ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRƯƠNG HẢI NHUNG TÓM TẮT ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU LUẬN ÁN Ngành: Sinh học Chuyên ngành: Sinh lý người động vật Mã số chuyên ngành: 62 42 30 01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN: GS.TS Nguyễn Văn Thanh TS.BS Huỳnh Nghĩa Tp.HCM, tháng 05 năm 2014 MỤC LỤC PHẦN GIỚI THIỆU 1.1 Sơ lược bệnh xơ gan 1.2 Điều trị bệnh xơ gan 1.3 Điều trị tế bào gốc 1.4 Tế bào gốc trung mô (MSC) PHẦN 2: ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU Tên đề tài luận án: Tính cấp thiết, ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Mục đích nghiên cứu luận án Đối tượng, phương pháp nghiên cứu Nội dung phạm vi vấn đề sâu nghiên cứu 12 Dự kiến kết đạt 15 Nơi thực đề tài nghiên cứu luận án 16 Các tài liệu tham khảo sử dụng viết đề cương 16 Phân bổ thời gian thực đề tài luận án 17 PHẦN GIỚI THIỆU 1.1 Sơ lược bệnh xơ gan 1.1.1 Bệnh xơ gan Xơ gan loại bệnh gan mãn tính Các kiểu xơ gan lần giới thiệu Laennec năm 1826 Nó có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp “scirrhus” sử dụng để mô tả mẫu sinh thiết gan có bề mặt màu cam nâu Nhiều dạng tổn thương gan đánh dấu xơ Xơ hóa định nghĩa tập trung mức thành phần mạng lưới ngoại bào (bao gồm collagens, glycoprotein, proteoglycans) gan Đáp ứng với tổn thương gan có khả đảo ngược Nhưng hầu hết bệnh nhân, xơ gan lại thể trình bất hồi phục Việc điều trị giúp giảm tiến trình bệnh ngăn ngừa biến chứng Xơ gan định nghĩa mô học trình khuếch tán đặc trưng gan xơ hóa biến đổi cấu trúc gan bình thường thành nốt cấu trúc bất thường Sự tiến triển tổn thương gan đến xơ gan xảy vài tuần tới vài năm Thật vậy, bệnh nhân bị viêm gan C bị viêm gan mãn tính từ 40 năm trước tiến triển đến xơ gan Mối tương quan phát mô học triệu chứng lâm sàng lại tương đối không rõ ràng Một bệnh nhân xơ gan hoàn toàn triệu chứng rõ ràng sống lâu, bệnh nhân khác lại có nhiều triệu chứng nặng bệnh gan giai đoạn cuối thời gian sống ngắn Dấu hiệu thường gặp triệu chứng thể suy giảm chức gan, giảm khả giải độc gan, tăng huyết áp tĩnh mạch cửa gan Dịch tễ học xơ gan Theo thống kê tổ chức Y tế Thế giới năm 2002, bệnh xơ gan bệnh gây tử vong đứng hàng thứ 12, gây chết cho 700,000 người năm với tỷ lệ tử vong lên đến 12 người 100,000 người toàn giới Tỉ lệ tử vong người mắc bệnh xơ gan 34-66% vòng 10 năm, phần lớn phụ thuộc vào nguyên nhân gây xơ gan: xơ gan rượu có tiên lượng xấu xơ gan mật xơ gan viêm gan Nguy tử vong tất nguyên nhân tăng gấp 12 lần; loại trừ hậu trực tiếp bệnh gan, nguy tử vong tăng gấp lần Theo thống kê năm 2004, bệnh xơ gan phổ biến nước Đông Âu, Bắc Phi, Hoa Kì Trung Mỹ Việt Nam nằm nhóm nước có tỷ lệ mắc bệnh xơ gan cao có xu hướng ngày tăng Nguyên nhân Nguyên nhân gây xơ gan chủ yếu nhiễm virus (virus viêm gan C đóng vai trò chủ yếu gần 26% trường hợp, virus viêm gan B, D gần 15% trường hợp), rượu (gần 21% trường hợp), nguyên nhân khác rối loạn chuyển hóa (hemochromtosis, thiếu men -antitrypsin), bệnh đường mật kéo dài, nghẽn tĩnh mạch gan, rối loạn miễn dịch, nhiễm độc (methotrexate, amiodarone), suy dinh dưỡng, nhiễm trùng, bẩm sinh… Hậu Hậu xơ gan gây suy chức gan tăng huyết áp tĩnh mạch cửa Suy chức gan làm giảm khả tổng hợp protein huyết thanh; giảm tổng hợp chất chống đông máu gây bầm tím, chảy máu; giảm chức tiết mật, chế biến bilirubin gây vàng da; thay đổi chuyển hóa đạm gây giảm chức não, hay quên, tập trung, khó ngủ chất đạm cần cho não ammonia không cung cấp đủ; giảm khả giải độc gan, giảm khả chuyển hóa thuốc… Tăng huyết áp tĩnh mạch cửa gây chứng bệnh cổ chướng, lách to, giãn mạch thực quản, tăng huyết áp phổi, gây xnah tím, khó thở … Ngoài gây giảm khả miễn dịch, tăng nguy mắc bệnh nhiễm trùng, tăng nguy ung thư gan dẫn đến tử vong, dễ nghẽn tĩnh mạch gan, không cung cấp đủ máu cho thận gây suy thận (tỷ lệ tử vong cao)… 1.2 Điều trị bệnh xơ gan Ngăn ngừa tiếp xúc với tác nhân gây xơ gan Ở xơ gan rượu, việc ngừng uống rượu giúp dừng tiến triển xơ gan Tương tự, việc ngừng dùng thuốc độc gan loại bỏ chất độc môi trường dừng tiến triển xơ gan Sự điều trị bệnh chuyển hóa, điều trị chứng thừa sắt hội chứng hemochromatosis hay thừa đồng bệnh Wilson liệu pháp có hiệu Các bệnh viêm gan B C đáp ứng với việc điều trị interferon viêm gan tự miễn tiến triển với prednisone azathioprine (Imuran) Các loại thuốc ursodiol (Actigall) làm chậm tiến triển xơ gan tắc mật nguyên phát bệnh viêm xơ chai đường mật Điều trị biến chứng Ở bệnh nhân bị xơ gan, việc chữa trị chủ yếu hướng vào biến chứng Chứng giãn tĩnh mạch xuất huyết thực quản điều trị liệu pháp xơ hóa nội soi thắt dây cao su Cổ trướng phù thủng thường đáp ứng tốt với phần ăn Natri Cổ trướng phù thủng nặng sử dụng liệu pháp lợi tiểu Viêm phúc mạc tự phát vi khuẩn nên chữa trị nhanh chóng kháng sinh thích hợp Những thuốc chuyển hóa gan nên cẩn thận sử dụng Các chứng rối loạn đông máu đáp ứng với vitamin K Đối với tăng áp tĩnh mạch cửa, sử dụng thuốc beta-blocker nitrat Bệnh não gan điều trị cách rửa ruột với lactulose Có thể bổ sung kháng sinh cần thiết Với bệnh nhân xơ gan bị suy gan-thận nên điều trị thẩm tách máu bổ sung thuốc làm tăng lượng máu đến thận Những điều trị khác hướng nguyên nhân đặc trưng xơ gan Đối với viêm gan siêu vi, sử dụng interferon thuốc kháng virus Đối với viêm gan tự miễn, sử dụng corticosteroid thuốc khác Ghép gan Ghép gan cách chữa trị hiệu cao cho xơ gan giai đoạn cuối Ghép gan thường cần đến biến chứng bệnh não, cổ trướng hay giãn tĩnh mạch xuất huyết kiểm soát chức sinh hóa bị suy giảm nghiêm trọng Ở bệnh nhân bị xơ gan tắc mật nguyên phát, mức bilirubin tăng biểu thị tiên lượng xấu bệnh nhân nên cân nhắc ghép gan nồng độ bilirubin bắt đầu tăng Các chuyên gia xác định nguy lợi ích ghép gan cho bệnh nhân Tỉ lệ tử vong cải thiện nhiều năm qua nhờ sử dụng thuốc suy giảm miễn dịch giữ cho gan ghép vào không bị công tổn thương Trung bình 80% bệnh nhân ghép gan kéo dài sống sau năm năm Tuy nhiên, số lượng bệnh nhân cần ghép gan vượt xa số lượng gan hiến tặng Một bệnh nhân cần ghép gan phải trải qua trình đánh giá phức tạp trước cho vào danh sách chờ ghép gan Nói chung, gan ghép cho bệnh nhân tiên đoán có hội sống sót dài sau cấy ghép Sự sống sót sau ghép gan cần theo dõi chặt chẽ kết hợp với chăm sóc chu đáo Xơ gan ung thư gan bệnh phổ biến giới Theo thống kê, năm 2008 giới có 740.000 trường hợp chẩn đoán bị bệnh ung thư gan có 696.000 trường hợp tử vong, đứng thứ ba trường hợp tử vong liên quan đến ung thư (Ju Dong Yang Lewis R Roberts, 2010) Ung thư gan khởi phát từ bệnh gan cấp tính tiến triển thành bệnh gan mãn tính dẫn tới xơ gan ung thư gan Có nhiều nguyên nhân dẫn tới tiến trình kể đến: Do uống rượu, nhiễm virus Hepatitis, hoá chất aflatoxin… Bệnh ngăn ngừa cách kiểm soát yếu tố kể Tuy nhiên, bệnh tiến triển đến giai đoạn xơ gan ung thư găn việc điều trị gặp nhiều khó khăn Trong biện pháp điều trị phổ biến hoá chất, cấy ghép gan, nhiên hiệu điều trị phương pháp thấp Hơn nữa, phương pháp cấy ghép gan phương pháp xâm lấn, ảnh hưởng lớn đến sức khoẻ người bệnh thường gặp tượng thải loại ghép Trước tình hình đó, nhiều liệu pháp đời nhằm nâng cao hiệu điều trị, kể đến như: liệu pháp gene, liệu pháp dẫn thuốc đến mục tiêu, liệu pháp tế bào dựa kết thí nghiệm mô hình chuột bệnh nhân hứa hẹn nhiều triển vọng tiềm ứng dụng cao 1.3 Điều trị tế bào gốc Cơ sở lý thuyết việc sử dụng tế bào gốc điều trị xơ gan Sự tăng sinh, biệt hóa, tiết chức tế bào cấy ghép tế bào nội sinh gan bị ảnh hưởng vi môi trường vùng xơ gan Các bệnh liên quan đến suy thoái tế bào xơ gan ảnh hưởng vi môi trường ngoại bào Chứng ban đầu tái tạo gan sau cắt bỏ phần gan, người ta nhận thấy xuất tín hiệu quan trọng từ prostaglandin; yếu tố định cho tái tạo gan Tín hiệu liên quan đến tăng yếu tố tăng trưởng TGF-beta Gan bị xơ hóa có nồng độ TGF-beta cao, điều dẫn đến apoptosis tế bào gan tác động kháng phân bào xơ hóa Không có vi môi trường thể chủ ảnh hưởng đến tế bào ghép, tín hiệu tế bào ghép tiết làm thay đổi vi môi trường Sự thay đổi vi môi trường vùng xơ gan góp phần cho thành công ca ghép gan Việc cấy ghép tế bào gốc điều trị xơ gan động vật vai trò tế bào gốc vi môi trường vùng xơ gan Một số nghiên cứu khả tiết yếu tố kích thích phân chia tế bào, yếu tố ngoại bào dẫn đến tái tạo nội sinh thể chủ giúp thể sống sót (Makowka et al.) Chẳng hạn, tế bào gốc trung mô tiết số yếu tố ức chế cytokine đáp ứng viêm mô hình chuột bệnh xơ hóa phổi Các tế bào ghép vào vùng tổn thương giúp làm giảm đáp ứng viêm vi môi trường vùng tổn thương, tiết yếu tố kích thích tế bào gốc nội sinh giúp cải thiện tình trạng tổn thương Mặt khác MSC cảm ứng để tuần hoàn vào máu ngoại vi mô hình động vật điều kiện cụ thể Tín hiệu hóa ứng động để dẫn dụ tế bào gốc vào vi môi trường thích hợp cảm ứng luân chuyển chưa hiểu rõ Một số chemokine đề xuất SDF-1 yếu tố tăng trưởng (Growth factor_GF) cho yếu tố hóa ứng động MSC, nhiên chế điều hòa chưa hiểu rõ Điều giải thích cho khả “di cư” tế bào gốc đến vùng tổn thương Điều trị xơ gan cấy ghép tế bào gan tự thân A.Schwarz cộng viện Angewandte Zellkultur (Đức) tiến hành thử nghiệm phương pháp điều trị xơ gan cách chuyển tế bào gan tự thân lượng nhỏ tế bào tụy lên scaffold polymer Sau chuyển ngược lại vào thể bệnh nhân Bằng phương pháp ứng dụng điều trị 57 bệnh nhân bị xơ gan, tỉ lệ sống sót sau năm cấy tế bào 75% tổng số bệnh nhân Cấy ghép tế bào tiền thân gan (tế bào oval) J.M Lemire et al (1991) và X Wang et al (2003) chứng minh tế bào oval có khả biệt hoá thành tế bào gan trưởng thành tế bào biểu mô ống mật M.I Yovchev et al (2008) cấy ghép tế bào oval cho thấy tăng sinh hoà nhập với 90% tế bào gan gan nhận thay tế bào oval cho mô hình chuột C.X Wu et al (2009), tiêm tế bào oval vào gan chuột Wistar bị xơ gan tăng tỉ lệ sống sót Điều trị xơ gan ghép tế bào gốc tuỷ xương Năm 2004, Isao Sakaida cs cấy ghép tế bào gốc tuỷ xưởng kết hợp với CCl4 vào chuột bị xơ hoá gan báo cáo “Transplantation of Bone Marrow Cells Reduces CCl4 Induced Liver Fibrosis in Mice” Kết cho thấy, chuột mô hình bệnh xơ gan giảm đáng kể xơ hoá gan Các nhà khoa học Nhật thuộc đại học Y Yamaguchi đại học y Tokyo tiến hành thử nghiệm điều trị xơ gan mô hình chuột bị gây xơ gan Carbontetrachloride Tế bào từ tủy xương chuyển GFP để quan sát di cư biệt hóa tế bào ghép Kết cho thấy tế bào tủy xương tập trung mô gan bị xơ biệt hóa thành tế bào gan sản xuất albumin, biểu mạnh metalloproteinases (MMPs), làm tăng cường chức gan, đặc biệt biểu hoạt tính MMP-9, làm tăng cường tỷ lệ sống sót chuột bị xơ gan F Anjos-Afonso et al (2004), dùng tế bào gốc tuỷ xương chuột cấy ghép qua tĩnh mạch đuôi cho thấy chuyển biệt hoá thành tế bào giống tế bào gan chuột nhận NOD/SCID M.R Alison et al (2000), thử nghiệm lâm sàng người, sử dụng nhiễm sắc thể giới tính để phân biệt tế bào cấy ghép từ người nhận có giới tính khác biệt M Korbling et al (2002), N.D Theise et al (2000), tế bào gốc từ tuỷ xương hoà nhập vào gan chuyển biệt hoá thành tế bào gan trưởng thành S Nikeghbalian et al., 2011, ghép tự thân tế bào đơn nhân có CD133+ từ tủy xương vào bệnh nhân cho kết khả quan việc điều trị xơ gan Sử dụng tế bào gốc từ mô mỡ A Banas et al (2009) cấy ghép tế bào gốc từ mô mỡ thông qua tiêm tĩnh mạch đuôi chuột , kết cho thấy có biệt hoá tế bào ghép thành tế bào gan trưởng thành chuột BALB/c nude bị xơ gan cảm ứng CCl4 Sử dụng tế bào gốc từ máu cuống rốn P.C Tsai et al (2009) tiến hành tiêm 5x105 tế bào vào thuỳ phải gan chuột bị xơ, kết cho thấy có kiềm chế xơ gan, dù chúng không biệt hoá thành tế bào gan trưởng thành Tác giả đề nghị: tế bào gốc không biệt hoá tiết cytokine định human cutaneous T cell-attracting chemokine, leukemia inhibitory factor, prolactin giúp trì chức gan kích thích tái tạo gan nội sinh Nhóm tác giả Philip N Newsome sử dụng tế bào gốc từ máu cuống rốn điều trị xơ gan mô hình chuột (Philip N Newsome, 2003) Kết cho thấy, tế bào gốc người biệt hoá thành công thành tế bào gan trưởng thành với khả tiết mật bình thường điều kiện in vivo thể chuột NON-SCID Sử dụng tế bào gốc trưởng thành từ máu ngoại vi để điều trị bệnh xơ gan Bệnh viện Hammersmith London, Anh điều trị cho 30 bệnh nhân với phương pháp thu kết đầy hi vọng Máu bệnh nhân thu nhận sau thu lấy tế bào nuôi cấy tăng sinh tế bào đưa tế bào ngược trở lại gan thông qua động mạch Có giảm đáng kể bilirubin sau 12 tuần tiêm tế bào giảm alanine transaminase aspartate transaminase sau tuần tiêm tế bào Sử dụng tế bào gốc phôi điều trị xơ gan D.C Hay et al., (2008) tế bào gốc phôi có khả biệt hoá thành tế bào giống tế bào gan T Teratani et al (2005), Y Kumashiro et al (2005) tiến hành cấy ghép tế bào gan thu từ tế bào gốc phôi vào lách gan tổn thương chuột nhận, tình trạng xơ gan hạn chế, chức gan khả sống cải thiện J Cai et al (2007), dùng tế bào gốc phôi người cấy vào lách chuột suy giảm miễn dịch cho thấy tế bào cấy ghép hoà nhập vào gan tổn thương Sử dụng tế bào gốc cảm ứng đa tiềm (iPS) điều trị xơ gan D Xu et al (2008), cấy ghép tế bào tiền thân nội mô biệt hoá từ tế bào iPS vào gan chuột bị bệnh ưa chảy máu giúp cải thiện hội chứng tỉ lệ sống, iPS sử dụng cho rối loạn di truyền người tương lai 1.4 Tế bào gốc trung mô (MSC) 1.4.1 Giới thiệu Tế bào tủy xương mô tả lần Friedenstein, quần thể tế bào có khả bám trải hình dạng giống nguyên bào sợi có khả biệt hóa thành xương, Friedenstein xem tế bào dạng tế bào tiền thân tạo xương Các nghiên cứu tế bào có khả biệt hóa thành nhiều dòng tế bào thuộc lớp trung mô bao gồm sụn, gân nguyên bào Dựa khả biệt hóa đa dòng này, Caplan đưa thuật ngữ tế bào gốc trung mô (mesenchymal stem cell – MSC), mặc dù có nhiều thuật ngữ khác đưa để mô tả quần thể tế bào không đồng đa tiềm Dù MSC quần thể tế bào gốc (có khả tự làm khả biệt hóa thành nhiều dòng tế bào), câu hỏi đặt liệu đặc tính gốc có hay không chúng dạng tế bào đơn Chính vì vậy, thời gian gần người ta đề xuất thuật ngữ tế bào trung mô đa tiềm (mesenchymal stromal cells) để mô tả tế bào có khả bám vào bề mặt plastic nuôi cấy in vitro có hình dạng giống nguyên bào sợi Bonnet cs chứng minh tế bào đơn từ quần thể MSC tủy xương chuột biểu kháng nguyên đặc biệt phôi, chúng có khả biệt hóa in vivo, chúng thật mang đặc điểm tế bào gốc MSC có khả biệt hóa thành nhiều dòng tế bào xương, mỡ, sụn [2] Các nghiên cứu cho thấy tế bào đa tiềm không biệt hóa thành dòng trung mô mà biệt hóa thành dòng thuộc nội bì ngoại bì thần kinh bao gồm tế bào thần kinh, tế bào gan tế bào nội mô Các tế bào gốc đa tiềm hiểu với nhiều tên gọi tế bào tiền thân trưởng thành đa tiềm (multipotent adult progenitor cells – MAPCs), tế bào gốc đa tiềm từ tủy xương (BM-derived multipotent stem cells – BMSCs), tế bào cảm ứng đa tiềm từ tủy xương (marrow isolated adult multilineage inducible cells –MIAMIs) tế bào gốc giống tế bào gốc phôi nhỏ (very small embryonic-like stem cells – VSELs) Các tế bào đòi hỏi điều kiện nuôi cấy chuyên biệt nghiêm ngặt bao gồm huyết bào thai bò, đĩa nuôi cấy xử lý bề mặt, môi trường chứa yếu tố tăng trưởng chuyên biệt trình nuôi cấy kéo dài mật độ tế bào thấp Việc nuôi cấy tế bào mật độ cao làm cho chúng dễ biệt hóa thành tế bào tiền thân trung mô giới hạn khả biệt hóa Mặc dù nguồn gốc MSC thu nhận từ tủy xương, gần người ta thu nhận quần thể tương tự MSC từ mô mỡ, máu cuống rốn, thai, dịch ối Hiện tại, MSC marker chuyên biệt liên kết marker Về kiểu hình, MSC ex vivo biểu số marker không chuyên biệt như: CD105 (SH2 endoglin), CD73 (SH3 SH4), CD90, CD166, CD44, CD29 MSC âm tính với marker tạo máu nội mô như: CD11b, CD14, CD31, CD45 PHẦN 2: ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU Tên đề tài luận án: Nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh xơ gan mô hình chuột bị xơ gan sử dụng liệu pháp tế bào gốc Tính cấp thiết, ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài - Gan quan có khả tái sinh trường hợp tổn thương mạn tính khả tự tái tạo gan không sau dẫn đến tình trạng xơ hóa Xơ gan bệnh nguy hiểm, tần suất cao, điều trị khó khăn Việt Nam nước có tỷ lệ viêm gan xơ gan cao (~20%) so với nhiều nước Thế giới Các biện pháp điều trị xơ gan chưa thực mang lại kết mong đợi - Hiện phương pháp điều trị có hiệu cho xơ gan (xơ hóa gan) cấy ghép gan Mặc dù cấy ghép gan liệu pháp tốt giúp kéo dài đời sống cho bệnh nhân, việc hiến tặng quan rào cản lớn liệu pháp Số lượng bệnh nhân chờ ghép gan ngày tăng, mô hiến tặng thì ngày khan - Với kiến thức tảng chuyên sâu tế bào gốc y học tái tạo, nhà khoa học đặt niềm tin vào việc sử dụng tế bào gốc tái tạo mô gan bệnh nhân xơ gan Liệu pháp sử dụng tế bào gốc trưởng thành có nhiều ưu điểm như: nguồn thu nhận dồi dào, ghép tự thân, vượt qua rào cản đạo lí - Mô hình động vật xơ gan CCL4 nghiên cứu nhiều, kết thử nghiệm động vật xơ gan có độ tin cậy cao - Việc phát triển liệu pháp ứng dụng tế bào gốc điều trị xơ gan cấp thiết mở hướng điều trị xơ gan nói riêng bệnh thoái hoá tế bào nói chung - Mục đích nghiên cứu luận án Mục tiêu chung: Nghiên cứu điều trị thực nghiệm chuột bệnh xơ gan tế bào gốc Mục tiêu cụ thể: Thu nhận tế bào gốc từ nguồn mẫu: tủy xương mô mỡ chuột Nghiên cứu khả chuyển biệt hóa MSCs thành tế bào gan tác động hóa chất dịch chiết gan Gây tạo mô hình bệnh xơ gan chuột Phân tích đánh giá hiệu điều trị thực nghiệm tế bào gốc thu nhận từ nhiều nguồn khác (tủy xương, mô mỡ,…) chuột bệnh xơ gan theo phác đồ khác Đối tượng, phương pháp nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Nghiên cứu tiến hành dòng tế bào gốc trung mô người hay chuột, chuột nhắt trắng (hoặc chuột Bald-C) - Các phương pháp sử dụng nghiên cứu: Phương pháp 1: Phân lập tế bào gốc trung mô từ tủy xương mô mỡ chuộc Phương pháp 1.1 Phân lập tế bào gốc trung mô từ tủy xương Nguyên tắc: Trong tủy xương, quần thể tế bào thu nhận là: Tế bào hồng cầu (trưởng thành chưa trưởng thành); Tế bào bạch cầu (trưởng thành chưa trưởng thành); Tế bào tủy xương; Tế bào mỡ; Tế bào gốc Trong quần thể tế bào trên, quần thể hồng cầu, bạch cầu trưởng thành tế bào mỡ khả bám vào bề mặt nuôi cấy thời gian ngắn Vì vậy, điều kiện nuôi cấy bám dính, tế bào bị loại bỏ sau lần thay môi trường Tế bào bạch cầu chưa trưởng thành, số tế bào tủy xương có khả bám dính chọn lọc, nhiên điều kiện môi trường nuôi cấy không thích hợp nên đời sống tế bào ngắn Quần thể tế bào gốc chứa loại chính: tế bào gốc tạo máu tế bào gốc trung mô, loại có tế bào gốc trung mô có khả bám dính tăng sinh vô hạn điều kiện in vitro Phương pháp 1.2 Phân lập tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột Mô mỡ chuột thu nhận sử dụng kít tách chiết tế bào gốc mô mỡ ADSC extract Kit (GW Ltd.) để phân tách tế bào gốc Tế bào sau thu nhận nuôi cấy môi trường MSC Cult Pro Kit (GW Ltd.) Phương pháp 2: Khẳng định tế bào gốc sau thu nhận tế bào gốc trung mô Nguyên tắc: Dựa vào khả bám dính MSC vào bề mặt nuôi cấy, sau từ 3-5 lần cấy chuyền thu quần thể tế bào tương đối đồng Thông thường để khẳng định tế bào gốc chuột ứng viên MSC dựa vào tiêu sau: - Về hình thái tế bào: tế bào có hình dạng giống nguyên bào sợi bám dính vào bề mặt dụng cụ nuôi cấy - Về marker bề mặt: MSC từ tủy xương chuột dương tính với CD44, Sca-1 CD90 lại âm tính với CD34, CD11b, CD31, CD106 (Vcam-1), CD117 (ckit) CD135 - Về khả biệt hóa: MSC có khả biệt hóa thành xương, sụn mỡ Trong nghiên cứu này, MSC đánh giá dựa vào tất đặc điểm Về mặt hình thái tế bào, sử dụng kính hiển vi để quan sát hình dạng tế bào suốt thời gian nuôi cấy sơ cấp thứ cấp Marker tế bào đánh giá kỹ thuật Flow cytometry Khả biệt hóa đánh giá thông qua khả biệt hóa MSC thành dạng tế bào: xương mỡ Phương pháp 3: Biệt hóa tế bào gốc trung mô Phương pháp 3.1 Biệt hóa thành nguyên bào xương Nguyên tắc: Sự biệt hóa thành xương xác định trạng thái biệt hóa cuối cùng dòng MSC Một vài cocktail sử dụng cảm ứng tế bào MSC thành nguyên bào xương Sự tiếp xúc thời gian dài MSC với công thức dexamethasone, AsAP beta-glycerolphosphate cho kết tích tụ calcium chất biểu marker tạo xương sialoprotein xương osteocalcin osteonectic Quy trình biệt hóa thành xương: - Môi trường biệt hóa xương DMEM bổ sung 10mM β-glycerolphosphate (Sigma), 50µg ascorbate (Sigma), 10-7 M dexamethasone (Sigma) (Eslami nejad et al., 2006; Phạm Văn Phúc cs, 2009) - Trải tế bào khoảng 10.000 tế bào/cm2 lớp đơn - Nuôi cấy khoảng 14-21 ngày thay môi trường lần/tuần - Nuôi cấy lớp đơn để cố định cho phân tích mô học - Đánh giá kết quả: tế bào sau biệt hóa 21 ngày đánh giá biểu calciumphosphate nhuộm hóa mô Các tế bào dương tính thuốc nhuộm với xét nghiệm cho biệt hóa thành công Phương pháp 3.2 Biệt hóa thành tế bào mỡ Nguyên tắc: Sự biệt hóa tạo mỡ MSC có số điểm quan trọng Sự biệt hóa MSC thành tế bào xương mỡ điều hòa tế nhị cân Với việc bổ sung dexamethasone, indomethacin ascorbate, MSC nuôi cấy lớp đơn vào biệt hóa tạo mỡ Quy trình biệt hóa tạo mỡ - Môi trường biệt hóa mỡ DMEM bổ sung 50 µg indomethacin (Sigma), 50µg ascorbate (Sigma), 10-7 M dexamethasone (Sigma) (Eslami nejad et al., 2006; Phạm Văn Phúc cs, 2009) - Tế bào đạt 80% độ bao phủ nuôi cấy lớp đơn thích hợp cho cảm ứng biệt hóa Nuôi cấy khoảng 21-28 ngày thay môi trường lần/tuần Nuôi cấy lớp đơn để cố định cho phân tích mô học Lipid nhìn thấy rõ vào ngày quan sát kính hiển vi đảo ngược Đánh giá kết quả: Tế bào sau biệt hóa 21 ngày đánh giá tích tụ giọt mỡ tế bào chất cách quan sát kinh hiển vi nhuộm Oil Red Có biện diện tế bào tích tụ giọt mỡ cho trình biệt hóa thành công Phương pháp 4: Nhuộm hóa mô tế bào Phương pháp 4.1 Phương pháp nhuộm Alizarin Red Nguyên tắc: Alizarin(1,2-dihydroxyanthraquinone) loại thuốc nhuộm có nguồn gốc thực vật Trong rễ thiên thảo (Rubia tinctorum), chúng tồn dạng glycoside Alizarin bao gồm nhóm thuốc nhuộm tổng hợp từ dẫn xuất nhựa than đá Alizarin red dẫn xuất Alizarin, sử dụng để phát ion calci có mẫu mô hay tế bào Sự kết hợp ion calci Alizarin red tạo phức hợp Alizarin Red S-calci có màu đỏ cam Phương pháp 4.2 Phương pháp nhuộm Oil red Nguyên tắc: Oil red thuốc nhuộm có màu đỏ, hòa tan lipid Khi nhuộm mẫu tế bào cố định, bất kì nơi có chứa giọt mỡ, Oil Red hòa tan vào làm chúng có màu đỏ Đánh giá kết quả: tế bào mỡ có tích trữ giọt mỡ màu đỏ thuốc nhuộm Phương pháp 4.3 Phương pháp nhuộm Hoechst Nguyên tắc: Hoechst 33258 thuốc nhuộm DNA, gắn vào liên kết A-T DNA Các tế bào không cần tăng thấm trước nhuộm, cần điều kiện sinh lý thích hợp vì hấp thu thuốc nhuộm trình vận chuyển chủ động Điều kiện nhuộm thay đổi tùy theo loại tế bào Quy trình sử dụng cho hầu hết trường hợp nhuộm Hoechst Phương pháp 5: Đánh giá marker tế bào kỹ thuật dòng chảy tế bào (Flow cytometry) Nguyên tắc: Flow cytometry công nghệ định lượng phân tích đa đặc điểm đơn vật thể thông thường tế bào chúng chảy thành dòng xuyên qua chùm ánh sáng Các tính chất định lượng bao gồm kích thước, tính chất hạt mức độ phức tạp bên mật độ phát huỳnh quang Các đặc điểm định việc sử dụng hệ thống đôi quang học – điện tử, chúng ghi nhận phát quang tế bào Quy trình chuẩn bị tế bào cho phân tích Flow cytometry (theo hướng dẫn BD Science) Trong nghiên cứu này, việc đánh giá marker MSC sau nuôi cấy tiến hành dựa theo quy trình tế bào lần cấy chuyền 3-5 chọn để phân tích marker đặc trưng cho MSC Phương pháp 6: Đánh dấu tế bào thuốc nhuộm PKH 26 (Sigma) PKH26GL cell linker kit công nghệ đánh dấu màng tế bào kết hợp với thuốc nhuộm phát quang gắn vào vùng lipid màng tế bào Kít kèm với dung dịch đồng áp suất - 10 thẩm thấu (Diluent C) không chứa muối dung dịch đệm, chất tẩy dung môi hữu dung dịch thiết kế để trì khả sống sót tế bào suốt trình nhuộm Kiểu hình tế bào nhuộm phụ thuộc vào kiểu tế bào màng tế bào PKH26 chất phát quang màu đỏ kiểm tra nhiều hệ thống thiết bị nên thường ứng dụng đánh dấu tế bào in vitro ex vivo, nghiên cứu tăng sinh tế bào in vitro theo dấu tế bào in vitro in vivo Phương pháp 7: Đánh giá biểu gen thuộc dòng tế bào gan phương pháp Real time RT-PCR - Thu nhận RNA tế bào sau biến nạp chọn lọc - Tổng hợp cDNA từ RNA (1µg) sử dụng Superscript First-strand synthesis system (Gibco BRL) - Phản ứng reverse transcription tiến hành nhiệt độ 420C gồm thành phần: 1RT buffer, 1.25 mM Mgcl, mM DTT, 2.5 g random hexamer, 0.5 mM each of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, 50 units enzyme Superscript II (Gibco BRL), (tổng thể tích phản ứng 20 µl) Sau bước này, dùng unit RNase để loại RNA - Thực phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt Phương pháp 8: Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tế bào thuộc dòng tế bào gan MSC sau nuôi cấy khẳng định marker tiềm biệt hóa nuôi môi trường cảm ứng biệt hóa thành tế bào gan thời gian khoảng 10 ngày Các tế bào sau biệt hóa đánh giá biệt hóa mức phiên mã hình thái tế bào Phương pháp 9: Đánh giá tỉ lệ sống chết phương pháp đếm tế bào nhuộm nhân tự động (theo qui trình nhà sản xuất Nucleo Counter) Phương pháp 10: Gây tạo mô hình chuột xơ gan Chuột phân chia thành lô: Lô Đối chứng: cho uống dầu bắp 0,2 ml/con Lô Thí nghiệm: cho uống CCl4 liều 0,5 – 1.2 ml/kg pha dầu olive Cho uống lần/ tuần liên tục tuần Phương pháp 11: Cấy ghép tế bào vào chuột xơ gan Quy trình 11.1 Ghép tế bào vào tĩnh mạch đuôi Trên mô hình chuột, việc tiêm loại thuốc hay tế bào cấy ghép vào tĩnh mạch đuôi chuột phương pháp đơn giản thường nhiều nhà nghiên cứu áp dụng Trong nghiên cứu này, tế bào đưa vào tĩnh mạch đuôi chuột xơ gan Nhóm nghiên cứu hy vọng tế bào nhận tín hiệu từ gan di cư đến gan, cải thiện tình trạng xơ gan Quy trình 11.2 Ghép tế bào vào tĩnh mạch cửa gan Tĩnh mạch cửa gọi tĩnh mạch gánh, vì chia nhánh đầu Tĩnh mạch cửa tạo nên bởi: tĩnh mạch lách, tĩnh mạch mạc treo tràng trên, tĩnh mạch mạc treo tràng Thân tĩnh mạch cửa dài có đường kính lớn Khi tới gan tĩnh mạch cửa phân chia nhỏ dần: đầu tiêu hai nhánh gan trái, gan phải, nhánh tiểu thuỳ tận xoang gan, từ xoang gan máu lại đổ vào tĩnh mạch trung tâm tiểu thuỳ, tĩnh mạch tụ lại thành nhánh tĩnh mạch gan, cuối cùng đổ vào tĩnh mạch chủ tim 11 Trong thí nghiệm này, nhóm nghiên cứu ghép tế bào trực tiếp vào tĩnh mạch cửa gan với hy vọng tế bào gốc di cư đến vùng gan bị xơ nhanh Mặt khác tĩnh mạch cửa gan có đường kính tương đối lớn nên tạo điều kiện dễ dàng cho thao tác tiêm tế bào Khi tế bào qua vùng gan bị xơ, tĩnh mạch nhỏ dần, tế bào có điều kiện thuận lợi để định cư gan Phương pháp 12: Đánh giá tồn tại, sống sót di cư tế bào sau cấy ghép in vivo Các tế bào trước cấy ghép đánh dấu màng tế bào chất phát huỳnh quang (theo phương pháp 6) Dựa đặc điểm theo dõi tồn di cư tế bào thể chuột Nhằm đánh giá sống sót tế bào sau ghép, tiến hành thu nhận vùng mô ghép sau 24 giờ, tiến hành nhuộm nhân tế bào thuốc nhuộm Hoechst Phương pháp 13: Phương pháp hóa mô miễn dịch huỳnh quang Hóa mô miễn dịch trình protein tế bào mô gắn với kháng thể tương ứng chúng theo nguyên tắc kháng nguyên kháng thể Các kháng thể gắn với chất thị phát quang để dễ dàng quan sát Nội dung phạm vi vấn đề sâu nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành nội dung sau: Nội dung 1: Thu nhận, nuôi cấy xác định đặc điểm tế bào gốc Trong nội dung này, tế bào gốc thu nhận từ nhiều nguồn mẫu khác tủy xương mô mỡ Các nguồn thu nhận nhằm hướng đến việc cấy ghép tự thân để hạn chế khả thải loại miễn dịch Việc thực nội dung tiến hành sau: MSC từ tủy xương mô mỡ thu nhận theo Phương pháp Các tế bào gốc trung mô ứng viên sau lần cấy chuyền xác định - Về hình thái tế bào: quan sát kính hiển vi - Về độ tinh dựa vào biểu marker: CD13, CD14, CD34, CD44, CD45, CD90, CD166 HLA-DR kĩ thuật flow cytometry máy FACSCalibur BD Bioscience (theo phương pháp 5) - Về khả biệt hóa: biệt hóa thành tế bào tạo xương mỡ (theo phương pháp 2, 4) Nội dung 2: Gây tạo mô hình chuột bệnh xơ gan CCl4 CCl4 tác nhân gây độc gan điển hình, sử dụng rộng rãi nhiều mô hình thực nghiệm khác giới Việt Nam Liều xử lý CCl thường sử dụng gây độc gan khoảng 0,5 – ml/kg (Ming-Ling Chang cộng sự, 2005; Vũ Thị Ngọc Thanh, Nguyễn Thị Tuyết Mai, 2007) 12 Chuột uống CCl4 liều 0,5 – 1.2 ml/kg pha dầu olive, lần/ tuần liên tục tuần Sau kết thúc xử lí CCl4 tiến hành đánh giá xơ gan dựa tiêu: Chỉ tiêu 1: Xét nghiệm sinh hóa (ALT, AST huyết thanh) Chỉ tiêu 2: Đánh giá mô học Nhuộm HE, trichrome, PAS, reticulin để đánh giá tình trạng nghịch sản, viêm gan, xơ gan mô gan xung quanh u Tình trạng viêm xơ hóa theo thang điểm HAI gồm đặc điểm: hoại tử quanh khoảng cửa, hoại tử quanh tĩnh mạch trung tâm, hoại tử tiểu thùy, viêm khoảng cửa, giai đoạn xơ hóa Chúng đánh giá mức độ viêm gan giai đoạn xơ hóa dựa theo số hoạt tính mô học Knodell-Ishak ( Ishak Modified HAI): mức độ viêm, giai đoạn xơ hóa, liên quan tổng số điểm mức độ hoạt tính viêm Nội dung 3: Xác định biểu gen liên quan đến dòng tế bào gan tế bào MSC cảm ứng MSC thành tế bào gan in vitro Nội dung 3.1 Xác định biểu gen liên quan đến dòng tế bào gan tế bào MSC in vitro Mục tiêu: đánh giá biểu gen có liên quan đến dòng tế bào gan nhằm bước đầu nhận định tiềm MSC trị liệu bệnh xơ gan suy thoái tế bào gan nói chung - Nguyên tắc tiến hành: Tiềm điều trị MSC tiên đoán thông qua biểu gen MSC biểu gen đặc trung cho tế bào thuộc lớp trung bì xương, sụn mỡ Ngoài ra, MSC biểu gen thuộc biểu mô, nội mô tế bào thần kinh Nhiều nghiên cứu tiến hành đánh giá gen liên quan đến phát triển tế bào gan Nhằm mục đích đánh giá tiềm chữa trị thay MSC, nội dung nghiên cứu thiết kế để đánh giá biểu gen MSC hệ tế bào khác Việc khảo sát biểu profile gen MSC hệ khác nhằm đánh giá ảnh hưởng việc nuôi cấy biểu gen tế bào Nội dung tiến hành sau: Các MSC thu nhận từ Nội dung nuôi cấy tăng sinh để đảm bảo đủ số lượng hệ phục vụ cho nghiên cứu Tế bào hệ thứ 3, 10 tiến hành khảo sát biểu gen mức phiên mã theo Phương pháp Các gen dự định tiến hành phân tích bao gồm gen liên quan đế phát triển biệt hóa tế bào gan albumin, Muc-1, AFP, ALB, CK18 CK19 Kết nội dung: kết so sánh biểu gen liên quan đến tiềm biệt hóa thành tế bào gan nguồn MSC hệ tế bào khác Nội dung 3.2 Cảm ứng biệt hóa MSC thành tế bào gan - Mục tiêu: đánh giá khẳng định khả chuyển biệt hóa MSC thành tế bào gan - Nguyên tắc tiến hành: theo nhiều nghiên cứu MSC chưa biệt hóa có biểu số gen quan trọng liên quan đến phát triển, biệt hóa tế bào gan Điều cho 13 thấy, MSC hoàn toàn có khả biệt hóa thành tế bào gan cảm ứng với kích thích định Nhiều nhóm nghiên cứu tiến hành cảm ứng MSC môi trường cho tế bào gan nhằm mục đích chứng minh khả chuyển biệt hóa MSC thành tế bào gan Nội dung tiến hành sau: Nội dung 3.2.1: Đánh giá thay đổi MSCs tác động hóa chất cảm ứng định hướng thành tế bào gan Các MSC nuôi cấy môi trường cảm ứng (IMDM bổ sung 20 ng/mL HGF, 0.5 uM dexamethasone, and 50 mg/mL ITS+) 14 ngày Sau , nuôi cấy môi trường trưởng thành cho tế bào gan (IMDM bổ sung 20 ng/mL OSM, 0.5 uM dexamethasone, and 50 mg/mL ITS+), thời gian cảm ứng biệt hóa từ 30-40 ngày Nội dung 3.2.2: Đánh giá thay đổi MSCs tác động dịch chiết gan Các MSC nuôi cấy môi trường bổ sung dịch chiết gan (gan lành gan xơ) nồng độ khác Sau đó, tế bào biệt hóa đánh giá: - Sự thay đổi kiểu hình tế bào - Sự thay đổi biểu gen Muc-1, AFP, CK18, CK19 alpha-1 antitrypsin (AAT), tyrosine amino transferase (TAT), LDL receptor (LDLR), glucose 6-phosphatase (G6P) (theo phương pháp 7) Kết so sánh với house keeping gene MSC đối chứng chưa biệt hóa - Chức tế bào biệt hóa đánh giá thông biểu protein ALB, AAT, albumin phương pháp hóa mô miễn dịch (phương pháp 13) Nghiên cứu tiến hành lặp lại lần, số mẫu sử dụng 10 mẫu cho lô; số lượng tế bào đánh giá mẫu 105 tế bào Tất số liệu thu được phân tích phần mềm thống kê, với độ tin cậy 95% Nội dung 4: Thử nghiệm điều trị chuột bệnh xơ gan cấy ghép tế bào gốc Tế bào gốc thu nhận từ nội dung chuột xơ gan từ nội dung sử dụng cho nội dung nghiên cứu Chuột xơ gan CCL4 đạt yêu cầu tiêu sinh hóa mô học sử dụng để nghiên cứu Trong nghiên cứu gồm nghiệm thức sau: Tiến hành theo nghiệm thức sau: 14 Tủy xương chuột (đồng ghép) Mô mỡ người (Ghép tự thân) Tế bào gốc trung mô Tĩnh mạch Chuột mô hình xơ gan Xét nghiệm sinh hóa Tĩnh mạch cửa gan Đánh giá mô học - Nghiệm thức 1: chuột xơ gan đối chứng không ghép tế bào (tiêm PBS) - Nghiệm thức 2: chuột không gây mô hình bệnh (chuột thường) - Nghiệm thức 3,4,5: ghép 106 tế bào từ tủy xương vào tĩnh mạch, tĩnh mạch cửa gan - Nghiệm thức 6,7,8: ghép 106 tế bào từ mô mỡ vào tĩnh mạch, tĩnh mạch cửa gan Chuột sau ghép tế bào kiểm tra, đánh giá hồi phục dựa tiêu: Về phục hồi sức khỏe chuột phục hồi bệnh - Sự thay đổi men gan thông qua xét nghiệm sinh học - Sự thay đổi cấu trúc mô học Về vai trò tế bào gốc - Sự di cư/cư trú tế bào ghép sau ghép - Sự biệt hóa tế bào ghép sau sát nhập - Sự hình thành khối u sau ghép Dự kiến kết đạt - Quy trình thu nhận tế bào gốc trung mô từ tủy xương mô mỡ - Kết biểu gen liên quan đến dòng tế bào gan MSC in vitro hệ tế bào khác - Kết biệt hóa MSC thành tế bào gan - Mô hình chuột bệnh xơ gan CCl4 - Kết điều trị chuột bệnh xơ gan MSC với phác đồ khác 15 Nơi thực đề tài nghiên cứu luận án Nghiên cứu thực tại: PTN Nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc, ĐH KHTN, ĐH Quốc gia Tp.HCM Các tài liệu tham khảo sử dụng viết đề cương [1] Autologous bone marrow cells in the treatment of cirrhosis of the liver; Chernykh ER, Starostina NM, Paltsev AI, Leplina OY, Shevela EY, et al.; Bull Exp Biol Med; 2007; 144: 640–645 [2] Autologous Transplantation of Bone Marrow-derived Mononuclear and CD133+ Cells in Patients with Decompensated Cirrhosis; Saman Nikeghbalian MD1*, Behshad Pournasr MSc, Nasser Aghdam, Alireza Rasekhi, Bita Geramizadeh, Seyed Mohammad Kazem Hosseini-Asl, Mani Ramzi, Farzad Kakaei, Mehrnaz Namiri, Reza Malekzadeh, Ahmad Vosough Dizaj, Seyed Ali Malek-Hosseini, Hossein Baharvand; Archives of Iranian Medicine, 2011, 14 (1) [3] Cell-delivery therapeutics for liver regeneration; Wenxia Zhang, Lisa Tucker-Kellogg, B.C Narmada, Lakshmi Venkatraman, Shi Chang, Yin Lu, Nancy Tan, Jacob K White, Ruirui Jia, Sourav Saha Bhowmick, Shali Shen, C Forbes Dewey Jr., Hanry Yu; Advanced Drug Delivery Reviews, 2010, 62: 814–826 [4] Critical review of clinical trials of bone marrow stem cells in liver disease; Houlihan DD, Newsome PN; Gastroenterology; 2008; 135: 438 – 450 [5] Improved liver function in patients with liver cirrhosis after autologous bone marrow cell infusion therapy; Terai S, Ishikawa T, Omori K, Aoyama K, Marumoto Y, Urata Y, et al.; Stem Cells 2006; 24: 2292 - 2298 [6] Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial; Kharaziha P, Hellstrom PM, Noorinayer B, Farzaneh F, Aghajani K, Jafari F, et al Eur J Gastroenterol Hepatol 2009; 21: 1199 – 1205 [7] Liver cell transplantation: the road to clinical application; K.J Allen, H.E Soriano; J Lab Clin Med.; 2001; 138: 298–312 [8] Liver fibrosis: from mechanisms to treatment; Scott L Friedman; Gastroenterol Clin Biol 2007; 31: 812-814 [9] Liver fibrosis; Ramón Bataller1 and David A Brenner2; The Journal of Clinical Investigation 2005 115 (2):209–218 [10] Liver transplantation: from Child to MELD ; J.F Gallegos-Orozco, H.E Varga;, Med Clin North Am.; 2009; 93: 931–950 ix [11] Mechanisms of Hepatic Fibrogenesis; Scott L Friedman; Gastroenterology; 2008 May; 134(6): 1655–1669 [12] Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor; Tsutomu Fujii†1, Bryan C Fuchs†1, Suguru Yamada1, Gregory Y Lauwers2, Yakup Kulu1, Jonathan M Goodwin3, Michael Lanuti3 and Kenneth 16 K Tanabe*1; BMC Gastroenterology 2010, 10:79 [13] Phase trial of autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in patients with decompensated liver cirrhosis; Mohamadnejad M, Alimoghaddam K, Mohyeddin-Bonab M, Bagheri M, Bashtar M, Ghanaati H, et al Arch Iran Med 2007; 10: 459 – 466 [14] Reduction of Liver Fibrosis by Xenogeneic Human Umbilical Cord Blood and Adipose Tissue-derived Multipotent Stem Cells without Treatment of an Immunosuppressant; Yeong-Geon Lee, Jae-Woong Hwang, Sang-Bum Park, IlSeob Shin, Soo-Kyung Kang, Kwang-Won Seo, Yong-Soon Lee1 and KyungSun Kang; Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 2008, ( 4~6): 613621 [15] Stem cell therapy for liver disease: parameters governing the success of using bone marrow mesenchymal stem cells; Kuo TK, Hung SP, Chuang CH, Chen CT, Shih YR, Fang SC, et al.; Gastroenterology 2008; 134: 2111 – 2121, 2121 e1–3 [16] Transplantation of bone marrow cells reduces CCl4-induced liver _brosis in mice; Sakaida I, Terai S, Yamamoto N, Aoyama K, Ishikawa T, Nishina H, et al Hepatology; 2004; 40: 1304 – 1311 [17] Transplanted Human Amniotic Membrane-Derived Mesenchymal Stem Cells Ameliorate Carbon Tetrachloride-Induced Liver Cirrhosis in Mouse; DingGuo Zhang, MinYue Jiang, DengShun Miao*; PLoS ONE; 2011; 6(2): e16789 [18] Treatment of cirrhosis and liver failure in rats by hepatocyte xenotransplantation ; H Nagata, M Ito, J Cai, A.S Edge, J.L Platt, et al.; Gastroenterology; 2003; 124: 422–431 [19] Treatment of liver failure in rats with end-stage cirrhosis by transplantation of immortalized hepatocytes ; J Cai, M Ito, H Nagata, K.A Westerman, D Lafleur, et al.; Hepatology; 2002; 36: 386–394 17 [...]... kháng thể tương ứng của chúng theo nguyên tắc kháng nguyên kháng thể Các kháng thể được gắn với các chất chỉ thị hoặc phát quang để dễ dàng quan sát 5 Nội dung và phạm vi của vấn đề sẽ đi sâu nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành các nội dung sau: Nội dung 1: Thu nhận, nuôi cấy và xác định đặc điểm của tế bào gốc Trong nội dung này, các tế bào gốc được thu nhận từ nhiều nguồn mẫu khác nhau như tủy xương và. .. bệnh xơ gan do CCl4 - Kết quả điều trị chuột bệnh xơ gan bằng MSC với các phác đồ khác nhau 15 7 Nơi thực hiện đề tài nghiên cứu của luận án Nghiên cứu này sẽ thực hiện tại: PTN Nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc, ĐH KHTN, ĐH Quốc gia Tp.HCM 8 Các tài liệu tham khảo được sử dụng khi viết đề cương [1] Autologous bone marrow cells in the treatment of cirrhosis of the liver; Chernykh ER, Starostina NM,... dung môi hữu cơ và dung dịch này được thiết kế để duy trì khả năng sống sót của tế bào trong suốt quá trình nhuộm Kiểu hình tế bào nhuộm phụ thuộc vào kiểu tế bào và màng tế bào PKH26 là chất phát quang màu đỏ và có thể kiểm tra bằng nhiều hệ thống thiết bị nên thường ứng dụng trong đánh dấu tế bào in vitro và ex vivo, nghiên cứu sự tăng sinh tế bào in vitro và theo dấu tế bào in vitro và in vivo Phương... gen đặc trung cho tế bào thuộc lớp trung bì như xương, sụn và mỡ Ngoài ra, MSC cũng biểu hiện các gen thuộc biểu mô, nội mô và tế bào thần kinh Nhiều nghiên cứu đã và đang tiến hành đánh giá các gen liên quan đến sự phát triển tế bào gan Nhằm mục đích đánh giá tiềm năng chữa trị và thay thế của MSC, nội dung nghiên cứu này được thiết kế để đánh giá sự biểu hiện gen của MSC ở các thế hệ tế bào khác nhau... 11: Cấy ghép tế bào vào chuột xơ gan Quy trình 11.1 Ghép tế bào vào tĩnh mạch đuôi Trên mô hình chuột, việc tiêm các loại thuốc hay tế bào cấy ghép vào tĩnh mạch đuôi chuột là phương pháp đơn giản nhất và thường được nhiều nhà nghiên cứu áp dụng Trong nghiên cứu này, tế bào được đưa vào tĩnh mạch đuôi chuột đã xơ gan Nhóm nghiên cứu hy vọng tế bào sẽ nhận được các tín hiệu từ gan và di cư đến gan,... từ nội dung 1 và chuột xơ gan từ nội dung 2 được sử dụng cho nội dung nghiên cứu này Chuột xơ gan bằng CCL4 đạt yêu cầu về chỉ tiêu sinh hóa và mô học sẽ được sử dụng để nghiên cứu Trong nghiên cứu này gồm các nghiệm thức sau: Tiến hành theo các nghiệm thức sau: 14 Tủy xương chuột (đồng ghép) Mô mỡ người (Ghép tự thân) Tế bào gốc trung mô Tĩnh mạch Chuột mô hình xơ gan Xét nghiệm sinh hóa Tĩnh... (Vcam-1), CD117 (ckit) và CD135 - Về khả năng biệt hóa: các MSC có khả năng biệt hóa thành xương, sụn và mỡ Trong nghiên cứu này, các MSC được đánh giá dựa vào tất cả các đặc điểm trên Về mặt hình thái tế bào, sử dụng kính hiển vi để quan sát hình dạng các tế bào trong suốt thời gian nuôi cấy sơ cấp và thứ cấp Marker tế bào được đánh giá bằng kỹ thuật Flow cytometry Khả năng biệt hóa được đánh giá thông qua... triển và biệt hóa tế bào gan albumin, Muc-1, AFP, ALB, CK18 và CK19 Kết quả của nội dung: kết quả so sánh sự biểu hiện gen liên quan đến tiềm năng biệt hóa thành tế bào gan của 3 nguồn MSC ở các thế hệ tế bào khác nhau Nội dung 3.2 Cảm ứng biệt hóa MSC thành tế bào gan - Mục tiêu: đánh giá và khẳng định khả năng chuyển biệt hóa của MSC thành tế bào gan - Nguyên tắc và tiến hành: theo nhiều nghiên cứu. .. Việc khảo sát sự biểu hiện profile gen của MSC ở các thế hệ khác nhau nhằm đánh giá sự ảnh hưởng của việc nuôi cấy trên sự biểu hiện gen của tế bào Nội dung này được tiến hành như sau: Các MSC được thu nhận từ Nội dung 1 được nuôi cấy và tăng sinh để đảm bảo đủ số lượng và thế hệ phục vụ cho nghiên cứu Tế bào ở thế hệ thứ 3, 5 và 10 được tiến hành khảo sát sự biểu hiện gen ở mức phiên mã theo Phương... hướng dẫn của BD Science) Trong nghiên cứu này, việc đánh giá marker của MSC sau nuôi cấy được tiến hành dựa theo quy trình này và các tế bào ở lần cấy chuyền 3-5 được chọn để phân tích marker đặc trưng cho MSC Phương pháp 6: Đánh dấu tế bào bằng thuốc nhuộm PKH 26 (Sigma) PKH26GL cell linker kit là công nghệ đánh dấu màng tế bào kết hợp với thuốc nhuộm phát quang gắn vào vùng lipid của màng tế bào