BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HOÀNG XUÂN HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÂY NHỤC TỬ GẦN (Sarcosperma affinis Gagnep - Sapotaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HOÀNG XUÂN HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÂY NHỤC TỬ GẦN (Sarcosperma affinis Gagnep - Sapotaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH : DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ : 60720406 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Hoài HÀ NỘI 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn em xin chân thành cảm ơn: Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau Đại học, thầy cô chuyên ngành Dƣợc học cổ truyền Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội truyền đạt cho em nhiều kiến thức bổ ích trình học tập tạo điều kiện cho em đƣợc làm luận văn tốt nghiệp Ban Chủ nhiệm Khoa, thầy cô cán Khoa Dƣợc giúp đỡ, ủng hộ tạo điều kiện sở vật chất, trang thiết bị để em tiến hành thử nghiệm trình làm luận văn Em xin chân thành cảm ơn cán bộ, kỹ thuật viên khoa Vi sinh – Bệnh viện TW Huế nhiệt tình giúp đỡ, hƣớng dẫn em trình thực đề tài Ths Hồ Việt Đức tận tình giúp đỡ giải cấu trúc hoá học hợp chất phân lập đƣợc Xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bên cạnh động viên tinh thần hỗ trợ vật chất để luận văn đƣợc hoàn thành cách tốt Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thị Hoài, giảng viên môn Dƣợc liệu – Khoa Dƣợc, ngƣời tận tình hỗ trợ, hƣớng dẫn truyền đạt cho em nhiều kiến thức bổ ích suốt trình thực đề tài Học viên Hoàng Xuân Huyền Trang MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ 1.1.1 Đặc điểm chung họ Hồng xiêm (Sapotaceae) 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố chi Sarcosperma Hook.f 1.1.3 Đặc điểm thực vật phân bố loài Sarcosperma affinis Gagnep 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.3 HOẠT TÍNH SINH HỌC 13 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 16 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 16 2.1.2 Các chủng vi sinh vật thử nghiệm 16 2.1.3 Thuốc thử, dung môi, hóa chất 17 2.1.4 Máy móc - thiết bị 17 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.2.1 Nghiên cứu thực vật 18 2.2.2 Nghiên cứu hóa học 19 2.2.3 Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn 21 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24 3.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 24 3.1.1 Đặc điểm hình thái 24 3.1.2 Đặc điểm vi học 25 3.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 32 3.2.1 Định tính nhóm hợp chất hữu có 32 3.2.2 Quá trình chiết xuất 33 3.2.3 Quá trình phân lập 35 3.3 Nhận dạng chất phân lập đƣợc 39 3.3.1 Hợp chất SAC8 39 3.3.2 Hợp chất SAC9 41 3.3.3 Hợp chất SAC18 44 3.3.4 Hợp chất SAC22 47 3.4 HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN 49 3.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết toàn phần phân đoạn49 3.4.2 Hoạt tính kháng khuẩn hợp chất tinh khiết phân lập từ Nhục tử gần 51 Chƣơng BÀN LUẬN 55 4.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 55 4.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 56 4.3 HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT KÝ HIỆU 13 C-NMR TIẾNG ANH TIẾNG VIỆT Carbon nuclear magnetic resonance Phổ cộng hƣởng từ carbon 13 H-NMR Proton nuclear magnetic resonance Phổ cộng hƣởng từ proton A549 Human C H adenocarcinoma Tế bào ung thƣ biểu mô phế lung epithelial cell nang ngƣời AMPK AMP-activated protein kinase Enzym hoạt hóa AMP DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleid ED50 Median effective dose 50 Liều có tác dụng lên 50% nhóm thử nghiệm FtsZ HL-60 Filamentous temperature sensitive Protein sợi Z nhạy cảm với protein Z nhiệt độ Promyelocytic cell Tế bào bạch cầu tiền tủy bào HMBC Heteronuclear bond Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân multiple correlation chiều HMBC HONE-1 Ppithelial tumor cell Tế bào khối u biểu mô HR-EI-MS High-resolution electron Phổ khối phân giải cao ionizationmass spectrometry HSQC Heteronuclear single chiều HSQC coherence IC50 Half quantum Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân maximal concentration inhibitory Nồng độ ức chế 50% nhóm thử nghiệm IL Interleukin Interleukin KB Oral cancer cell Tế bào ung thƣ vòm họng LPS Lipopolysaccharide Lipopolysaccharide MCF7 Human breast adenocarcinoma cell Tế bào ung thƣ vú ngƣời line MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu NMR Nuclear magnetic resonance Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân SK-MEL-3 Human melanoma cell Tế bào melanoma ngƣời SK-OV-3 Ovarian carcinoma cells Tế bào ung thƣ biểu mô buồng trứng TNF Tumor necrosis factors Yếu tố hoại tử khối u DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Một số triterpen phổ biến họ Sapotaceae Bảng 1.2 Một số flavonoid đƣợc phân lập từ họ Sapotaceae 12 Bảng 1.3 Một số loài có hoạt tính kháng khuẩn thuộc họ Sapotaceae 14 Bảng 3.1 Kết định tính nhóm chất hữu phần mặt đất Nhục tử gần 32 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ SAC8 hợp chất tham khảo 40 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ SAC9 hợp chất tham khảo 43 Bảng 3.4 Dữ liệu phổ SAC18 hợp chất tham khảo 46 Bảng 3.5 Dữ liệu phổ SAC22 hợp chất tham khảo 48 Bảng 3.6 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết toàn phần phân đoạn Staphylococcus aureus 49 Bảng 3.7 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết toàn phần phân đoạn Escherichia coli 50 Bảng 3.8 Hoạt tính kháng khuẩn cao chiết toàn phần phân đoạn Pseudomonas aeruginosa 50 Bảng 3.9 Hoạt tính kháng khuẩn hợp chất tinh khiết chủng Staphylococcus aureus 52 Bảng 3.10 Hoạt tính kháng khuẩn hợp chất tinh khiết chủng Bacillus subtilis 52 Bảng 3.11 Hoạt tính kháng khuẩn hợp chất tinh khiết chủng Escherichia coli 53 Bảng 3.12 Hoạt tính kháng khuẩn hợp chất tinh khiết chủng Pseudomonas aeruginosa 53 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cấu trúc số triterpen thƣờng gặp họ Sapotaceae 11 Hình 1.2 Cấu trúc số flavonoid thƣờng gặp họ Sapotaceae 13 Hình 2.1 Ảnh Nhục tử gần (Sarcosperma affinis Gagnep - Sapotaceae) 16 Hình 2.2 Phân bố mẫu thử đĩa thạch dinh dƣỡng 23 Hình 3.1 Ảnh Nhục tử gần 24 Hình 3.2 Ảnh số đặc điểm hình thái Nhục tử gần 25 Hình 3.3 Vi phẫu cành Nhục tử gần (quan sát vật kính 10) 26 Hình 3.4 Vi phẫu cành Nhục tử gần (quan sát vật kính 40) 27 Hình 3.5 Các đặc điểm bột cành Nhục tử gần 28 Hình 3.6 Các đặc điểm bột Nhục tử gần 29 Hình 3.7 Vi phẫu gân Nhục tử gần (quan sát vật kính 10) 30 Hình 3.8 Vi phẫu phiến Nhục tử gần (quan sát vật kính 40) 30 Hình 3.9 Vi phẫu gân Nhục tử gần (quan sát vật kính 40) 31 Hình 3.10 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn từ Nhục tử gần 37 Hình 3.11 Sơ đồ phân lập SAC8 SAC22 từ phân đoạn chloroform 38 Hình 3.12 Sơ đồ phân lập SAC9 SAC18 từ phân đoạn chloroform 38 Hình 3.13 Cấu trúc hóa học SAC8 39 Hình 3.14 Tƣơng tác 1H - 13C HMBC hợp chất SAC9 42 Hình 3.15 Cấu trúc hóa học SAC9 42 Hình 3.16 Tƣơng tác 1H - 13C HMBC hợp chất SAC18 45 Hình 3.17 Cấu trúc hóa học SAC18 45 Hình 3.18 Cấu trúc hóa học SAC22 49 Hình 4.1 Cấu trúc hóa học SAC8 SAC18 61 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm khuẩn nguyên nhân hàng đầu gây tử vong Việt Nam nhƣ giới Theo số liệu thống kê, năm giới có hàng triệu ngƣời chết mắc bệnh liên quan đến nhiễm khuẩn Sự đời thuốc kháng sinh bƣớc ngoặt quan trọng ngành y tế giúp kiểm soát làm giảm tỷ lệ tử vong bệnh nhiễm khuẩn Tuy nhiên, vấn đề nan giải kháng sinh tƣợng kháng thuốc việc lạm dụng kháng sinh điều trị Điều đặt nhà khoa học trƣớc thách thức phải nhanh chóng tìm kháng sinh có hiệu điều trị tốt Trên thực tế, phần lớn kháng sinh đƣợc sử dụng có nguồn gốc tự nhiên Hệ sinh thái tự nhiên cung cấp nguồn hợp chất với hoạt tính sinh học phong phú với số lƣợng hợp chất tự nhiên chƣa đƣợc khám phá theo ƣớc tính triệu hợp chất [11] Vì vậy, nghiên cứu phát triển kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên hƣớng đầy hứa hẹn Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú đa dạng Theo thống kê sơ bộ, nƣớc ta biết khoảng 10.350 loài thực vật bậc cao, khoảng 800 loài rêu, 600 loài nấm 2.000 loài tảo [9] Trong đó, Thừa Thiên Huế thuộc khu vực thực vật nhiệt đới vùng đệm có giao lƣu hệ thực vật phía Bắc hệ thực vật phía Nam, đa dạng thành phần, chủng loại hệ sinh thái Nhục tử gần (Sarcosperma affinis Gagnep - Sapotaceae) loài đặc hữu Việt Nam đƣợc tìm thấy Vƣờn Quốc gia Bạch Mã, Thừa Thiên Huế [7] Kết sàng lọc ban đầu nhóm nghiên cứu cho thấy loài có hoạt tính kháng khuẩn mạnh, nhiên chƣa có công bố thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài Việt Nam nhƣ giới Nhằm phục vụ cho công tác bảo tồn, chuẩn hóa nguyên liệu PHỔ 13C-NMR CỦA HỢP CHẤT SAC18 PHỔ HMBC CỦA HỢP CHẤT SAC18 PHỔ HSQC CỦA HỢP CHẤT SAC18 PHỔ LR-MS CỦA HỢP CHẤT SAC18 KẾT QUẢ ĐO PHỔ HR-MS CỦA SAC18 PHỔ 1H-NMR CỦA HỢP CHẤT SAC22 PHỔ 13C-NMR CỦA HỢP CHẤT SAC22 PHỔ HSQC CỦA HỢP CHẤT SAC22 PHỔ LR-MS CỦA HỢP CHẤT SAC22 KẾT QUẢ ĐO PHỔ HR-MS CỦA SAC22 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH CỦA SAC8 (I) VÀ SAC9 (II) Staphylococcus aureus Escherichia coli Bacillus subtilis Pseudomonas aeruginosa KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH CỦA SAC18 (III) VÀ SAC22 (IV) Staphylococcus aureus Escherichia coli Bacillus subtilis Pseudomonas aeruginosa kẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH CỦA GENTAMICIN mg/mL VÀ DMSO Staphylococcus aureus Escherichia coli Bacillus subtilis Pseudomonas aeruginosa [...]... phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn của cây Nhục từ gần, đề tài Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng khuẩn của cây Nhục tử gần (Sarcosperma affinis Gagnep - Sapotaceae) đƣợc tiến hành với các mục tiêu: 1 Mô tả đặc điểm thực vật và giám định tên khoa học của cây 2 Chiết xuất, phân lập 4-5 chất tinh khiết trong cây và xác định cấu trúc hóa học các chất đã phân lập được 3 Đánh giá hoạt tính. .. lắp ráp của protein FtsZ lên đến 88,36 ± 6,5% Đây là một bằng chứng cho thấy Nhục tử gần có có thể chứa một số hoạt chất có tác dụng kháng khuẩn mạnh Vì vậy, việc nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài này sẽ góp phần vào việc tìm kiếm, bổ sung các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn, đồng thời làm cơ sở cho việc bảo tồn và phát triển cây thuốc, đó là lý do mà cây Nhục tử gần đƣợc... đối tƣợng nghiên cứu trong đề tài 15 Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Mẫu nghiên cứu Mẫu cây Nhục tử gần (Sarcosperma affinis Gagnep - Sapotaceae) đƣợc thu hái vào tháng 6/2014 tại Vƣờn Quốc gia Bạch Mã – Thừa Thiên Huế Mẫu nghiên cứu Nhục tử gần gồm: - Mẫu cây thu hái mang bộ phận sinh sản để làm giám định tên khoa học và làm tiêu bản khô - Mẫu cây tƣơi bao... gồm cành và lá, bột khô cành, lá để nghiên cứu đặc điểm vi học - Cành và lá rửa sạch, thái nhỏ, sấy ở 50 C, sau đó xay thành bột thô và bảo quản ở nơi khô thoáng để nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học Hình 2.1 Ảnh cây Nhục tử gần (Sarcosperma affinis Gagnep - Sapotaceae) 2.1.2 Các chủng vi sinh vật thử nghiệm Các chủng vi khuẩn kiểm định đƣợc dùng trong thí nghiệm gồm: - Vi khuẩn Gram... loài Nhục tử Cachin (Sarcosperma kachinense Exell.) đƣợc nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn Theo báo cáo của Yang và cộng sự (2012), dịch chiết ethanol của loài Nhục 14 tử Cachin thể hiện tác dụng kháng khuẩn mạnh đối với Staphylococcus aureus kháng methiciline [16] Sarcosperma affinis Gagnep là một loài đặc hữu của Việt Nam Cho đến nay vẫn chƣa có công bố nào về hoạt tính sinh học của loài này Nhóm nghiên. .. 1.3 HOẠT TÍNH SINH HỌC Các loài trong họ Sapotaceae có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị nhƣ hạ đƣờng huyết, chống ung thƣ, tăng cƣờng miễn dịch, giảm đau, hạ sốt Đặc biệt trong những năm gần đây, hoạt tính kháng khuẩn của các loài trong họ Sapotaceae rất đƣợc chú ý Nhiều nghiên cứu sàng lọc đã đƣợc tiến hành và kết quả cho thấy rất nhiều loài trong họ này có hoạt tính kháng khuẩn mạnh [40] Các nghiên. .. của loài này Nhóm nghiên cứu đã tiến hành sàng lọc hoạt tính của dịch chiết loài này tại Viện Nghiên cứu Thuốc Tự nhiên, Trƣờng Đại học Toyama - Nhật Bản Tại đây đang tập trung nghiên cứu, tìm kiếm các loại kháng sinh có nguồn gốc thực vật có đích tác dụng là FtsZ FtsZ là một protein cần thiết cho sự tồn tại và phân chia của tế bào vi khuẩn Nó có mặt ở hầu hết các loài vi khuẩn nhƣng không có ở tế... tên khoa học, mẫu cây đƣợc thu hái với đầy đủ các bộ phận cành, lá, hoa, quả Dựa vào các đặc điểm quan sát, phân tích về đặc điểm hình thái kết hợp với đối chiếu tài liệu tham khảo và đƣợc sự giúp đỡ của TS Nguyễn Thế Cƣờng – Phòng Thực vật – Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, mẫu nghiên cứu đƣợc xác định: Tên khoa học : Sarcosperma affinis Gagnep - Sapotaceae Tên tiếng Việt: Nhục tử gần, Sến nạc... nhân thực Do đó, các kháng sinh có đích tác dụng là FtsZ sẽ có tác dụng chọn lọc, ít độc tính và an toàn hơn với cơ thể ngƣời Cụ thể, các kháng sinh sẽ liên kết với FtsZ làm tăng hoạt động của GTPase, ức chế sự lắp ráp FtsZ dẫn đến ức chế sự phân chia tế bào vi khuẩn [17] Kết quả nghiên cứu từ 207 dịch chiết dƣợc liệu đƣợc thu mẫu tại miền Trung Việt Nam cho thấy dịch chiết Nhục tử gần có tác dụng tốt... hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR) và hai chiều (HSQC, HMBC) đƣợc đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer với chất nội chuẩn là tetramethyl silane (TMS), dung môi đo phổ pyridine-d5 Quá trình đo phổ thực hiện tại Viện Nghiên cứu Thuốc Tự nhiên, Trƣờng Đại học Toyama - Nhật Bản 2.2.3 Nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn 2.2.3.1 Nguyên tắc Mẫu thử đƣợc cho vào lỗ đục trên đĩa thạch dinh dƣỡng đã ... làm sáng tỏ thành phần hóa học hoạt tính kháng khuẩn Nhục từ gần, đề tài Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính kháng khuẩn Nhục tử gần (Sarcosperma affinis Gagnep - Sapotaceae) đƣợc tiến hành... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HOÀNG XUÂN HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÂY NHỤC TỬ GẦN (Sarcosperma affinis Gagnep - Sapotaceae). .. thấy Nhục tử gần có chứa số hoạt chất có tác dụng kháng khuẩn mạnh Vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài góp phần vào việc tìm kiếm, bổ sung hợp chất có hoạt tính kháng