Đang tải... (xem toàn văn)
Báo cáo thực hành công nghệ lên men mt
Báo cáo TH CNLM-MT Bài 1: Lý thuyết chung ĐỘNG HỌC LÊN MEN THU SINH KHỐI VÀ QUY TRÌNH CHUNG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH KHỐI Động học lên men thu sinh khối: 1.1 Phương pháp nuôi cấy sản xuất sinh khối - Nuôi cấy theo me - Nuôi cấy liên tục - Nuôi cấy theo me tiếp liệu liên tục 1.2 Phương trình động học nuôi cấy theo me X= x0eµt ; N= N0 eµt ; OD= OD0 eµt - Xác định x bằng phương pháp khối lượng - Xác định N bằng phương pháp đổ/trải đĩa nếm khuẩn lạc - Xác định OD bằng phương pháp đo độ đục Hình 1.1.Đo OD canh trường bằng spectrophotometer A) Mẫu trắng: môi trường suốt, cường độ ánh sáng đến được tế bào quang điện được coi là cường độ lớn nhất và OD được chỉnh về ở bước sóng đo (thường 600 – 610 nm) B) Khi cuvette có vi khuẩn, một phần ánh sáng bị phân tán và không đến được tế bào quang điện, OD>0 GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang Báo cáo TH CNLM-MT Chú ý: Chỉ đo OD trực tiếp nếu môi trường dinh dưỡng không màu hoặc màu nhạt Khi môi trường có màu nâu phải ly tâm mẫu, sử dụng môi trường suốt hoặc nước muối sinh lý để đưa về thể tích ban đầu và làm mẫu sáng Đối với một số VSV, OD chỉ tuyến tính với nồng độ tế bào nồng độ này thấp vì vậy chỉ nên nhận giá trị OD 0.4 thì nên pha loãng lần Hình 1.2 Tương tác giữa giá trị OD và nồng độ tế bào Ví dụ: OD 0,4 ; OD = 0.540 Pha loãng mẫu lần(1 ml mẫu + 1ml môi trường tiệt trùng): OD = 0.288 OD hc (OD hiệu chỉnh) = OD * n = 0.288*2 = 0.576 GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang Báo cáo TH CNLM-MT 1.3 Đường cong tăng trưởng vi sinh vật Vẽ đường cong tăng trưởng nhằm xác định các thông số động học nuôi cấy: Động học tăng trưởng (x(t), N(t) hoặc OD(t) đường cong (hàm mũ e) Tuyến tính hóa bằng cách lấy logx, logN hoặc logOD Hình 1.3 Tuyến tính hóa đường cong tăng trưởng bằng cách vẽ đồ thị logx, logN, logOD theo t GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang Báo cáo TH CNLM-MT Để có được đường cong tăng tưởng cần thực hiện đo OD bảng sau: Thời Thời gian OD điểm 08:15 (min) 12:00 OD pha OD hc logODh.c loãng 0.055 n=1 loãng - 0.055 -1.26 225 0.685 (1ml+3ml); 0.206 0,824 -0.08 Hệ số pha n=4 Hình 1.4 Đường cong tăng trưởng VSV nuôi cấy theo me (logOD theo t) 1.4 Các thông số từ đường cong tăng trưởng - tlag, tlog - μ = [ln(OD/ODo)]/(t-to)=log(OD/ODo)/[loge*(t-to)] =(logOD-logODo)/0.434(t-to)= 2.303(logOD-logODo)/(t-to) - μmax - td = thời gian thế hệ = 2.303*log2/μmax = 0.69/μmax - Để xác định suất sinh khối: GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang Báo cáo TH CNLM-MT Năng suất R = (Xf-Xo)/(tf-to) Cần xác định Xf, Xo hoặc Nf, N0 Muốn vậy cần thiết lập đường chuẩn tế bào 1.5 Đường chuẩn tế bào: tương quan tuyến tính giữa OD (OD50%) Dễ dàng sử dụng 1.11.2 Chế phẩm lỏng (liquid products) Sinh khối thường được đưa về dạng trạng thái ngủ, tốt nhất trường hợp vi sinh vật có kén, bào tử GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang Báo cáo TH CNLM-MT BÀI 2: SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AZOTOBACTER SPP (PHÂN BÓN CỐ ĐỊNH ĐẠM) I.1 Lý thuyết: Cố định N là khả đồng hóa N phân tử của một số vsv và dung làm nguồn kiếm tạo tế bào Các vsv cố định N sống tự có nhiều đất, hay sống cộng sinh nốt sần họ đậu Nguồn N có thể là nitơ phân tử, cũng có thể là muối amon, nitrate, nitrite, amoni acid Tùy thuộc nồng độ các hợp chất có nitơ này môi trường mà quá trình cố định nitơ phân tử sẽ bị ức chế nhiều hay ít Đồng thời chúng có nhu cầu lớn đối với P và Ca, cũng để cố định nitơ mạnh mẽ chúng cần Mo và B Phần lớn các loài Azotobacter chỉ phát triển ở pH lớn và độ ẩm cao I.2 Tạo chế phẩm: Công nghệ sản xuất phân bón sở chất mang Chất mang phải đáp ứng những nhu cầu sau: II - Re Sẳn có thị trường Chứa hàm lượng chất hữu cao Không chứa chất độc Có khả giữ nước tốt (>50%) Dễ dàng sử dụng Thực hành: Vật liệu: VSV: Azotobacter chroococcum Hóa chất: môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vsv thông thường Đường: mannitol, glucose, sucrose Nguồn N: cao nấm men Bao nilon Dụng cụ: Dụng cụ thủy tinh nuôi cấy vsv: đĩa Petri, ống nghiệm, không thấm nước Bình tam giác Becher GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang 10 Báo cáo TH CNLM-MT + Chuẩn bị bình ( ở giai đoạn nghỉ) và bình ( ở kệ lắc ) và giống môi trường thạch ( môi trường asbly ) và đối chứng âm và đối chứng dương ly Bình Đối chứng âm Đối chứng dương Hình 2.5 Thử khả cố định dạm của Azotobacter spp Khả sinh Auxin (IAA): Salkowsky’s technique Đưa 2ml canhBình ttrường vào tube Epp Ly tâm 10min Giống môi 15000rpm thạch Sau đó 1ml dung dịch trộn với ml thuốc khửtrường salkowsky: kết quả cho không màu Vậy môi trường không có sinh IAA II.4 Kết quả tính toán Số lượng tế bào lúc đầu và lúc cuối được tính bằng cách ta thế vào phương trình đườn chuẩn tế bào: y=3.1914x +0.1257 Cfu/ml Cfu/ml Bảng tóm tắt thông số động học Thông số tlag tlog td X0 , N0 X,N Đơn vị Min Min 1/min Min Cfu/ml Cfu/ml GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang 20 Giá trị xác định, tính toán 120 ( – 2giờ) 120 (2 – 4giờ) 0.019(1/ min) (1) 36.3 (2) 1,07.10-10 14,34.10-10 Báo cáo TH CNLM-MT S0 S Rmax= (X-X0)/(48) Yx/s= (X-X0)/(S0-S) mg/ml mg/ml Cfu/(ml*min) Cfu/ml 13,2 4,81 =(14,34.10-10 – 1,07.10-10 )/48 =0,276.10-10 =(14,34.10-10 – 1,07.10-10 )/ (13,2 - 4,81)= 1.58.10-10 Bảng tóm sản xuất sinh khối/me: Cfu/ml Thông số Glucose Cao nấm men Dung dịch Khoáng Đơn vị G G Ml Giống Ml OD OD0 X0 OD X S0 S M chất mang M sản phẩm Mật độ tế bào sản phẩm Khả cố định đạm Khả sinh IAA Cfu/ml Cfu/ml G G Cfu/g +/+/- Giá trị xác định, tính toán 15 1000 Khoáng vi lương: 8,842.10-3 Khoáng đa lượng: 1,554 15 ml 0,2955 1,07.10-10 9,64 30,9 10-10 15 Có Không Câu 3:Sự khác biệt của giữa các môi trường nuôi cấy Azotobacter: Môi trường Asbly gồm có môi trường: môi trường và môi trường 2: o Môi trường 1: là môi trường thạch vì có chưa agar và môi trường này không chứa yeast extract Môi trường này là môi trường giữ giống vì không chưa nitơ GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang 21 Báo cáo TH CNLM-MT o Môi trường 2: khác với môi trường vì nó có chứa cao nấm men Cao nấm men là thành phần c9hứa nitơ Đây chính là môi trường nhân giống - Môi trường thu sinh khối: môi trường này khác với môi trường là sử dụng đường glucose Hình2.6 Hình thái khuẩn lạc Azotobacter: có dạng nhầy, đàn hồi, khá lồi, một số ở dạng nhăn nheo, màu trắng Hình 2.7 Hình thái tế bào Azotobacter spp: nhuộn gram(âm) thì có màu hồng, hình que, hình cầu GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang 22 Báo cáo TH CNLM-MT Hình 2.8 Hình thái tạo kén Azotobacter spp: Hình giọt nước có các tế bào kén màu trắng nâu bóng,các kén nằm tập hợp thành từng cụm GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang 23 Báo cáo TH CNLM-MT Bài SẢN XUẤT CHẾ PHẨM BACILLUS SPP HỖ TRỢ XỬ LÝ NƯỚC THẢI GIÀU PROTEIN VÀ TINH BỘT – SẢN XUẤT CHẾ PHẨM BÀO TỬ BACILLUS SUBTILIS I lý thuyết I.1 Vi khuẩn Bacilluas subtilis Có nhiều hoạt tính sinh học : _ Tiết enzyme ngoại bào ( amylase, protease, cellulase, chitinase …) xử lý nước thải, giống sản xuất enzyme I.2 Sản xuất sinh khối Sản xuất sinh khối dưới dạng bào tử lên men chìm hoặc lên men thể rắn I.3 Downstream processing Lên men chìm : Ly tâm thu bào tử, tạo chế phẩm Lên men thể rắn : môi trường đồng thời đóng vai trò chất mang, sấy I.4 Tạo chế phẩm Chế phẩm khô: trộn chất mang – sấy Chế phẩm lỏng: chất lỏng hạn chế nảy mầm, nhiễm Ví dụ nước + acetic acid II Chuẩn bị nguyên liệu, dụng cụ, tiến hành thí nghiệm: II.1 Chuẩn bị - VSV : Bcillus subtilis Vật liệu/ Hóa chất: môi trường dinh dưỡng nuôi cấy VSV thông thường : + Tinh bột, cám gạo + Peptone, cao thịt, cao nấm men, (NH4)2SO4 + Các muối NaCl, MgCl2, MnCl2, FeSO2, ZnSO4 + Cao + Giấm ăn ( AcOH lên men) + Hóa chất nhuộm Gram, nhuộm bào tử - Dụng cụ: GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang 24 Báo cáo TH CNLM-MT + Dụng cụ thủy tinh nuôi cấy VSV: đĩa petri, ống nghiệm, không thấm nước + Bình tam giác 100 ml, 500 ml + Becher 1000 ml - Thiệt bị: + Máy lắc + Máy spectrophotometer + Kính hiển vi quang học x 1000 II.2 Tiến hành thí nghiệm II.2.1 Cấy truyền từ đĩa petri vào thạch nghiêng: - Chuẩn bị chứa thạch nghiêng chứa môi trường giữ giống ( nutrient agar ) : ống/nhóm Chọn khuẩn lạc đặc trưng từ đĩa petri cấy vào ống thạch nghiêng - Ủ 300C, 48 giờ II.2.2 Nhân giống - Chuẩn bị môi trường lỏng ( mt nhân giống) 50 ml : lắc 150 vòng/ phút Kiểm tra OD sau 24 giờ Tính toán lượng giống đủ cho lên men chìm và lên men bề mặt Bảng 3.1 Thành phần môi trường giữ giống Thành phần Môi trường giữ giống Môi trường nhân giống g/l (1) g/l (2) 30 5 20 7.0 300C 24h 30 5 Tinh bột tan Peptone Cao nấm men Agar PH T nuôi cấy Thời gian Lắc GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang 25 7.0 300C 15-18h 150-200 v/min Báo cáo TH CNLM-MT Thể tích môi trường Thể tích giống Thạc nghiêng 50 ml ml II.2.3 Xác định các thông số động học - Chuẩn bị môi trường lên men chính (mt thu sinh khối) để theo dõi thông số động học 72 giờ.Kết quả ghi chép vào bảng 3.3 Bảng 3.2 a Thành phần môi trường thu sinh khối bào tử (len men thể rắn) Peptone 20 g/l Tinh bột tan 20 g/l Cao nấm men 20 g/l NaCl g/l MgCl2 0.2 g/l MnCl2 0.2 g/l Dung dịch khoáng CaCl2 0.2 g/l FeSO4 0.2 g/l ZnSO4 0.2 g/l Tiệt trùng môi trường : 1210C, 30 phút, cấy giống 1%, ủ 30-350C, lắc, 250 vòng/ phút 24-72h Bảng 3.3 Thí nghiệm theo dõi các thông số động học nuôi cấy chìm Ống Giờ 10 12 Thời OD Hệ số gian 600 pha 0,144 0,130 0,217 loãng 20 20 20 (t) GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang 26 OD hc 2,88 2,60 4,34 Log OD µ hc 1/phút 0,459 0,415 0,637 -0.0507 0.2556 Soi kính Hình 3.2 Báo cáo TH CNLM-MT 14 12 16 20 24 28 32 36 0,236 0,248 0,309 ,300 0,359 20 40 40 40 40 4,72 9,92 12,36 12 14,36 0,673 0,997 1,092 1,079 1,157 0.0414 0.0414 0.0546 -0.007 0.0449 Hình 3.1 Đồ thị theo dõi thông số động học nuôi cấy chìm của Bacilluas subtilis II.2.4 Sản xuất sinh khối phương pháp lên men chìm - Chuẩn bị môi trường lên men chính ,238 ml/nhóm, cấy 12ml/mẫu.Lắc 150,250 vòng/phút, khoảng 48-72 giờ - Khảo sát ảnh hưởng của oxy lên sự tổng hợp sinh khối ( cooper et al, 1944) - Hóa chất: +Dung dịch thiosulfat 0.1 N (Na2S2O3) đã hiệu chỉnh nồng độ +Dung dịch tinh bột 1% +Dung dịch iod 0.1 N mới pha chế +Dung dịch sulfit (Na2SO3) 0.8 N chứa CuSO4 (0.001 M) - Nguyên tắc: Mức độ thông khí được đánh giá một cách gián tiếp bằng phương pháp sulfit.Phương pháp dựa sở của việc xác định tốc độ oxy hóa sulfit thành GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang 27 Báo cáo TH CNLM-MT sulfat có mặt của chất xúc tác là đồng Lượng sulfit dư sẽ phản ứng với iod Lượng iod dư sẽ được chuẩn độ bằng thiosulfat Na2SO3 + ½ O2 ( CuSO4) Na2SO4 4Na2SO3 + I2 3Na2SO4 + 2NaI I2 + 2Na2S2O3 NaI + 2Na2S4O6 Như vậy oxy hòa tan nhiều thì tương đương thể tích thiosulfat chuẩn độ sẽ lớn - Tiến hành Xác định thể tích dung dịch iod cần thiết cho thí nghiệm - Cho dung dịch iod 0.1N từ burette chảy dần vào bình tam giác 250 ml chứa ml dd Na2SO3 mới pha chế cho đến xuất hiện màu nâu sáng,ghi nhận thể tích iod a - Thêm 0.5 ml dung dịch tinh bột 1% vào và chuẩn độ bằng thiosulfat cho đến mất màu xanh lam(1-3 ml thiosulfat 0.1 N) - Cho α ml dung dịch I2 0.1N vào bình tam giác 250 ml, chuẩn độ bằng thiosulfat ( chỉ thị tinh bột vào ở giai đoạn cuối ) đến mất màu- V thiosulfat khoảng 30-40 ml là được Xác định trị số sulfit trước và sau thông khí - ml sulfit cho vào bình tam giác 250 ml chứa sẵn a ml iod Đậy bình bằng nắp kính để vào chỗ tối 5-10 phút, sau đó dùng nước cất tráng kính đậy, thu hết nước rửa vào bình tam giác trên, chuẩn độ dịch chứa bằng thiosulfat 0.1N Thể tích thiosulfat chuẩn độ là PN ml - Bình tam giác thể tích bình nuôi cấy, thay môi trường bằng dung dịch sulfit cùng thể tích, được đặt vào máy lắc một thời gian xác định ( thời gian chính xác đến hàng phút ).Trước dừng máy lắc 15-20 phút, rót α ml dung dịch iod vào bình 250 ml Lúc dừng máy lắc, lấy ml dung dịch sulfit từ các bình đã lắc cho vào bình chứa sẵn α ml dd I2 Tiếp tục lắc bình nuôi cấy.Trong đó, giữ các bình lấy mẫu tối và đem GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang 28 Báo cáo TH CNLM-MT chuẩn độ bằng thiosulfat 0.1 N trên,ghi nhân Px1 là thể tích thiosulfat chuẩn độ - Sau 20 phút lắc, lập lại bước lấy mẫu và chuẩn độ trên, ghi nhận Px2 là thể tích thiosulfat chuẩn độ ml Sulfit Chuẩn độ a ml I2 Bằng thiosulfat Độ hòa tan oxy dung dịch sulfit tính theo công thức : mg O2/l/phút = (PX-PN)/T *0.8* Tính Toán trị số sulfit Bảng 3.4 Lượng oxy xâp nhật vào dung dịch sulfit PN = ml; = 35,7 ml mg (ml) O2/l/phút Chế độ lắc (0,05 N) 150 vòng/phút 250 vòng/phút (0,1N) = 7,2 = 3,6 6,93 = 10,3 = 5,15 5,53 = 11 = 5,5 = 5,6 9,2 = 11,25 TB (mg O2/l/phút) 9,1 Bảng 3.5 Lượng sinh khối thu được của chế độ lắc Chế độ lắc 150 OD OD1 0,335 OD2 0,313 GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang 29 HSPL(lần) 60 ODhc OD1 20,1 OD2 18,78 ODTB 19,44 Báo cáo TH CNLM-MT Vòng/phút 250 Vòng/phút 0,371 0,370 45 16,695 16,65 16,67 Số liệu từ hai bảng cho ta thấy rằng ở chế độ lắc 150 vòng/phút với lượng oxy xâm nhập 6,23 mg/l/phút cho lượng sinh khối (ODTB = 22,23) cao chế độ lắc 250 vòng/phút, không có sự thay đổi về độ tuổi của tế bào Vậy chọn chế độ lắc 150 vòng/phút cho quá trình lên men thu sinh khối Bacilluas subtilis ở dạng lỏng (lên men chìm) II.2.6 Downstream processing - Ly tâm 4000 vòng/phút x 15 phút ,rửa sinh khối bằng nước vô trùng lần, hòa bào tử vào nước muối sinh lý vô trùng đến thể tích bằng 1/10 thể tích trước ly tâm II.2.7 Tạo chế phẩm - Sử dụng giấm ăn ( acid acetic ) 20% đưa PH về 3.8 – 4.2 - Bảo quản nhiệt độ thường II.2.8 Phân tích chế phẩm - Pha loãng,trung hòa bằng NaOH 1M,đỗ đĩa môi trường kiểm định,phải đạt 109 – 1010 cfu/ml - Hoạt tính enzyme: môi trường đổ đĩa sau đếm khuẩn lạc, tráng đĩa bằng dung dịch Lugol, quan sát vòng trắng xung quanh khuẩn lạc, nếu kết quả (+); có khả phân hủy tinh bột; ngược lại: không có khả II.2.9 Ứng dụng của chế phẩm Nguyên tắc: Chế phẩm lỏng : trung hòa bằng NaOH trước sử dụng Lượng bào tử chế phẩm lỏng bằng chế phẩm rắn ( lên men bề mặt ) cho vào nước thải Nước thải đưa về PH=7.0 GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang 30 Báo cáo TH CNLM-MT Lắc cùng một điều kiện 150 vòng/phút Đo COD ghi bảng 3.6 Bảng 3.6 COD mẫu thí nghiệm ứng dụng Đối chứng TN1 TN2 (không bổ sung bào tử) (bổ sung bào tử chế (bổ sung bào tử chế phẩm lỏng) phẩm rắn) II.2.10 Sản phẩm sinh khối phương pháp lên men bề mặt Bảng 3.7 Thành phần môi trường thu sinh khối bào tử lên men thể rắn(mt len men chính) Thể tích cấy giống Cám gạo 250 g/bao (độ ẩm 6%) 15 ml Dung dịch dinh dưỡng Pepton 25 g/kg 50 ml Cao thịt 10 g/kg KH2PO4 10 g/kg Độ ẩm 65% CaO g/kg Lượng nước bổ sung Chuẩn bị bịch nilon môi trường bảng 3.5 Tính lượng nước bổ sung cho độ ẩm môi trường 65% Hấp 1210C 30 phút Cấy 15 ml giống.Lắc đều Ủ nhiệt độ phòng hoặc 320C, 48 giờ Sấy 40-450C Lượng nước cần thêm vào để đạt độ ẩm 65% là: = 0,65 x = 1514 ml nước Lượng nước thêm vào bịch là: 1514/4 = 379 ml Vậy lượng nước cần thêm vào bịch để đạt độ ẩm 65% là 379 ml nước Tiến hành phân tích thử nghiệm GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang 31 Báo cáo TH CNLM-MT II.3 Kết quả,tính toán Bảng 3.8 Tóm tắt các thông số động học Thông số Đơn vị Giá trị xác định,tính Phút toán 120 (8:10h) (0 : 2h nuôi Phút cấy) 120 (10:12h) (2:4h nuôi µ max 1/phút cấy) 0.2556 Td Phút 21.56 tlag Tlog ODo 2.88 OD Cfu/ml Ảnh hưởng oxy hòa tan đến sinh khối nuôi cấy chìm Thống số Lắc 150 vòng/phút Oxy mg/l 6.9 (60 phút) ODo 19,44 OD 24h OD 48h OD 72h Soi kính 24h Soi kính 48h Soi kính 72h Thể tích sản phẩm Nồng độ bào tử Hiệu quả xử lý Bảng 3.9 Thông số lên men bề mặt Thống số Khối lượng mẫu trước lên men Khối lượng mẫu Đơn vị g Lắc 250 vòng/phút 9.1 (80 phút) 16,67 Giá trị xác định,tính toán g sau lên men B1: 0.660 kg B2: 0.657 kg B3: 0.655 kg GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang 32 Báo cáo TH CNLM-MT Mật độ bào tử Hoạt tính enzyme Hiệu quả xử lý B4: 0.656 kg 6.35.1011 Có/không GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang 33 Báo cáo TH CNLM-MT II.3 Kết luận: - Trong sản xuất chế phẩm lỏng ở chế độ lắc thì sự khác biệt độ tuổi của tế bào, ở chế độ lắc 150 vòng/phút cho mật độ tế bào (đo OD) cao chế độ lắc 250 vòng/phút - Quá trình thực hành thời gian không đủ nên chỉ tạo được chế phẩm rắn • Đặc điểm hình thái của Bacillus subtilis: Tế bào vi khuẩn B.subtilis có hình que, dài, bào tử hình ovan nằm ở xa tâm hay gần tâm có khuynh hướng phình ở một đầu, bắt màu tím nhuộm Gram B.subtilis là vi khuẩn Gram dương Hình 3.2 hình thái tế bào bacillus Soi kính 24h: tế bào gram âm có màu xanh tím - Quá trình nhuộn bào tử tế bào bắt màu đỏ tế bào bacillus subtilis bắt màu xanh GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang 34 [...]... protease, cellulase, chitinase …) xử lý nước thải, giống sản xuất enzyme I.2 Sản xuất sinh khối Sản xuất sinh khối dưới dạng bào tử lên men chìm hoặc lên men thể rắn I.3 Downstream processing Lên men chìm : Ly tâm thu bào tử, tạo chế phẩm Lên men thể rắn : môi trường đồng thời đóng vai trò chất mang, sấy I.4 Tạo chế phẩm Chế phẩm khô: trộn chất mang – sấy Chế phẩm... sản phẩm Nồng độ bào tử Hiệu quả xử lý Bảng 3.9 Thông số lên men bề mặt Thống số Khối lượng mẫu trước lên men Khối lượng mẫu Đơn vị g Lắc 250 vòng/phút 9.1 (80 phút) 16,67 Giá trị xác định,tính toán g sau lên men B1: 0.660 kg B2: 0.657 kg B3: 0.655 kg GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang 32 Báo cáo TH CNLM -MT Mật độ bào tử Hoạt tính enzyme Hiệu quả xử lý B4: 0.656... cáo TH CNLM -MT Thể tích môi trường Thể tích giống Thạc nghiêng 50 ml 1 ml II.2.3 Xác định các thông số động học - Chuẩn bị môi trường lên men chính (mt thu sinh khối) để theo dõi thông số động học trong 72 giờ.Kết quả ghi chép vào bảng 3.3 Bảng 3.2 a Thành phần môi trường thu sinh khối bào tử (len men thể rắn) Peptone 20 g/l Tinh bột tan 20 g/l Cao nấm men 20 g/l... TN2 (không bổ sung bào tử) (bổ sung bào tử chế (bổ sung bào tử chế phẩm lỏng) phẩm rắn) II.2.10 Sản phẩm sinh khối bằng phương pháp lên men bề mặt Bảng 3.7 Thành phần môi trường thu sinh khối bào tử bằng lên men thể rắn (mt len men chính) Thể tích cấy giống Cám gạo 250 g/bao (độ ẩm 6%) 15 ml Dung dịch dinh dưỡng Pepton 25 g/kg 50 ml Cao thịt 10 g/kg KH2PO4 10 g/kg... giống - Chuẩn bị môi trường lỏng ( mt nhân giống) 50 ml : lắc 150 vòng/ phút Kiểm tra OD sau 24 giờ Tính toán lượng giống đủ cho lên men chìm và lên men bề mặt Bảng 3.1 Thành phần môi trường giữ giống Thành phần Môi trường giữ giống Môi trường nhân giống g/l (1) g/l (2) 30 5 5 20 7.0 300C 24h 30 5 5 Tinh bột tan Peptone Cao nấm men Agar PH T nuôi cấy Thời gian Lắc... Hình 3.2 Báo cáo TH CNLM -MT 4 5 6 7 8 14 8 12 16 20 6 24 28 32 36 0,236 0,248 0,309 ,300 0,359 20 40 40 40 40 4,72 9,92 12,36 12 14,36 0,673 0,997 1,092 1,079 1,157 0.0414 0.0414 0.0546 -0.007 0.0449 Hình 3.1 Đồ thị theo dõi thông số động học nuôi cấy chìm của Bacilluas subtilis II.2.4 Sản xuất sinh khối bằng phương pháp lên men chìm - Chuẩn bị môi trường lên men chính ,238 ml/nhóm,... trường dinh dưỡng nuôi cấy VSV thông thường : + Tinh bột, cám gạo + Peptone, cao thịt, cao nấm men, (NH4)2SO4 + Các muối NaCl, MgCl2, MnCl2, FeSO2, ZnSO4 + Cao + Giấm ăn ( AcOH lên men) + Hóa chất nhuộm Gram, nhuộm bào tử - Dụng cụ: GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang 24 Báo cáo TH CNLM -MT + Dụng cụ thủy tinh nuôi cấy VSV: đĩa petri, ống nghiệm, bông không thấm nước + Bình tam... Nguyễn Hoài Hương trang 17 Báo cáo TH CNLM -MT đường càng giảm dần Nhưng ở 3 ống nghiệm trên thì lượng đường lại tăng lên - Tóm lại: Nhìn vào độ thi trên thì ta thấy lượng đường giảm dần theo thời gian Đều đó chứng tỏ là số lượng tế bào tăng dần theo theo thời gian 2.4 Sản xuất sinh khối: Chuẩn bị môi trường lên men chính (3) 238ml + cấy 12ml/mẫu = 250ml...Báo cáo TH CNLM -MT Thiết bị: - Máy lắc - Máy đo quang phổ - Kính hiển vi 2 Tiến hành thí nghiệm: 2.1 Giữ giống ( cấy truyền từ đĩa Petri vào thạch nghiêng) giữ giống Cấy truyền từ mt thạch nghiêng Ashby (1) + gar -8ml/ống đĩa Petri nhân giống mt lỏng Ashby (2)_50ml lắc 150v/ph - Chuẩn bị 10 ống thạch nghiêng... cáo TH CNLM -MT Vòng/phút 250 Vòng/phút 0,371 0,370 45 16,695 16,65 16,67 Số liệu từ hai bảng cho ta thấy rằng ở chế độ lắc 150 vòng/phút với lượng oxy xâm nhập 6,23 mg/l/phút cho lượng sinh khối (ODTB = 22,23) cao hơn chế độ lắc 250 vòng/phút, không có sự thay đổi về độ tuổi của tế bào Vậy chọn chế độ lắc 150 vòng/phút cho quá trình lên men thu sinh ... xuất sinh khối dưới dạng bào tử lên men chìm hoặc lên men thể rắn I.3 Downstream processing Lên men chìm : Ly tâm thu bào tử, tạo chế phẩm Lên men thể rắn : môi trường đồng... CNLM -MT Quy trình chung sản xuất sinh khối GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương trang Báo cáo TH CNLM -MT Đĩa Petri (khuẩn lạc đặc trưng môi trường giữ giống) Chuẩn bị môi trường lên men... giống - Chuẩn bị môi trường lỏng ( mt nhân giống) 50 ml : lắc 150 vòng/ phút Kiểm tra OD sau 24 giờ Tính toán lượng giống đủ cho lên men chìm và lên men bề mặt Bảng 3.1 Thành