau, -20 0C, khoảng tháng, -80 0C khoảng 10 năm Khi cần sử dụng làm tan băng cách lấy chủng đặt vào bếp cách thủy 37 0C Không làm tan băng nhiều lần Hoặc dùng que cấy cứng cạo lấy vi sinh vật đông đá cấy lên môi trường thích hợp, phần lại trả nhanh tủ đông e Đông khô: Là trình làm khô áp suất (>1 mbar) nhiệt độ thấp (dưới nhiệt độ đông đặc mẫu) Ở nhiệt độ áp suất đủ thấp, nước đá mẫu thăng hoa Do nước lấy từ dạng rắn thành dạng nên nồng độ chất tan mẫu không tăng dần lên lúc bay từ dạng lỏng, nên ảnh hưởng đến chất lượng sinh học mẫu, đồng thời mẫu khô có cấu trúc xốp, dễ dàng lấy lại trạng thái ban đầu thêm nước vào Mẫu sau đông khô bảo quản nhiệt độ phòng thời gian dài Phương pháp đắt tiền cho phép bảo quản giống tốt, cho khả phục hồi cao mà ảnh hưởng đến hoạt tính NỘI DUNG THỰC TẬP 1.3 Chuẩn bị mẫu Tiến hành: lấy mẫu đất pha loãng với NaCl 0.85% từ huyền dịch ban đầu thành cấp độ pha loãng tương ứng 10 -1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 Lấy eppendorf có độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6 trải đĩa 1.3.1 Phân lập chủng có amylase ngoại bào Lấy 100 µldịch từ độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6 trải đĩa thạch có chứa tinh bột, đánh số tương ứng cho đĩa thạch (A4, A5 A6); Đem ủ 37oC/ 24h 1.3.2 Phân lập chủng có prolase ngoại bào Lấy 100 µl dịch từ độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6 trải đĩa thạch có chứa gelatin, đánh số tương ứng cho đĩa thạch (P4, P5 P6); Đem ủ 37 oC/ 24h 1.3.3 Xác định khả kháng khuẩn vi sinh vật: Các chủng thử nghiệm E.coli, S.aureus a Phương pháp khếch tán (kỹ thuật đục lỗ): Trải vi khuẩn E.coli / S.aureuslên mặt thạch Đục lỗ lỗ thạch Nhỏ vào lỗ dịch chứa: chủng vi khuẩn B1, B2, B3, B4 lỗ chứng chứa môi trường Để yên để chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch Ủ 37oC 16 – 18 Đọc kết b Phương pháp khếch tán (kỹ thuật đường kẽ vuông góc): - Bước 1: Kẻ đường vuông góc vối chủng cần kiểm tra (cách tồi thiểu 0.2 mm, chủng thử nghiệm cách tối thiểu cm - Bước 2: Dùng que cấy chủng thử nghiệm lên đĩa thạch môn cấy cấy sẵn chủng kiễm tra - Bước 3: Ủ 37oC 16 – 18 1.4 Phát vi sinh vật có đặc tính mong muốn a Phát Amylase ngoại bào Vi sinh vật từ mẫu đất sau cấy thạch tinh bột, đem ủ phát triển Khi đem tráng bề mặt môi trường với dung dịch Lugol (iod) môi trường có màu tím than màu iod với tinh bột Chủng vi sinh vật có sinh amylase ngoại bào xung quanh chỗ vi sinh vật có vòng suốt quanh khóm khuẩn lạc; amylase sinh thủy phân tinh bột b Phát Protase ngoại bào Vi sinh vật từ mẫu đất sau cấy thạch gelatin, đem ủ phát triển Khi đem tráng bề mặt môi trường với dung dịch TCA 50% môi trường đục gelatin bị tủa Chủng vi sinh vật có sinh protease ngoại bào xung quanh khóm khuẩn lạc có vòng suốt; gelatin bị protese sinh thuỷ phân 1.5 KẾT QUẢ THỰC TẬP a Các chủng amylase ngoại bà: có loại khóm đĩa Bảng 1.1:Mô tả khóm vi khuẩn khả sinh Amylase ngoại bào T T Khả sinh amylasengoại bào Mô tả khóm Khuẩn lạc tròn, lồi – không phẳng, màu vàng nhạt,đường kính – 10 cm, bìa cưa Khuẩn lạc trong, màu trắng, tròn, lồi, đường kính – 10 mm, bìa tròn Khóm màu vàng nhạt phẳng, bìa cưa, đường kính khoảng mm b Protease ngoại bào: có loại khóm đĩa không Không Có Bảng 1.2:Mô tả khóm vi khuẩn khả sinh Protease ngoại bào T T Khả sinh Protease Mô tả khóm ngoại bào Khóm màu vàng nhạt, lồi, khô, bìa xẻ thuỳ sâu, đường kính khoảng – mm Khóm màu vàng nhạt, tròn lồi, bìa không cưa, đường kính khoảng - 10 mm Khóm màu vàng nhạt phẳng, bìa cưa, đường kính khoảng mm c Xác định khả kháng khuẩn vi sinh vật Không Có Không Bảng 1.3:Khả kháng khuẩn E.coli S.aureus – pp đục lỗ Chủng E.coli B1 Có Vòng kháng khuẩn xung quanh B2 B3 không không B4 Có S.aureus Kết luận: Không Không Có Không • E.coli có khả sinh kháng sinh kháng lại chủng vi khuẩn B1, B4 • S.aureus có khả sinh kháng sinh kháng lại chủng vi khuẩn B3 Bảng 1.4: Khả kháng khuẩn E.coli S.aureus – pp đường kẻ vuông góc Chủng E.coli S.aureus Kết luận: Chủng kiểm tra (Bộ môn cấy trước) Mọc bình thường Khoảng suốt cách chủng kiểm tra khoảng cm • E.coliKhông nhạy cảm • S.aureusCó nhạy cảm 1.6 TRẢ LỜI CÂU HỎI Kể tên nêu nguyên tắc số phương pháp phát đặc tính mong muốn thực nghiệm Để chọn giống vi sinh vật chủng, bước phân lập chúng từ nguồn tự nhiên như: nước, không khí, đất, mô động thực vật, vật liệu hữu vô cơđã bị phân huỷ nhiều Theo kỹ thuật vi sinh vật cổ điển, việc phân lập chủng khiết nhiều công sức chậm Ngày người ta dùng phương pháp “sàng lọc” vừa nhanh vừa có hiệu Nguyên lý phương pháp là: Trước hết người ta kiểm tra sơ hỗn hợp giống vi sinh vật từ mẫu tự nhiên nhưđất nước, cỏ chẳng hạn…làm huyền phù pha loãng 1/10 đến 1/100 từ đất, gieo mặt hộp petri đựng môi trường thạch dinh dưỡng cấy chủng vi sinh vật kiểm định có tác dụng đối kháng Chỉ có chất đất sinh chất đối kháng với chủng kiểm định, nghĩa có tính chất kháng sinh sau nuôi tạo vùng ức chế đặc hiệu đĩa thạch Ta tách khuẩn lạc chủng đem nuôi cấy, thử chất sinh xác định Cũng đơn giản đặt mẫu đất lên điểm khác mặt thạch dinh duỡng (nếu muốn tìm vi khuẩn) thạch khoai tây (nếu muốn tìm nấm) có chủng kiểm định nuôi cấy từ trước Giữ đĩa thạch 28-37 oC khoảng ngày, quan sát vùng bị ức chế định công việc phân lập chủng vi sinh vật có tác dụng Phương pháp “sàng lọc” cho phép nhanh chống xác định tính kháng khuẩn kháng nấm virus kháng ung thư chủng phân lập Phương pháp thường dùng hai kiểu kỹ thuật: - Lấy mẫu thử để khảo sát tác dụng với nhiều chủng kiểm định - Lấy nhiều mẫu thử để khảo sát tác dụng với chủng kiểm định Cấy chủng phân lập đường vạch mặt thạch dinh dưỡng hộp petri Sau cấy chủng kiểm định theo đường song song vuông góc 30với đường vạch chủng nghiên cứu Đặt hộp petri vào tủ ấm với nhiệt độ thích hợp với chủng kiểm định Tác dụng kháng sinh mẫu thử xác định vùng mặt thạch không bị mờ giao điểm đường cấy chủng bị ức chế Phương pháp chủ yếu sử dụng việc tìm chủng sản xuất chất kháng sinh Từ nguyên lý phương pháp cải tiến ngày phong phú Để chọn chủng sản xuất acid amin người ta sử dụng kiểu chọn lọc theo kỹ thuật penicilin Trong phương pháp điều kiện lựa chọn cho tế bào hoang dại phát triển môi trường dinh dưỡng thiếu acid amin bị giết chết pennixilin Chúng ta biết, penicilin có tác dụng lên tế bào sinh trưởng Các tế bào cần acid amin không sinh trưởng nên sống sót Đối với vi khuẩn mẫn cảm với penicilin dùng chất kháng sinh khác Để phân lập chủng có tính chất đặc biệt (như chuyển hoá steroit), người ta dùng hỗn hợp nhiều chủng vi sinh vật đem nuôi cấy môi trường có chất mà ta muốn thực biến đổi Sau nuôi ta chiết xuất sản phẩm, phân tích theo phương pháp sắc ký BÀI 3: ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CÓ LỢI CỦA VI KHUẨN PROBIOTIC 3.1 Khái quát Bên cạnh tiêu chuẩn tính an toàn, tính đề kháng kháng sinh chứa năng, vi sinh vật (VSV) lựa chọn làm probiotic phải đáp ứng yêu cầu d9a8c4 điểm sinh học như: (i) khả sống sót qua ống tiêu hoá vật chủ, (ii) đặc điểm công nghệ ảnh hưởng yếu tố lý hoá tác đọng đến probiotic suốt trình lên men bào chế Khi sử dụng đường uống, hai yếu tố tác động trực tiếp đến dân số probiotic pH, acid dịch vị thành phần muối mật dịch vị NỘI DUNG THỰC TẬP - Chủng thử nghiệm thực tập tế bào sinh dưỡng bào tử Bacillus SubtilisPY79 Đánh giá tỷ lệ sống sót VSV probiotic dịch vị nhân tạo pH khác Đánh giá tỷ lệ sống sót VSV probiotic dịch mật nhân tạo nồng độ muối mật khác KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Đánh giá khả chịu dịch vị nhân tạo a Tế bào sinh dưỡng: Thời gian (phút) Nồng độ VSV pH Đối chứng MT pH MT pH 103 60 10 13 90 104 10 b Bào tử Thời gian (phút) Nồng độ VSV - 60 103 90 10 pH Đối chứng MT pH MT pH - - Nhiễm Nhiễm 30 62 Nhận xét: ????? Đánh giá khả chịu muối mật a Tế bào sinh dưỡng Thời gian (phút) Nồng độ VSV 104 Nồng độ muối mật Đối chứng 0.3% 0.5% 72 - - 60 10 13 18 120 103 Nhiễm Nhiễm b Bào tử Thời gian (phút) Nồng độ VSV 60 120 Nồng độ muối mật Đối chứng 0.3% 0.5% 104 96 - - 104 Nhiễm 111 109 Nhiễm 134 112 10 |Nhận xét: Khả sống sót VSV dạng bào tử cao nhiều so với tế bào sinh dưỡng nồng độ muối mật khảo sát: Nồng độ muối mật 0,5% B subtilis dạng bào tử sống sót tương nồng độ 0,5% Theo thời gian khảo sát B subtilis dạng bào tử khả sống chịu cao Ngược lại dạng tế bào sinh dưỡng B subtilis xét khả chống chịu muối mật không cao Nếu để tế bào muối mật lâu số lượng tế bào klho6ng khả sống sót (xét độ pha loãng 104) BÀN LUẬN KẾT QUẢ Mật độ dân số VSV lý thuyết 108 CFU/ml Qua thực nghiệm trải đếm sốngở độ pha loãng 104 nhận thấy: - Cứ 100l có 96 khóm khuẩn lạc  ml có 960 VSV; Trong mẫu ban đầu ước lượng tương đối khoảng 0.96.107 VSV B subtilis dạng bào tử sống sót tốt muối mật khảo sát 10 - Khả chịu đựng pH acid mật (trong thí nghiệm thực hành) số lượng giảm 2/3 so với mẫu chứng ban đầu.Bài 4: TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT 4.1 Khái quát Enzym amylase có ứng dụng quan trọng công nghiệp, thực phẩm, y dược Trong năm gần amylase sử dụng nhiều rộng rãi y học để sản xuất gluose làm dịch tiêm truyền, chuyển hóa tinh bột thành dextrin, tinh bột tan làm tá dược bào chế để sản xuất số thuốc Enzym amylase thu nhận từ động vât, vi sinh vật thực vật, nhiên enzym để ứng dụng y dược cần trải qua bước tinh chế từ enzym thô Có nhiều phương pháp sử dụng để tinh chế enzyme kết tinh, sắc ký điện di Enzym amylase tinh chế dung dịch sodium alginate 2% (trong đệm CH3COONa 0,2M pH = 4,8) với tỉ lệ 1:5 Enzym bám bề mặt sodium alginate 2% bị kết tủa ion hóa trị II, giải amylase vào dung dịch dung dịch glucose 2% Để đánh giá hiệu trình tinh chế, người ta dựa vào tiêu chuẩn: xác định hàm lượng protein (cơ chất enzyme) cách đo độ hấp thu OD 280 xác định hoạt tính enzyme thông qua xác định hoạt độ enzyme_tức lượng enzyme có khả phân giải mg tinh bột sau 15 phút 300C NỘI DUNG THỰC TẬP + Thu enzym amylase từ nguyên vật liệu khoai lang + Tinh chế amylase + Xác định hoạt lực enzym thu 4.2 Qui trình tiến hành a Chuẩn bị enzyme thô ( Bộ môn chuẩn bị sẵn) Tế bào phá vỡ phương pháp học (xay), chiết amylase đệm phosphat Loại tạp thô (các mảnh tế bào) rây Loại tinh bột (để lắng gạn lọc lấy phần dịch) Lọc phần dịch lần qua giấy để loại hoàn toàn tinh bột 14 Dựa vào chất liên kết chất mang enzym, người ta phân loại phương pháp cố định enzym sau: - Phương pháp vật lý: hấp phụ, liên kết ion… Phương pháp liên kết cộng hóa trị: dựa vào lực enzym chất mang - để tạo phức enzym-chất mang liên kết cộng hóa trị Phương pháp bắt giữ enzym vào khuôn gel: dựa nguyên tắc bắt giữ enzym vào mạng lưới mà chất sản phẩm qua - không cho enzym khuếch tán vào môi trường Phương pháp tạo vi nang: enzym giữ bao vi thể có màng bán thẩm dày 200 Å (cellulose, polysaccarid) • a b c Nội dung thực tập Cố định CGTase lên chất mang phương pháp bắt giữ hấp phụ Xác định hàm lượng protein cố định theo phương pháp Bradford Xác định hoạt tính CGTase cố định theo phương pháp Kaneko 5.2 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 5.2.1 Kết xác định hàm lượng protein cố định theo phương pháp Bradford Bảng 5.1: Dữ liệu xây dựng đường chuẩn theo nồng độ protein chuẩn Ống nghiệm Nồng độ BSA (μg/ml) ∆OD595 nm 0 10 0.098 20 0.159 30 0.223 40 0.260 50 0.338 Hình 5.1: Đường chuẩn định lượng protein theo phương pháp Bradford 5.2.2 Xác định hàm lượng protein chế phẩm CGTase protein cố định a Xác định hàm lượng protein ezyem tự Bảng 5.2: Hàm lượng protein chế phẩm CGTase 15 Hệ số pha loãng n 100 ∆OD 595 nm 0.204 Nồng độ protein (µg/ml) (0.204-0.0197)/0,0064 Hàm lượng protein 100*28.80* 10-3*2 ml = 28.80 = 5.76 chế phẩm CGTase (mg/ml) b Xác định hàn lượng protein theo phương pháp bắt giữ hấp phụ • Công thức tính hàm lượng protein có 1ml enzym: mg protein/ml enzym= n*x*10^-3 Trong đó: N: Hệ số pha loãng X: Nồng độ protein có mẫu thử (ug/ml) Suy từ đồ thị Hàm lượng protein cố định tính theo công thức: mpr cố định = mpr ban đầu - mpr không cố định • Hiệu suất cố định protein tính theo công thức: H% = x 100 (%) • Bảng 5.3: Hàm lượng protein cố định theo phương pháp bắt giữ hấp phụ Phương pháp bắt giữ Dịch lọc Dịch rửa 0.250 0.127 Hệ số pha loãng n ∆OD595 Nồng độ protein 35.984 (μg/ml) Thể tích V (ml) 32 Hàm lượng protein 2.304 V ml (mg/ml) Hàm lượng protein không cố cố định (mg) Hiệu suất cố định protein (%) 16.766 38.170 14.734 18 22 19 0.306 1.672 0.285 định 2.304+0.306 = 2.610 (mg/ml) Hàm lượng protein Phương pháp hấp phụ Dịch lọc Dịch rửa 0.264 0.114 1.672 + 0.285 = 1.957 3.150 3.803 54.69 66.02 16 Nhận xét: bố sung 5.2.3 Xác định hoạt tính enzyme chế phẩm enzyme cố định a Xây dựng đường chuẩn cyclodextrin Bảng 5.4: Dữ liệu xây dựng đường chuẩn cyclodextrin Số thứ tự Nồng độ β-CD (mg/ml) OD550 ∆OD550 Hệ số góc (a) 0 0 0.0187 0.043 0.037 0.098 0.075 0.138 0.112 0.159 0.150 10 0.184 0.187 Hình 5.2: Đường chuẩn Cyclodextrin b Xác định hoạt tính enzyme ban đầu • • ∆OD = OD chứng – OD thử Hoạt tính CGTase ml dung dịch CGTase (U/ml) A= Trong đó: - n: Hệ số pha loãng - a: Hệ số góc cảu đường chuẩn nồng độ CD theo mật độ quang - t: Thời gian phản ứng - M: Khối lượng riêng CD (M = 1135) - 10: Tỷ lệ ezym phản ứng: 1ml/0.1 ml = 10 (0.1 ml enzym tham gia phản ứng) Hoạt tính riêng enzyme hoạt tính enzym 1mg protein • Hoạt tính riêng enzyme tự HTR enzyme tự (U/mg protein) • Hoạt tính riêng enzyme cố định HTR enzyme CĐ (U/mg protein CĐ) • Tỉ lệ hoạt tính enzyme cố định so với enzyme tự do: TLHT (%) Bảng 5.5: Hoạt tính CGTase Hệ số pha loãng n 40 17 OD chứng OD thử ∆OD Khối lượng riêng CD Thời gian phản ứng t (phút) Nồng độ CD (mg/ml) Hoạt tính CGTase ml 0.406 0.192 0.214 1135 15 10.90 dung dịch CGTase (U/ml) Hoạt tính CGTase (U/mg protein) 0.256 0.044 c Xác định hoạt tính enzyme cố định Nồng độ CD: suy từ phương trình hồi quy Hoạt tính chung : A = Bảng 5.6: Hoạt tính chung enzyme cố định phương pháp bắt giữ hấp thụ Nội dung Phương pháp bắt giữ Phương pháp hấp phụ Enzyme 10 hạt 10 hạt OD chứng 0.355 0.367 OD thử 0.188 0.317 ∆OD 0.167 0.05 Nồng độ CD 8.385 2.128 4.9 x 10^-3 1.25 x 10^-3 Hoạt tính chung enzyme cố định d Xác định hoạt tính riêng Bảng 5.7: Hoạt tính riêng enzyme theo phương pháp bắt giữ hấp phụ Enzyme tự Hoạt tính chung Hàm lượng protein cố định (mg/ml) Hoạt tính riêng cố 0.044 Enzyme cố định Phương pháp bắt giữ Phương pháp hấp phụ ^-3 4.9 x 10 1.25 x 10^-3 5.76 3.150 3.803 7.64 x 10^-3 1.56 x 10^-3 3.29 x 10^-4 18 định Tỉ lệ hoạt tính 0.2 0.04 5.3 TỔNG KẾT Bảng 5.7: So sánh hoạt tính enzyme cố định enzym phương pháp bắt giữ hấp thụ Phương pháp Thời gian Hiệu suất cố định protein Tỉ lệ hoạt tính (6 hạt) Bắt giữ Nhanh 54.69 0.2 Hấp phụ Chậm 66.02 0.04 5.4 TRẢ LỜI CÂU HỎI 5.4.1 Nguyên tắc phương pháp xác định hoạt tính CGTase - Xác định hoạt tính CGTase phương pháp Kaneco - Nguyên tắc: Hoạt tính CGTase đánh giá thông qua lượng cyclodextrin CGTase tạo từ malatosedextrin điều kiện xác định Dựa vào khả hấp phụ màu phenolphtalein cyclodextrin, ta xác định cyclodextrin tạo thành 5.4.2 Vẽ sơ đồ quy trình cố định CGTase Cố định enzym phương pháp bắt giữ ml enzyme + 15 ml alginate 2% Nhỏ từ từ hỗn hợp enzym alginat vào 30 ml dung dịch CaCl2 0,2 M Lọc thu hạt gel Ca-alginate-enzym Thu dịch lọc xác định thể tích Rửa gel Calci alginat – enzym với lần đệm Tris-HCl, lần 10 ml 19 Thu hạt gel Thu dịch rửa, xác định thể tích Xác định hàm lượng hiệu suất protein cố định Xây dựng đường chuẩn Cprotein(µg/ml) = f(OD595) Xác định hàm lượng protein chế phẩm CGTase Xác định hàm lượng protein dịch rửa Tính toán hàm lượng protein cố định Xác định hoạt tính CGTase cố định Xây dựng đường chuẩn ∆OD550 = f(Cβ-CD(µg/ml)) Xác định hoạt tính CGTase ban đầu Xác định hoạt tính CGTase cố định Nhận xét Tỉ lệ hoạt tính enzym trước – sau cố định phương pháp bắt giữ Cố định enzym phương pháp hấp phụ Dùng ống nhỏ giọt nhỏ từ từ 15 ml alginate 2% vào 30 ml CaCl2-0.2 M 20 Thu hạt gel Ca-alginat Cho hạt gel vào 20 ml đệm Tris-HCl pH8, thêm ml enzym CGTase vào dung dịch Cố định enzyme gel 45 phút Lọc dung dịch sau cố định, thu dịch lọc xác định thể tích Rửa hạt gel Ca-alginate-enzyme lần với đệm Tris-HCl với pH (mỗi lần 10 ml) Thu hạt gel Thu dịch rửa, xác định thể tích Xác định hàm lượng hiệu suất protein cố định Xây dựng đường chuẩn Cprotein(µg/ml) = f(OD595) Xác định hàm lượng protein chế phẩm CGTase Xác định hàm lượng protein dịch rửa Tính toán hàm lượng protein cố định Xây dựng đường chuẩn ∆OD550 = f(Cβ-CD(µg/ml))Xác định hoạt tính CGTase cố định 21 Xác định hoạt tính CGTase ban đầu Xác định hoạt tính CGTase cố định Nhận xét Tỉ lệ hoạt tính enzym trước – sau cố định phương pháp bắt giữ 22 BÀI 9: TINH CHẾ PROTEIN BẰNG SẮC KÝ ÁI LỰC 9.1 KHÁI QUÁT Sắc ký lực Nguyên tắc: Dựa vào gắn thuận nghịch nhóm chức protein với nhóm chức pha tĩnh sắc ký Như vậy, có protein đích mang nhóm chức đặc hiệu gắn vào pha tĩnh, protein khác khỏi cột, protein đích sau chất cạnh tranh với Đây kỹ thuật sắc ký đơn giản hiệu để tinh chế protein Tuy nhiên, có nhược điểm đòi hỏi protein đích, phải có nhóm chức mà lúc có Ngày với kỹ thuật tái tổ hợp, người ta them vào đoạn gen đích đoạn acid nucleic mã hoá cho đoạn peptid mang chức để sau tách chiết protein đích, đoạn peptid sau loại bỏ peptase - Một số ví dụ: IMAC: nhựa sắc ký gắn ion kim loại (hoá trị II Cu, Ni…) Ion có lực với đoạn peptid có nhiều histidin, đặc biệt – 10 histidin Chất dung để protein imidazole nồng độ > 100 mM GST: Nhựa có lực với enzyme Glutathion-S-tranferase Protein đích thu glutathione dạng khử có nồng độ > 20 mM 9.2 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN • Mô tả tượng xảy thực phá huỷ tế bào: • Mẫu thử protein Mẫu A B C D D D D Lượng protein Thể tích Lượng Hiệu suất HS = (Mẫu gộp)/Mẫu A (%) • Nhận xét hiệu suất tinh chế - giải thích: D Mẫu gộp D1Dn 23 9.3 VẼ SƠ ĐỒ QUÁ TRÌNH TINH CHẾ a Chuẩn bị cột Rửa cột nước cất vô trùng Phân tán nhựa sắc ký cho thật cách úp ngửa Cho ml Ni-Sepharose vào cột Để yên khoảng 1h Mở cột cho chạy hết dung dịch bảo quản cột Rửa cột với đệm thể tích nước cất vô trùng thể tích Đệm ion X thể tích Đệm chảy 1X b Phá vỡ tế bào: Ly tâm 15 ml môi trường nuôi cấy E.coli, bỏ phần nước Phân tán tế bào ml Đệm chạy H 1X Trán siêu âm mẫu đến thu dịch đồng Chuyển dịch vào eppendorf 1.5 ml 24 Ly tâm 9600rpm/10min, thu phần nổi, dịch A c Tinh chế His-tag protein Nạp ml Dịch A Mở cho cột chạy, hứng dịch chảy = Dịch B Rửa cột với thể tích Đệm chạy H 1X, thu dịch B1 Rửa cột với thể tích Đệm rửa H 1X, hứng dịch chảy = Dịch C Thôi protein ghi nhãn D1-Dn, kiểm tra phân đoạn để đảm bảo protein thu hết Tái cân cột thể tích Đệm chạy H 25  Bài 10: TINH CHẾ LYSOZYM BẰNG SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION 5.1 Khái quát Khi dùng phương pháp sắc ký trao đổi ion để tinh chế protein ?  Khi biết điểm đẳng điện pI protein  Dung dịch phải có lực ion thấp  Có pI khác protein tinh protein tạp Nguyên tắc Sắc ký trao đổi ion: Nhựa sắc ký trao đổi ion gồm chất rắn không tan gắn nhóm mang điện tích liên kết cộng hóa trị, nhóm mang điện tích liên kết với đối ion có điện tích trái dấu cách thuận nghịch nhờ tương tác tĩnh điện (Hình 5.7) Hình 5.7: Sự thay đổi điện tích protein theo pH dung dịch Sắc ký trao đổi ion dựa vào trao đổi thuận nghịch điện tích protein với điện tích trái dấu pha tĩnh sắc ký, tùy theo cân ion pH dung dịch mà protein gắn vào nhựa hay bị đẩy khỏi nhựa Các loại nhựa trao đổi ion: Theo loại điện tích trao đổi nhựa chia làm loại cation anion Theo độ mạnh nhóm mang điện tích nhựa có loại mạnh yếu Khái niệm mạnh hay yếu mức độ biến động ion hóa theo pH độ 26 mạnh liên kết Nhựa trao đổi mạnh có khả hoạt động dãi pH rộng bị ảnh hưởng pH môi trường ngược lại Theo chất vật liệu mang: vật liệu mang (matrix) thường loại polymer tự nhiên hay tổng hợp dextran (sephadex), agarose (sepharose), cellulose (sephacel) vật liệu mang định độ bền, khả chiệu đựng tác động hóa học, vật lý, độ thân nước khả thấm phân tử vào bên tốc độ mức độ trao đổi diễn 5.2 Nội dung thực tập + Tinh chế lysozym từ lòng trắng trứng kỹ thuật sắc ký trao đổi ion + Xác định hàm lượng lysozym tinh chế 5.2.1 Vật liệu  Dịch lòng trắng trứng  Đệm chạy (50 mM Tris-HCl pH8) nhằm trì pH8 để lysozym có pI = 10 > tích điện dương bị giữ lại cột protein khác có pI ≤ < nên tích điện âm không trao đổi với cột di  Đệm (2 M NaCl 50 mM Tris-HCl pH8) có chứa nồng độ cation Na+ lớn nên cạnh tranh với lysozym để đẩy lysozym  Nhựa trao đổi ion SP Sepharose FF Tiến hành 5.3.1 Nguyên tắc tinh chế: 5.3 Áp dụng kỹ thuật sắc ký trao đổi ion để tinh chế lysozym từ lòng trắng trứng Dựa vào khác biệt pI lysozym (pI=10) so với protein khác lòng trắng trứng (pI ≤ 6), pH nhựa trao đổi cation lysozym có pI > pH tích điện dương bị giữ lại cột protein khác có pI < pH nên tích điện âm không trao đổi với cột di Lysozym cột sau cách nâng đến pH10 tăng nồng độ ion dung dịch lên để cạnh tranh đẩy lysozym 5.3.2 tóm tắt qui trình tiến hành: Bước 1: Chuẩn bị cột Rửa cột rỗng nước cất vô trùng Phân tán nhựa sắc ký Nạp ml SP Sepharose vào cột (không dính thành cột) 27 Để yên cho sepharose lắng xuống Mở cho chảy hết dung dịch bảo quản cột Rửa cột với thể tích Nước cất vô trùng Rửa cột với thể tích Đệm chạy 1X Bước 2: Tinh chế Lysozym Nạp ml dịch lòng trắng trứng (Dịch A) lên cột Hứng toàn dịch chảy (Dịch B) Rửa cột với thể tích Đệm chạy Hứng toàn dịch chảy (Dịch C) không protein Thôi lysozym khỏi cột cách cho ml Đệm thôi,đo OD 280 nm, Tái cân cột thể tích Đệm chạy 5.4 Kết thực tập Dịch A: dịch lòng trắng trứng (chứa toàn lysozym tạp E.Coli) Dịch B: chứa tạp protein khác lysozym Dịch C: chứa tạp protein có chứa histidin gắn không đặc hiệu với cột Dịch D1 đến Dn : chứa protein có chứa histidin gắn đặc hiệu với cột Bảng 5.20: Định lượng protein Hệ số pha loãng n OD280 Tổng thể tích V (ml) Tổng lượng protein tính A 10 1,992 19,92 B 10 1,082 0,8 8,656 C1 10 0,282 8,460 C2 0,072 0,072 D1 1,275 1,275 D2 0,059 0.059 D3 -0,071 -0,071 28 theo A280 A280 = n x OD280 x V Hiệu suất tinh chế Lysozym là: (Mẫu gộp) = 1,275+0,059-0,071 x100 = 6,34% Hiệu suất = Mẫu A(%) 19,92 5.5 Nhận xét: - Dịch A chứa toàn protein E.Coli nên có lượng lysozym lớn Dịch B dịch chứa protein tạp.Dịch C dịch chứa protein có chứa histidin gắn không đặc hiệu với pha tĩnh cột sắc ký Dịch D1, D2, D3 chứa lượng protein có chứa histidin đặc hiệu tham gia trao đổi qua cột -Tổng lượng protein tính theo A280 có chứa mẫu B, C, D1, D2, D3 là: A280(B,C,D) = 8,656 + 8,460 + 0,072 + 1,275 + 0,059- 0,071 = 18,451 A280(B,C,D) x100 = 18,451 x 100 = 92,62 % A280 (A) 19,92 - Ta thấy, lượng protein khỏi cột sắc ký A 280(B,C,D) = 18,451 lượng protein chứa mẫu A ban đầu A 280 (A)= 19,92 => hợp lý Nhưng hiệu suất protein khỏi cột chì có 92.62 %, điều cho thấy lượng protein gắn cột chưa - Trong lòng trắng trứng lysozym chiếm khoảng 3,4% tổng lượng protein có lòng trắng trứng Do đó, lý tưởng trình tinh chế cho H% = 3,4% Thực tế thực tập cho kết H% = 6,34 %  Điều chứng tỏ dịch D bên cạnh lysozym chứa nhiều protein tạp khác Như vậy, trình tinh chế không đạt - Nguyên nhân: Lượng protein tạp chảy chưa hết vào dịch C tiến hành lysozym khỏi cột Do đó, lượng protein tạp sót lại theo dịch tinh chế D Vì vậy, cần khắc phục cách dùng tăng thể tích Đệm lên Sai sót trinh thao tác lấy thể tích sai số trình đo quang [...]... 300C Thực hiện pha chế như bảng sau: TT Tinh bột 1% (ml) Acid sulfosalicylic 20% Đệm phosphate (ml) Enzym (ml) Ống Thử 0.1 0 0.3 0.1 Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Acid sulfosalicylic 20% 0.5 Hút 0.1 ml từ các ống sang eppendorf mới Thuốc thử iode 0.9 Đo OD 560 nm Ống Chứng 0.1 0.5 0.3 0.1 0 0.9 12 Hệ số pha loãng thực nghiệm - Enzym thô pha loãng 50 lần Enzym tinh chế pha loãng 5 lần 3.2.Kết quả thực. .. lượng enzym amylase nào, đồng thời cũng không được làm giảm đi hoạt tính của amylase Tuy nhiên, trong thực tế quá trình tinh chế thì rất khó đạt được kết quả lý tưởng mà thường có thể làm mất đi một lượng enzym amylase nhỏ hay cũng có thể làm giảm đi một phần nhỏ hoạt tính của amylase Qua kết quả thực tập nhận thấy quá trình tinh chế amylase của nhóm làm vẫn chưa đạt kết quả tốt vì trong quá trình tinh... lượng protein theo phương pháp bắt giữ và hấp phụ • Công thức tính hàm lượng protein có trong 1ml enzym: mg protein/ml enzym= n*x*10^-3 Trong đó: N: Hệ số pha loãng X: Nồng độ protein có trong mẫu thử (ug/ml) Suy từ đồ thị Hàm lượng protein cố định tính theo công thức: mpr cố định = mpr ban đầu - mpr không cố định • Hiệu suất cố định protein tính theo công thức: H% = x 100 (%) • Bảng 5.3: Hàm lượng protein... như dextran (sephadex), agarose (sepharose), cellulose (sephacel) vật liệu mang quyết định độ bền, khả năng chiệu đựng tác động hóa học, vật lý, độ thân nước và khả năng thấm của các phân tử vào bên trong và do đó tốc độ và mức độ trao đổi có thể diễn ra 5.2 Nội dung thực tập + Tinh chế lysozym từ lòng trắng trứng bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi ion + Xác định hàm lượng lysozym tinh chế được 5.2.1 Vật... còn gắn trên cột chưa được thôi ra - Trong lòng trắng trứng thì lysozym chiếm khoảng 3,4% tổng lượng protein có trong lòng trắng trứng Do đó, nếu lý tưởng thì quá trình tinh chế sẽ cho H% = 3,4% Thực tế thực tập thì cho kết quả là H% = 6,34 %  Điều đó chứng tỏ trong dịch D bên cạnh lysozym còn chứa rất nhiều các protein tạp khác Như vậy, quá trình tinh chế không đạt - Nguyên nhân: Lượng protein tạp... chạy Hứng toàn bộ dịch chảy ra (Dịch C) cho đến khi không còn protein Thôi lysozym ra khỏi cột bằng cách cho từng 1 ml Đệm thôi,đo OD ở 280 nm, Tái cân bằng cột bằng 5 thể tích Đệm chạy 5.4 Kết quả thực tập Dịch A: dịch lòng trắng trứng (chứa toàn bộ lysozym và tạp của E.Coli) Dịch B: chứa các tạp protein khác lysozym Dịch C: chứa các tạp protein có chứa histidin nhưng gắn không đặc hiệu với cột Dịch... phẩm đi qua được nhưng - không cho enzym khuếch tán vào môi trường Phương pháp tạo vi nang: enzym được giữ trong các bao vi thể có màng bán thẩm dày 200 Å (cellulose, polysaccarid) • a b c Nội dung thực tập Cố định CGTase lên chất mang bằng phương pháp bắt giữ và hấp phụ Xác định hàm lượng protein cố định theo phương pháp Bradford Xác định hoạt tính CGTase cố định theo phương pháp Kaneko 5.2 KẾT QUẢ... imidazole nồng độ > 100 mM GST: Nhựa có ái lực với enzyme Glutathion-S-tranferase Protein đích được thu bằng glutathione dạng khử có nồng độ > 20 mM 9.2 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN • Mô tả các hiện tượng xảy ra khi thực hiện phá huỷ tế bào: • Mẫu thử protein Mẫu A B C D D D D Lượng protein Thể tích Lượng Hiệu suất HS = (Mẫu gộp)/Mẫu A (%) • Nhận xét về hiệu suất tinh chế - giải thích: D Mẫu gộp D1Dn 23 9.3 VẼ SƠ... từ các ống sang eppendorf mới Thuốc thử iode 0.9 Đo OD 560 nm Ống Chứng 0.1 0.5 0.3 0.1 0 0.9 12 Hệ số pha loãng thực nghiệm - Enzym thô pha loãng 50 lần Enzym tinh chế pha loãng 5 lần 3.2.Kết quả thực tập 3.3.1.Xác định hàm lượng protein trong dịch enzym thô và enzym tinh chế bằng OD280 Bảng 3.6: Hàm lượng protein trong dịch enzym thô và enzym tinh TT Dịch enzym thô Dịch enzym tinh chế Hệ số pha Tổng ... kháng kháng sinh chứa năng, vi sinh vật (VSV) lựa chọn làm probiotic phải đáp ứng yêu cầu d9a8c4 điểm sinh học như: (i) khả sống sót qua ống tiêu hoá vật chủ, (ii) đặc điểm công nghệ ảnh hưởng... trường đục gelatin bị tủa Chủng vi sinh vật có sinh protease ngoại bào xung quanh khóm khuẩn lạc có vòng suốt; gelatin bị protese sinh thuỷ phân 1.5 KẾT QUẢ THỰC TẬP a Các chủng amylase ngoại bà:... tinh bột Chủng vi sinh vật có sinh amylase ngoại bào xung quanh chỗ vi sinh vật có vòng suốt quanh khóm khuẩn lạc; amylase sinh thủy phân tinh bột b Phát Protase ngoại bào Vi sinh vật từ mẫu đất