Mục lục Tóm tắt kết khóa luận Tên đề tài Nghiên cứu số điều kiện nuôi cấy mô sẹo để thu sinh khối tái sinh Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) Đối tợng Thí nghiệm đợc tiến hành củ Trinh nữ hoàng cung Mục tiêu Nhằm tạo đợc nguồn giống đồng đều, bệnh, giữ đợc đặc tính quý nguyên liệu ban đầu với hệ số nhân giống cao gấp nhiều lần so với sử dụng phơng pháp nhân giống truyền thống Kết 1) Chế độ khử trùng phù hợp mẫu củ Trinh nữ hoàng cung chế độ (cồn 70% 30 giây, javen 50% phút) cho tỷ lệ sống cao 2) Môi trờng có tỷ lệ tạo mô sẹo cao môi trờng TN3 (MS + 30 g/l đờng + g/l agar + mg/l NAA) môi trờng TD3 (MS + 30 g/l đờng + g/l agar + mg/l 2,4-D) Ngoài môi trờng TN4 (MS + 30 g/l đờng + g/l agar + 2,5 mg/l NAA) TD4 (MS + 30 g/l đờng + g/l agar + 2,5 mg/l 2,4-D) cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao 3) Môi trờng NB6 (MS + g/l agar + 30 g/l đờng + 1,5 mg/l NAA + mg/l BAP) môi trờng NK6 (MS + g/l agar + 30 g/l đờng + 1,5 mg/l NAA + mg/l kinetin) thích hợp cho nhân sinh khối mô sẹo 4) Môi trờng thích hợp cho tái sinh TNHC từ mô sẹo lõi củ MB (MS + g/l agar + 30 g/l đờng + 100 mg/l nớc dừa + 0,5 mg/l NAA + mg/l BAP) MK4 (MS + g/l agar + 30 g/l đờng + 100 mg/l nớc dừa + 0,5 mg/l NAA + mg/l kinetin) 5) Môi trờng CB3 (MS + 0,5 mg/l IBA + 0,2 mg/l GA + mg/l BAP + g/l agar + 30 g/l đờng) thích hợp cho việc nhân chồi TNHC 6) Môi trờng IR3 (MS/2 + 1,5 mg/l IBA + g/l agar) thích hợp để tạo TNHC in vitro hoàn chỉnh Mở đầu Cuộc sống ngày đại ngời lại phải đối mặt với nhiều bệnh nguy hiểm, đặc biệt bệnh u xơ ung th Theo số thống kê hàng năm số ngời chết bệnh u xơ, ung th giới số ngời tử vong ung th tuyến tiền liệt tử cung gây Hoa Kỳ Châu Âu đợc xếp vào hàng đầu [24] Tại Hoa Kỳ có 11,7 triệu ngời mắc bệnh u xơ, có 400000 ngời tử vong bệnh u xơ tuyến tiền liệt u xơ tử cung Việt Nam, 50% phụ nữ bị u xơ tử cung không biểu kịch tính cắt u xơ tỷ lệ tái phát khoảng 10% Vì vậy, với nguyện vọng to lớn tìm kiếm từ thảo dợc viên thuốc phục vụ sức khỏe cộng đồng, nhà khoa học tập trung nghiên cứu để tìm loài thảo dợc chứa chất có hoạt tính chống ung th Năm 1980, nhà khoa học quan tâm hàng đầu đến việc nghiên cứu thành phần hoá học thuốc có nhiều tác dụng dợc lý Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) Từ lâu, Trinh nữ hoàng cung (TNHC) thuốc dân gian có nhiều tác dụng việc chữa bệnh nhân dân ấn Độ, Việt Nam, Trung Quốc nh bệnh bong gân, thấp khớp, mụn nhọt, áp xe, tê thấp, đau nhức Gần đây, nhà khoa học khám phá TNHC dợc liệu có tác dụng điều trị u xơ tuyến tiền liệt nam giới u xơ tử cung phụ nữ đặc biệt chống ung th Họ tìm dịch chiết TNHC có chứa chất có hoạt tính chống ung th, hợp chất Alcaloid - chất hữu mang tính chất kiềm có tác dụng tích cực y học chống ung th [3] Hiện nay, để tiện cho việc sử dụng điều trị bệnh TNHC đợc chế biến thành nhiều sản phẩm khác thuốc Panacrin, Crila, Katana, chè tan Bởi vậy, vấn đề đặt cần phải cung cấp đủ nguồn nguyên liệu đáp ứng số lợng chất lợng cho việc sản xuất sản phẩm từ TNHC Do đó, năm qua nhà khoa học tìm kiếm phơng pháp thích hợp với việc ứng dụng thành tựu khoa học nhân giống TNHC Một phơng pháp nhân giống vô tính kỹ thuật nuôi cấy in vitro Đây phơng pháp thể tính u việt việc nhân nhanh dòng chọn lọc, có phẩm chất tốt, hàm lợng thành phần hoá học có tác dụng dợc lý cao, tạo nguồn giống đồng đều, bệnh, giữ đợc đặc tính quý nguyên liệu ban đầu với hệ số nhân giống cao gấp nhiều lần so với phơng pháp nhân giống truyền thống Xuất phát từ ý nghĩa khoa học trên, tiến hành đề tài : Nghiên cứu số điều kiện nuôi cấy mô sẹo để thu sinh khối tái sinh Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) với nội dung sau: Nghiên cứu chế độ khử trùng phù hợp với mẫu củ TNHC Nghiên cứu ảnh hởng nồng độ NAA, 2,4-D đến khả tạo mô sẹo từ củ TNHC Nghiên cứu ảnh hởng tổ hợp NAA, BAP kinetin đến khả nhân sinh khối mô sẹo Nghiên cứu ảnh hởng tổ hợp NAA, BAP, nớc dừa kinetin đến khả tái sinh Nghiên cứu ảnh hởng kết hợp IBA, GA3 BAP đến khả nhân chồi Nghiên cứu ảnh hởng IBA đến khả tạo hoàn chỉnh Chơng Tổng quan tài liệu 1.1 Sơ lợc Trinh nữ hoàng cung 1.1.1 Nguồn gốc vị trí phân loại Trinh nữ hoàng cung (TNHC) có nguồn gốc từ ấn Độ Tên khoa học TNHC Crinum latifolium L Loài latifolium thuộc chi Crinum, họ Thuỷ tiên (Amaryllidaceae), hành (Liliales), lớp hành (Liliopsida - lớp mầm), phân lớp hành (Liliidae), ngành hạt kín Magnoliophyta, giới thực vật [4] Họ thủy tiên (Amaryllidaceae) có 13 chi Trong chi Crinum có khoảng 100 loài, phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới, số loài đợc trồng làm cảnh làm thuốc tơng đối phổ biến [3] 1.1.2 Đặc điểm sinh thái hình thái Trinh nữ hoàng cung 1.1.2.1 Đặc điểm sinh thái TNHC a ẩm, a sáng, sinh trởng phát triển tốt điều kiện khí hậu nóng, ẩm vùng nhiệt đới với nhiệt độ trung bình từ 22 0C - 270C, độ ẩm 60% 70%, lợng ma 1500 mm/năm Việt Nam, TNHC hoa hàng năm nhng không đậu quả, sinh trởng mạnh mùa xuân hè, mùa hoa vào tháng Cây trồng tỉnh phía Bắc có tợng tàn lụi vào mùa đông Cây có khả đẻ nhánh khoẻ, hàng năm có thêm - hành từ thân hành mẹ, trồng đợc năm tạo thành khóm lớn, có đến 20 nhánh tuổi khác Tuy nhiên, năm hầu nh không đẻ nhánh Từ năm thứ hai trở bắt đầu đẻ nhánh Vì vậy, tốc độ nhân giống chậm [3] 1.1.2.2 Đặc điểm hình thái TNHC thuộc họ thuỷ tiên (Amaryllidaceae) nên mang số đặc điểm chung họ nh thân hành hình củ, mọng nớc Bao hoa thờng hợp, có phần phụ vùng trong, nhị 6, bầu dới [2] Bên cạnh đó, TNHC có đặc điểm riêng nh sau: Hình Cây hoa Trinh nữ hoàng cung Thân TNHC loại thảo mộc mọc lên từ thân hành dới mặt đất Nó cỏ lâu năm cao khoảng m [26] Thân hành to, hình cầu hình trứng, trông giống nh củ hành tây, đờng kính - 10 cm, đợc phủ vảy hình to, dày, màu trắng, bẹ úp vào tạo thành thân giả dài khoảng 10 15 cm [3], [9], [22] Lá Lá mọc từ thân hành, mỏng hình dải dài 60 - 90 cm, rộng - 11 cm, mép l ợn sóng Gân song song, mặt lõm thành rãnh, mặt dới có sống rõ Gốc phẳng có bẹ nơi sát đất màu đỏ tím Đầu nhọn tù, bắc rộng hình thìa dài cm, màu lục, đầu nhọn [3], [5], [19], [22] Rễ TNHC loại sống địa sinh có hệ rễ chùm rễ không phát triển Rễ to, có số lợng nhiều Kích thớc rễ tơng đối đồng Hoa Hoa hợp, mọc thành tán gồm - 18 hoa cán hoa dài 30 - 60 cm, có bẹ hình tam giác màu xanh ve, dài từ - cm, cuống hoa ngắn Cánh hoa màu trắng pha hồng Bao hoa cong dài - 10 cm, gồm phiến nhau, hàn liền 1/3 thành ống hẹp, nở đầu phiến quăn lại, nhị bầu hạ Bao phấn hình sợi dài 20 - 25 mm, đính lng, bầu hình ống chỉ, vòi nhị mảnh vợt lên nhị [3], [5], [7], [9] Quả Quả có hình cầu, gặp Việt Nam, không đậu Hạt TNHC thuộc hành nên hạt chứa nội nhũ 1.1.3 Tác dụng dợc lý Trong y học dân gian, TNHC có hữu ích điều trị bệnh nghiêm trọng nh u xơ tuyến tiền liệt, u xơ tử cung Nó đợc sử dụng để làm tăng cờng miễn dịch qua trung gian tế bào hoạt động có hiệu việc hoạt hoá lympho T Đồng thời, TNHC đợc sử dụng trờng hợp giảm oxy huyết, viêm, giải độc, phục hồi mô cân hoocmon Nớc ép đợc sử dụng đau tai, thấp khớp bong gân [26] Panacrin chế phẩm đợc bào chế từ hỗn hợp dợc liệu: TNHC, củ tam thất đu đủ đợc nghiên cứu tác dụng chống ung th Trên mô hình gây u báng thực nghiệm cách cấy truyền xoang bụng chuột nhắt trắng tế bào u báng Sarcom TG-180, thuốc có tác dụng làm giảm sinh khối u hay giảm tổng số tế bào ung th, đồng thời làm giảm số gián phân tế bào ung th Panacrin đợc dùng cho nhóm bệnh nhân ung th dày, ung th gan u lympho ác tính, qua kiểm chứng thấy đợc dung nạp tốt có tác dụng không mong muốn Trong mô hình gây ung th đùi thực nghiệm tiêm vào đùi chuột trắng tế bào u báng Sarcom TG-180, Panacrin có tác dụng hạn chế phát triển khối u hạn chế di tế bào ung th từ u đùi lên gan, phổi, lách Thuốc có tác dụng kéo dài thời gian sống chuột mang ung th đợc điều trị gần gấp đôi so với chuột đối chứng mang ung th [3] Tác dụng TNHC chủ yếu phụ thuộc vào alkaloid chúng Một số alkaloid nh Lycorin ức chế tổng hợp protein ADN tế bào chuột ức chế phát triển u báng cấy chuột Trong thử nghiệm in vivo, lycorin làm giảm khả sống tế bào u Lycorin-O-glycosid gây kích thích tế bào lympho lách chuột nhắt trắng, có tác dụng điều hoà miễn dịch Pseudoglycorin có tác dụng làm ngừng phát triển tế bào Hela, ngăn cản tổng hợp protein tế bào u báng làm chậm lại trình tổng hợp ADN [3], [8] TNHC dợc liệu quan trọng sản xuất thuốc viên Crila Đây sản phẩm 100% chiết suất từ TNHC Việc bào chế Crila - viên tân d ợc có khả ức chế phát triển khối u đợc hội đồng nhà khoa học Việt Nam chấp nhận Đây tin vui cho bệnh nhân bị phì đại tuyến tiền liệt u xơ tử cung Khả điều trị phì đại tuyến tiền liệt crila đạt 89,18% (2005) u xơ tử cung đạt 79,5% (2007) [23], kết đợc hội đồng khoa học quốc gia kiểm nghiệm lâm sàng Việt Nam theo quy chế 371 y tế Crila có khả làm giảm thể tích tiết tiền liệt đồng thời cải thiện tiểu tiện tăng chất lợng sống bệnh nhân Trong kiểm nghiệm lâm sàng thể tích khối u giảm 33% thời gian điều trị 60 ngày [25] Loại thuốc mở hớng điều trị bệnh nan y phơng pháp kích thích hệ miễn dịch với loại sản phẩm có nguyên liệu từ loại cỏ thiên nhiên độc hại Nh vậy, TNHC tác dụng chữa bệnh y học dân gian mà có khả chống ung th kích thích miễn dịch Tất công dụng TNHC đợc nhà khoa học khám phá nhằm đáp ứng nhu cầu chữa bệnh ung th - nhu cầu hàng đầu mà toàn giới quan tâm 1.1.4 Thành phần hoá học Nhận thấy tác dụng dợc lý TNHC, nhà khoa học nhiều nớc tiến hành nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính chủ yếu từ năm 1980 Bằng phơng pháp thông thờng nhà khoa học định tính sơ nhóm hợp chất quan trọng có phận TNHC nh chất alkaloid, saponin, axit hữu chất chống oxi hoá [6] Trong hợp chất alkaloid nhóm chất quan trọng Alkaloid chất hữu có tính kiềm, có vị đắng Các alkaloid thuộc hai nhóm là: dị vòng không dị vòng Năm 1984, Ghosah phân lập xác định từ cán hoa TNHC glucoalkaloid có tên latisolin Khi bị thuỷ phân enzyme thu đợc aglycon có tên latisodin Ghosal Shibnath phân lập đợc từ thân hành lúc hoa pratorimin pratosin alkaloid pyrolophenanthrindon với chất đợc biết nh paratorimin, ambelin lycorin Năm 1986, Ghosal công bố tách chiết đợc từ TNHC số dẫn xuất alkaloid có tác dụng chống ung th nh crinafolonin crinafolin Năm 1989, ông chiết đợc từ dịch ép cán hoa hai alkaloid có nhân pyrolophennanthridin 2-epilycorin 2epipancrassidin [9] Một số nhà khoa học Nhật Bản tìm thấy số chất alkaloid khác từ TNHC nh beladin, pratorin (hippadin), latidin, 11-o- acetylambelin , 11-o-acetyl 1,2-epoxyambelin, epilicorin, epipancrassidin [3] Qua xác định hoạt tính có TNHC số nhà khoa học Việt Nam thấy có 23 - 43 loại alkaloid tuỳ theo thời kỳ hoa hay sau hoa, carotenoid, saponin, acid uronic counarin [25] Saponin thuộc nhóm steroid, thành phần genin có chứa nhóm -OH, -CO, -CH 3, -CH2 Thân rễ chứa hai glucan A glucan B Glucan A gồm 12 đơn vị glucose, glucan B có khoảng 110 gốc glucose Ngoài thành phần khác tiếp tục đợc nhà khoa học nghiên cứu 1.2 Tình hình sử dụng Trinh nữ hoàng cung Việt Nam giới 1.2.1 Trên giới Cây có nguồn gốc từ ấn Độ, đợc trồng rộng rãi nhiều nớc khu vực Đông Nam nh Thái Lan, Malaysia, Philippin, Campuchia, Lào, Việt Nam phía nam Trung Quốc [3] ấn Độ, nhân dân dùng thân hành TNHC xào nóng, giã đắp để trị thấp khớp, dùng đắp trị mụn nhọt áp xe để gây mng mủ; Dịch ép thuốc nhỏ tai chữa đau tai Campuchia, nhân dân dùng TNHC để điều trị bệnh phụ khoa Ngoài ra, thân hành TNHC đợc sử dụng nh loại thực phẩm Thái Lan Bộ phận sử dụng thân hành cán hoa đợc thái nhỏ, phơi khô để dùng dần 1.2.2 Đối với Việt Nam Việt Nam từ bao giờ, ngời dân thấy thuốc quý mọc hoang ven suối rừng Huế, Đà Nẵng, Nha Trang số địa phơng tỉnh phía Nam Và nay, TNHC có mặt ba miền Bắc, Trung Nam Trong xác định đợc vùng đất Long Thành (tỉnh Đồng Nai) đất thích hợp cho phát triển TNHC Bộ phận sử dụng dùng tơi hay phơi khô thái nhỏ dùng dần tỉnh phía Nam, TNHC đợc dùng phổ biến để chữa bệnh đờng tiết liệu Ngoài ra, Việt Nam nhân dân sử dụng TNHC làm cảnh hoa có màu sắc đẹp Tình hình sử dụng TNHC nớc giới đòi hỏi phải có phơng pháp nhân giống thích hợp đáp ứng đợc nhu cầu sử dụng nhân dân Trong phơng pháp hữu hiệu phơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.3 Nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào (NCMTB) thực vật phơng pháp sử dụng điều kiện nhân tạo để trì sống tế bào thực vật điều kiện in vitro Mục đích chung NCMTB thực vật sử dụng điều kiện nh ánh sáng, nhiệt độ, thành phần dinh dỡng, chất điều hoà sinh trởng để điều khiển trình sinh trởng phát triển tế bào, mô nuôi cấy theo mục tiêu đặt [14] 1.3.1 Vài nét lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật NCMTB thực vật hình thành từ vài thập kỷ trớc mà sở đợc thí nghệm Harberlandt (1898 - 1902) ông đa giả thuyết Schleiden Schwann vào thực nghiệm thể sinh vật phức tạp gồm nhiều đơn vị nhỏ tế bào hợp thành Các tế bào phân hoá mang thông tin di truyền có tế bào đầu tiên, trứng sau thụ tinh đơn vị độc lập, từ xây dựng lại toàn thể [11] Và Harberlandt ngời đề xớng tính toàn tế bào (totipotency), nghĩa tế bào thể sinh vật đa bào có khả tiềm tàng để phát triển thành cá thể hoàn chỉnh gặp điều kiện thuận lợi Tiếc thay, thí nghiệm ông không thành công Năm 1922, Kotte Robbins lập lại thí nghiệm Harberlandt với đỉnh sinh Đối với tạo chồi, môi trờng MB4 (2 mg/l BAP) có mô sẹo tạo chồi với tỷ lệ 7,69% Còn công thức khác cha có tạo chồi Do đó, ban đầu rút kết luận môi trờng MB4 sử dụng nồng độ NAA 0,5 mg/l kết hợp với nồng độ mg/l BAP thích hợp cho tái sinh TNHC từ mô sẹo điều kiện này, tỷ lệ mô sẹo tạo rễ cao có mô sẹo tạo chồi ảnh hởng NAA kinetin đến khả tái sinh từ mô sẹo Qua bảng hình thấy kết hợp NAA với kinetin thang nồng độ khác có ảnh hởng không giống tái sinh từ mô sẹo Cụ thể tăng nồng độ kinetin từ 0,5 mg/l lên mg/l tỷ lệ lục hoá tăng tơng ứng 53,33% (MK1) 66,67% (MK2) Khi tiếp tục tăng nồng độ kinetin lên 1,5; mg/l tỷ lệ lục hoá mô sẹo bắt đầu giảm môi trờng MK3 (1,5 mg/l kinetin) tỷ lệ lục hoá mô sẹo 40,00 %; môi trờng MK4 (2 mg/l kinetin) tỷ lệ lục hoá giảm xuống 33,33% Tỷ lệ tạo rễ môi trờng có khác tỷ lệ thấp so với môi trờng MB tơng ứng Môi trờng MK1 có tỷ lệ tạo rễ 40,00%; MK 46,67%; MK3 MK4 33,33% Vậy môi trờng MK2 có tỷ lệ tạo rễ cao Đối với tỷ lệ tạo chồi, sau 20 tuần nuôi cấy từ mô sẹo xuất chồi môi trờng MK4 với tỷ lệ 20,05% môi trờng khác mô sẹo cha phát sinh hình thái chồi Nh môi trờng tái sinh MK4 có bổ sung 0,5 mg/l NAA kết hợp với mg/l kinetin thích hợp cho tái sinh TNHC từ mô sẹo Đồng thời, phát sinh hình thái từ mô sẹo cho thấy mô sẹo TNHC có khả tạo chồi tốt Tuy nhiên, tỷ lệ tạo chồi thấp cần đợc tiếp tục nghiên cứu Hình Kết tái sinh TNHC từ mô sẹo 3.4.2 ảnh hởng tổ hợp NAA, BAP kinetin đến khả tái sinh Trinh nữ hoàng cung từ lõi củ Với mục đích tìm môi trờng có kết hợp auxin/cytokinin thích hợp cho tái sinh trực tiếp tìm nguồn nguyên liệu thích hợp cho nhân giống TNHC Vì vậy, thí nghiệm này, tiến hành nuôi cấy lõi củ TNHC môi trờng có công thức giống với thí nghiệm tái sinh từ mô sẹo để tạo chồi trực tiếp MB1, MB2, MB3, MB4, MK1, MK2, MK3, MK4 Bảng ảnh hởng tổ hợp NAA, BAP kinetin đến khả tái sinh từ lõi củ Tỷ lệ tạo chồi (%) Môi tr- NAA BAP Kinetin Số ờng (mg/l) (mg/l) (mg/l) mẫu Sau tuần Sau tuần MB1 0,5 42,85 4,43 57,14 4,54 0,5 MB2 57,14 5,13 57,14 5,13 MB3 1,5 57,14 5,74 71,42 6,03 MB4 85,70 5,33 85,70 5,33 MK1 0,5 0,5 28,57 3,09 57,14 4,18 MK2 42,85 4,96 71,42 5,08 MK3 1,5 71,42 5,08 71,42 5,08 100 0,00 MK4 85,70 4,84 Hình ảnh hởng tổ hợp NAA, BAP kinetin đến khả tái sinh từ lõi củ ảnh hởng NAA BAP đến khả tái sinh từ lõi củ TNHC Từ bảng hình ta thấy môi trờng có bổ sung 0,5 mg/l NAA 0,5 - mg/l BAP sau tuần hình thành chồi từ lõi Tuy nhiên, môi trờng MB1 cho tỷ lệ tạo chồi thấp sau tuần 42,85% , sau tuần tỷ lệ tăng lên 57,14% môi trờng MB2, tỷ lệ tạo chồi sau tuần 57,14% Tỷ lệ tạo chồi môi trờng MB3 cao đạt 57,14% sau tuần 71,42% sau tuần Môi trờng MB4 có tỷ lệ tạo chồi cao sau tuần 85,70% Nh vậy, môi trờng MB4 thích hợp để tái sinh trực tiếp từ lõi củ TNHC ảnh hởng NAA kinetin đến khả tái sinh từ lõi củ TNHC Khi bổ sung 0,5 mg/l NAA nồng độ kinetin tăng từ 0,5 đến mg/l tỷ lệ tạo chồi tăng dần sau tuần Cụ thể môi trờng MK1 tỷ lệ tạo chồi 28,57% sau tuần 57,14% sau tuần nồng độ kinetin mg/l (MK 2), sau tuần cho tỷ lệ tạo chồi 42,85%, sau tuần tăng lên 71,42% Tiếp tục tăng nồng độ kinetin lên đến 1,5 mg/l (MK 3) tỷ lệ tạo chồi đạt 71,42% sau tuần cấy Và tỷ lệ tạo chồi đạt cao môi trờng MK4 100% sau tuần Vì vậy, môi trờng MK4 thích hợp cho tái sinh từ lõi củ TNHC Kết quan sát đặc điểm chồi cho ta thấy chồi đợc tạo thành từ lõi củ có số nhiều hơn, kích thớc to hơn, màu xanh nhạt so với chồi phát sinh từ mô sẹo Lá chồi tạo từ lõi củ mềm, chồi tạo từ mô sẹo cứng Qua hai thí nghiệm trên, rút kết luận lõi củ TNHC nguyên liệu thích hợp cho tái sinh Thời gian tái sinh từ lõi ngắn từ mô sẹo Tuy nhiên để tận dụng nguồn mẫu nên kết hợp tái sinh từ lõi từ mô sẹo Hình 10 Kết tái sinh TNHC từ lõi củ 3.5 ảnh hởng kết hợp IBA, GA3 BAP đến khả nhân chồi Trinh nữ hoàng cung Chồi đợc phát sinh từ mô sẹo lõi củ TNHC đợc đa vào môi trờng nhân chồi để thu số lợng chồi lớn, có chiều cao thích hợp cho thí nghiệm tạo hoàn chỉnh sau Môi trờng nhân chồi đợc bổ sung 0,5 mg/l IBA, 0,2 mg/l GA mg/l BAP Kết theo dõi đợc trình bày bảng 6: Bảng ảnh hởng kết hợp IBA, GA3 BAP đến khả nhân chồi Môi tr- BAP ờng (mg/l) CB1 CB2 CB3 CB4 Số chồi đa vào 7 7 Chỉ tiêu theo dõi sau tuần Hệ số nhân Chiều cao chồi (lần) chồi (cm) 1,40 3,66 1,67 3,87 2,17 4,13 1,83 4,24 Chỉ tiêu theo dõi sau tuần Hệ số nhân Chiều cao chồi (lần) chồi (cm) 2,78 6,16 3,28 6,58 4,52 7,32 4,07 9,28 ảnh hởng kết hợp IBA, GA3 BAP đến hệ số nhân chồi Hình 11 ảnh hởng kết hợp IBA, GA3 BAP đến hệ số nhân chồi Từ kết bảng hình 11, thấy hệ số nhân chồi không giống môi trờng kết hợp với nồng độ BAP khác Điều thể rõ tăng nồng độ BAP từ mg/l, mg/l mg/l sau tuần, hệ số nhân chồi tăng dần 1,40; 1,67 2,17 lần Tiếp tục tăng nồng độ BAP lên mg/l hệ số nhân chồi lại giảm xuống 1,83 lần Tuy nhiên hệ số nhân chồi thấp Sau tuần, hệ số nhân chồi tăng lên đáng kể đạt 2,78; 3,28; 4,52 lần nồng độ BAP tơng ứng 3; mg/l Và mg/l BAP, hệ số nhân chồi giảm xuống 4,07 lần Hiện tợng cho thấy kết hợp IBA, GA BAP tỷ lệ thích hợp cho hệ số nhân chồi cao (0,5 mg/l IBA, 0,2 mg/l GA3 mg/l BAP), nhiên đến tỷ lệ làm giảm hệ số nhân chồi (0,5 mg/l IBA, 0,2 mg/l GA3 mg/l BAP) Từ kết thu đợc kết luận môi trờng CB3 (0,5 mg/l IBA, 0,2 mg/l GA3 mg/l BAP) thích hợp để nhân chồi TNHC ảnh hởng kết hợp IBA, GA3 BAP đến chiều cao chồi Cùng với hệ số nhân chồi, chiều cao chồi có thay đổi môi trờng khác Sự thay đổi chiều cao chồi đợc thể hình 13: Hình 12 ảnh hởng kết hợp IBA, GA3 BAP đến chiều cao chồi Khác với hệ số nhân chồi, chiều cao chồi tăng dần sau tuần tuần với tăng nồng độ BAP môi trờng nhân chồi Chứng tỏ độ tăng chiều cao chồi tỷ lệ thuận với tăng nồng độ BAP Hơn nữa, với kết hợp GA3 có tác dụng kéo dài chồi Tuy nhiên sau tuần mức độ tăng chiều cao thấp so với sau tuần Cụ thể sau tuần, chiều cao chồi 3,66; 3,87; 4,13; 4,24cm nồng độ BAP tơng ứng 3; 4; 5; mg/l Cũng nồng độ nhng sau tuần chiều cao chồi tăng tơng ứng 6,16; 6,58; 7,32; 9,28cm Lá chồi màu xanh thẫm, cứng, nhìn rõ đờng gân song song Đặc biệt môi trờng nhân chồi, không thấy có tạo rễ nh môi trờng tạo mô sẹo tái sinh Mỗi chồi thờng có từ - trở lên Các chồi có chiều cao sau tuần nh thích hợp cho thí nghiệm tạo hoàn chỉnh sau Hiện tợng kết hợp BAP nồng độ cao IBA nồng độ thấp có tác dụng kích thích rõ rệt đến hình thành chồi, đồng thời ức chế mạnh tạo rễ chồi nuôi cấy Mặt khác với BAP IBA kết hợp GA3 môi trờng kích thích kéo dài tế bào, qua làm tăng kích thớc chồi nuôi cấy a b Hình 13 Kết nhân chồi môi trờng CB3 a) Sau tuần b) Sau tuần 3.6 ảnh hởng IBA đến khả tạo hoàn chỉnh Khi đạt đến kích thớc định chồi tái sinh đợc chuyển sang môi trờng tạo rễ có bổ sung auxin để tạo TNHC hoàn chỉnh Trong thí nghiệm này, sử dụng môi trờng MS có thành phân dinh dỡng giảm hai lần (MS/2), g/l agar IBA nồng độ 0,5 - mg/l Sau tuần nuôi cấy, thu đợc kết đợc trình bày bảng 7: Bảng ảnh hởng IBA đến khả tạo hoàn chỉnh Môi trờng IBA (mg/l) Số rễ/chồi (cái) Chiều dài rễ (cm) IR1 0,5 1,50 0,15 1,00 0,06 IR2 2,33 0,35 1,07 0,11 IR3 1,5 4,50 0,52 1,39 0,05 Hình 14 ảnh hởng IBA đến khả tạo hoàn chỉnh Qua bảng hình 14 thấy thang nồng độ IBA khác có ảnh hởng khác đến số lợng rễ tạo thành chiều dài rễ Khi tăng nồng độ IBA từ 0,5 đến 1,5 mg/l số rễ/chồi tăng chiều dài rễ tăng tơng ứng Đối với môi trờng IR1 có nồng độ IBA 0,5 mg/l có số rễ/chồi 1,50 với chiều dài 1,00 cm Tiếp tục tăng nồng độ IBA lên mg/l (môi trờng IR2) số rễ/chồi tăng lên 2,33 cái, gấp 1,55 lần so với môi trờng IR1 chiều dài rễ tăng lên không đáng kể đạt 1,07 cm Khi nồng độ IBA 1,5 mg/l (môi trờng IR3), số rễ/chồi tăng rõ rệt lên tới 4,50 cái, đồng thời chiều dài rễ tăng lên 1,39 cm Từ đánh giá cho thấy nồng độ IBA thích hợp cho việc tạo hoàn chỉnh 1,5 mg/l điều kiện môi trờng đảm bảo số rễ/chồi cao chiều dài rễ lớn nồng độ IBA thấp Hình 15 Kết tạo hoàn chỉnh môi trờng IR3 KếT LUậN Và KIếN NGHị Kết luận Hiệu khử trùng chế độ khử trùng cồn 70% 30 giây javen phút với mẫu củ TNHC cho tỷ lệ sống cao lên tới 87% (chế độ 2) Môi trờng TN3 (MS + mg/l NAA) TD (MS + mg/l NAA) thích hợp cho việc tạo mô sẹo từ củ TNHC Tỷ lệ tạo mô sẹo sau - tuần t ơng ứng đạt 91,9% 93,15% Ngoài môi trờng TN4 (MS + 2,5 mg/l NAA) TD4 (MS + 2,5 mg/l 2,4-D) cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao tơng ứng 90,50% 89,35% Môi trờng NB6 (bổ sung 1,5 mg/l NAA mg/l BAP) NK ( bổ sung 1,5 mg/l NAA mg/l Kinetin) phù hợp cho việc nhân sinh khối mô sẹo Môi trờng MB4 (bổ sung 0,5 mg/l NAA mg/l BAP) MK (0,5 mg/l NAA mg/l kinetin) phù hợp cho việc tái sinh TNHC từ mô sẹo lõi củ Tỷ lệ tạo chồi tơng ứng với môi trờng MB4 MK4 từ mô sẹo 7,69% 20,05%; từ lõi 85,70% 100% Môi trờng nhân chồi thích hợp CB (MS + 0,5 mg/l IBA + 0,2 mg/l GA mg/l BAP), cho hệ số nhân chồi 4,52 lần sau tuần cấy Môi trờng IR3 (MS/2 + 1,5 mg/l IBA) thích hợp cho tạo TNHC in vitro hoàn chỉnh Kiến nghị Trên kết mà thu đợc nghiên cứu số điều kiện nuôi cấy TNHC Do điều kiện thời gian hạn hẹp nên ch a có đầy đủ kết ảnh hởng chất KTST đến tạo chồi mô nuôi cấy Tuy nhiên nhu cầu chữa bệnh ung th nhu cầu hàng đầu mà giới quan tâm mong có nghiên cứu để xây dựng quy trình hoàn thiện nhân giống TNHC để góp phần vào việc tạo viên thuốc quý phục vụ sức khoẻ cộng đồng TàI LIệU THAM KHảO Tài liệu tiếng việt Hoàng Thị Bé, Atlas Khuẩn Lam - Nấm - Thực Vật, NXB Đại học S phạm, tr 132, 2004 Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội, Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 1997 Đỗ Duy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chơng, Nguyễn Thợng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn, Cây Thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, tập 2, tr 1018 - 1020, 2003 Võ Văn Chi, Sách tra cứu tên cỏ Việt Nam, NXB Giáo dục, trang 42 186, 2007 Lê Trần Đức, Cây thuốc Việt Nam, NXB Nông nghiệp, 1997 Nguyễn Công Hào, Nguyễn Cửu Hơng Giang, Nguyễn Cửu Khoa, Nghiên cứu thành phần hoá học Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.), Tuyển tập công trình nghiên cứu khoa học (1993 - 1998), Viện sinh học Nhiệt đới, NXB Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh, 1998 Vũ Thị Lan, Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy để thu nhận sinh khối định tính số chất có hoạt tính sinh học từ Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.), Luận văn Thạc sĩ Khoa học - Đại học Quốc Gia Hà Nội, 2005 Quách Thị Liên, Vũ Thị Lan, Lê Thị Vân Anh, Nguyễn Đức Thành, Nuôi cấy mô sẹo Trinh nữ hoàng cung (crinum latifolium L.), Tạp chí sinh học, tập (3), tr 353, 2005 Đỗ Tất Lợi, Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, trang 24 512, 2005 10 Nguyễn Văn Nghi, Chuyên đề sinh lý công nghệ tế bào thực vật, ĐHQG Hà Nội - Đại học Khoa học Tự nhiên, 1998 11 Nguyễn Đức Thành, Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu ứng dụng, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 2000 12 Lê Văn Trí, Giáo trình thực vật rừng, Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh, 1993 13 Nguyễn Văn Uyển tác giả, Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống trồng, NXB Nông nghiệp, 1993 14 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tâm, Sinh lý học thực vật, NXB Giáo dục Hà Nội, 2007 15 Vũ Văn Vụ - Nguyễn Mộng Hùng - Lê Hồng Điệp, Công nghệ sinh học, NXB Giáo dục, tập II, 2006 16 Vũ Văn Vụ, Sinh lý thực vật ứng dụng, NXB Giáo dục Hà Nội, 1999 17 Đỗ Năng Vịnh, Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, NXB Nông nghiệp Hà Nội, trang 79- 80, 2005 Tài liệu tiếng anh 18 Collin H.A., Plant Cell Culture, Bios scientific publishers, 1998 19 Drew R.A., Vogler J.N, Magdalita V.M, Manhon R.E and Presley D.M, Application of Biotechnology to carica papaya L and related species, Current tissue in plant Molecular and cellular biology, PP 321 -326, 1995 20 Narayanaswamy S., Plant Cell and Tissue Culture, Tataca Mc Graw Hill Publishing company limited, New Delhi, 1994 21 Smith R.H., Plant Tissue Culture, Departmen of soil and crop science, 1992 Một số trang web: 22.http://www.nguoiduongthoi.com.vn/Destop.aspx/NhanVatNDT/Nhan_vat/Ti en_si_Nguyen_Thi_Ngoc_Tram-It_hon_la-nhieu_hon/ 23.http://vietbao.vn/suc-khoe/crila-duoc-chi-dinh-dieu-tri-u-xo-tucung/45264057/248/ 24.http:// www.ungthu.org/vacf/cacbenhungthu/ut-prostate/ 25.http://vietnamnet.vn/khoahoc/suckhoe/2005/09/491993/ 26 http://en.wikipedia.org/wiki/Crinum_latifolium Phụ lục Thành phần môi trờng MS (Murashige Skoog, 1962) Thành phần Nguyên tố đa lợng Nguyên tố vi lợng Vitamin Hoá chất Hàm lợng (mg/l) CaCl2 332,02 KH2PO4 170,00 KNO3 1900,00 MgSO4 180,54 NH4NO3 1650,00 CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 FeNaEDTA 36,70 H3BO3 6,20 KI 0,83 MnSO4.2H2O 16,90 Na2MO4.2H2O 0,25 ZnSO4.7H2O 8,60 Glycine 2,00 Myo- inositol 100,00 Axit Nicotinic 0,50 Pyridoxine HCl 0,50 Thiamine HCl 0,10 Quy trình nhân giống in vitro TNHC rút từ trình nghiên cứu: Khử trùng cồn 70% 30 giây javen phút Tạo mô sẹo môi trờng MS + 30 g/l đờng + g/l agar + 2,5 mg/l NAA (2,4-D) Tạo chồi trực tiếp môi trờng MS + g/l agar + 30 g/l đờng + 100 mg/l nớc dừa + 0,5 mg/l NAA + mg/l BAP (kinetin) Nhân sinh khối mô sẹo môi trờng MS + 8g/l agar + 30g/l đờng + 1,5 mg/l NAA + 1mg/l BAP (kinetin) Tái sinh môi trờng MS + g/l agar + 30 g/l đờng + 100 mg/l nớc dừa + 0,5 mg/l NAA + mg/l BAP (kinetin) Nhân chồi môi trờng MS + 0,5 mg/l IBA + 0,2 mg/l GA3 + mg/l BAP Tạo hoàn chỉnh môi trờng MS/2 + 1,5 mg/l IBA [...]... sinh cây để nghiên cứu sự phát sinh hình thái từ mô sẹo a b Hình 6: Nhân sinh khối mô sẹo cây TNHC a) Nhân sinh khối trên công thức NB6 b) Nhân sinh khối trên công thức NK6 3.4 ảnh hởng của tổ hợp NAA, BAP và kinetin đến khả năng tái sinh cây Trinh nữ hoàng cung 3.4.1 ảnh hởng của tổ hợp NAA, BAP và kinetin đến khả năng tái sinh cây Trinh nữ hoàng cung từ mô sẹo Sau khi nhân sinh khối, mô sẹo đợc đa vào... 2,4-D vào môi trờng đều cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao [8] 3.3 ảnh hởng của tổ hợp NAA, BAP và kinetin đến khả năng nhân sinh khối mô sẹo Có nhiều phơng pháp để tái sinh cây, tuy nhiên với phơng pháp tái sinh cây từ mô sẹo, việc tạo đợc khối mô sẹo đủ to đáp ứng đợc việc tạo chồi là rất quan trọng Môi trờng nuôi cấy mô sẹo gồm hai loại: môi trờng cảm ứng tạo mô sẹo và môi trờng nuôi cấy sinh khối mô sẹo Về... (Tổng số mẫu nhiễm/Tổng số mẫu cấy) x 100 Tỷ lệ mẫu chết (%) = (Tổng số mẫu chết/Tổng số mẫu cấy) x 100 Tỷ lệ mẫu sống (%) = (Tổng số mẫu sống/Tổng số mẫu cấy) x 100 Đánh giá kết quả tạo mô sẹo Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) = (Tổng số mẫu tạo mô sẹo/ Tổng số mẫu) x 100 Đánh giá kết quả nhân sinh khối mô sẹo Tỷ lệ mô sẹo ra rễ (%)= (Số mô sẹo ra rễ/Tổng mô sẹo đa vào) x 100 Tỷ lệ mô sẹo hoá nâu (%)= (Số mô sẹo. .. nâu/Tổng mô sẹo đa vào) x 100 Đánh giá kết quả tái sinh cây từ mô sẹo Tỷ lệ tạo chồi (%) = (Số mô sẹo tạo chồi/Tổng mô sẹo đa vào) x 100 Tỷ lệ tạo rễ (%) = (Số mô sẹo tạo rễ/Tổng mô sẹo đa vào) x 100 Tỷ lệ lục hoá (%) = (Số mô sẹo lục hoá/Tổng mô sẹo đa vào) x 100 Đánh giá kết quả tạo chồi từ lõi củ Tỷ lệ tạo chồi (%) = (Số lõi củ tạo chồi/Tổng số lõi củ đa vào) x 100 Đánh giá kết quả nhân chồi Hệ số. .. gồm sáu kỹ thu t sau : Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời: Phơng pháp này để nghiên cứu điều kiện sinh trởng đối với một bộ phận hoặc một mô của cây in vitro, tạo thành mô sẹo phục vụ cho các nghiên cứu cơ bản nh chọn dòng tế bào; đột biến xoma và ứng dụng phân hoá tế bào, cơ quan Nuôi cấy mô phân sinh: Đợc dùng trong các trờng hợp tạo những giống cây sạch bệnh và nhân giống in vitro; tạo cây đa bội... nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hởng của tổ hợp NAA, BAP và kinetin đến khả năng nhân sinh khối mô sẹo Sau khi mô sẹo hình thành, để thu đợc sinh khối mô đủ to đáp ứng đợc cho việc tái sinh cây thì cần phải bố trí thí nghiệm nhân sinh khối mô sẹo ở thí nghiệm này, mô sẹo đợc cấy lên môi trờng nền cơ bản MS có bổ sung các chất kích thích sinh trởng, NAA, BAP hoặc kinetin với những tỷ lệ khác nhau và 30 g/l... đầu cho các nghiên cứu quan trọng Vì vậy, nuôi cấy mô sẹo là khâu đặc biệt quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Nguyên liệu tạo mô sẹo là các phần non của cây đợc nuôi cấy trên môi trờng giàu auxin Khi sự cân bằng các chất kích thích sinh trởng trong thực vật thay đổi mà cụ thể các mô nếu đợc nuôi cấy trên môi trờng giàu auxin thì mô sẹo đợc hình thành Trong quá trình nuôi cấy tạo mô sẹo, mẫu... thành mô sẹo Đối với mẫu củ cây TNHC thì ở ngỡng nồng độ 2,5 mg/l NAA và 2,4-D trở lên đã bắt đầu gây ức chế sự hình thành mô sẹo a b Hình 5 Kết qủa tạo mô sẹo trên môi trờng TN3 và TD3 a) Mới tạo mô sẹo b) Mô sẹo Nh vậy có thể kết luận, môi trờng TN3 (2 mg/l NAA) và TD3 (2 mg/l 2,4-D) là thích hợp cho việc tạo mô sẹo từ củ cây TNHC, tỷ lệ tạo mô sẹo cao t ơng ứng là 91,90% và 93,15%; khối mô to;... còn ở các môi trờng khác mô sẹo vẫn cha phát sinh hình thái chồi Nh vậy môi trờng tái sinh MK4 có bổ sung 0,5 mg/l NAA kết hợp với 2 mg/l kinetin là thích hợp cho sự tái sinh cây TNHC từ mô sẹo Đồng thời, sự phát sinh hình thái từ mô sẹo cho thấy mô sẹo TNHC có khả năng tạo chồi tốt Tuy nhiên, tỷ lệ tạo chồi này còn thấp và cần đợc tiếp tục nghiên cứu Hình 8 Kết quả tái sinh cây TNHC từ mô sẹo 3.4.2... khối mô sẹo Về cơ bản các môi trờng này gồm muối khoáng, các chất hữu cơ và các chất KTST thu c nhóm auxin và cytokinin Từ các khối mô sẹo đợc đa vào môi trờng nhân sinh khối để thu đợc lợng lớn mô sẹo phục vụ cho việc tái sinh cây Trong nuôi cấy in vitro thì sự kết hợp giữa auxin với cytokinin ở các tỷ lệ khác nhau sẽ có tác dụng không giống nhau đối với sự nhân sinh khối mô sẹo Do đó, ở thí nghiệm ... en_si_Nguyen_Thi_Ngoc_Tram-It_hon_la-nhieu_hon/ 23.http://vietbao.vn/suc-khoe/crila-duoc-chi-dinh-dieu-tri-u-xo-tucung/45264057/248/ 24.http:// www.ungthu.org/vacf/cacbenhungthu/ut-prostate/ 25.http://vietnamnet.vn/khoahoc/suckhoe/2005/09/491993/... pyrolophennanthridin 2-epilycorin 2epipancrassidin [9] Một số nhà khoa học Nhật Bản tìm thấy số chất alkaloid khác từ TNHC nh beladin, pratorin (hippadin), latidin, 11-o- acetylambelin , 11-o-acetyl 1,2-epoxyambelin,... mg/l 2,4-D TN2= MS + 1.5 mg/l NAA TD2= MS + 1.5 mg/l 2,4-D TN3= MS + mg/l NAA TD3= MS + mg/l 2,4-D TN4= MS + 2.5 mg/l NAA TD4= MS + 2.5 mg/l 2,4-D TN5= MS + mg/l NAA TD5= MS + mg/l 2,4-D Thí