Bộ Y TẾ LỜ3 CẢĨE ơĩl TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI Đe hoàn thành khóa luân tắt nghỉêp, trước hết em xỉn bày tỏ ỉòng bỉểt ơn sâu sắc tới Ts Trần Việt Hùngy Ths, Hoàng Tuyết Nhung, NCS Vũ Thì Nguyệt Minh, người tân tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian qua Em xin gửi ỉời cảm ơn tới Ban Giám Đổc Viện Kiểm Nghiệm Thuốc PHẠM VĂN HOÀNG Trung Ương toàn thể cản Khoa Vặt Lý Đo Lường- Viện Kỉểm Nghiêm Thuốc Trung Ương đõ tuôn giủp đỡ tạo điều kỉện cho em trình thực luận văn NGHIÊN CỨU CHIÉT XUẢT, PHÂN Ent xin chân thành gửi tờỉ cảm ơn tới Ban giảm hiêu, thầy CÔ trường Đai học Dược Hà Nộiy thầy cô cán Bộ môn Vò LẬP, TINH CHẾ LINARIN TỪ CÂY tận tình gỉắng dạy giúp đỡ em trình học tập nghiên cứu Cuối em vô biết ơn gia đình bạn bè, người động viên, khích tệ giúp đỡ em mặt đế em có kết ngày hôm Hà Nội, ngày 10 thảng 05 năm 2010 Sinh viên Phạm Vãn Hoàng Ngưòi huóng dẫn: AI i Ao \' HÀ NỘI-2010 _ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC BẢNG 3 DANH MỤC CÁC HÌNH 4 ĩ 5 MỤC LỤC ố 6 ĐẠT VẤN ĐÈ 9 10 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 11 CHƯƠNG 2: ĐỚI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.2 Phương tiện nghiên cứu 13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 13 CHƯƠNG 3: KÉT QUẢ NGHIÊN cứu 15 3.1 .Địn h tính nhóm chất ílavonoid linarin 15 3.1.1 Định tính iìavonoid Cúc hoa vàng 15 3.1.2 Định tính linarin phương pháp sắc ký lóp mỏng (TLC) 16 3.2 .Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất 18 3.2.1 Chi ết xuất ílavonoiđ toàn phàn 18 3.2.1.1 Phương pháp chiết lạnh , 18 3.2.1.2 Phương pháp chiết nóng 19 31 33.2.2.2 Mô tả quy trình phân lập 31 3.3.3 Đánh giá độ ổn định quy trình 34 3.4 Nghiên cứu xây dựng quy trình tinh ché ỉinarin .37 3.4.1 Kh ảo sát xây dựng quy trình tinh chế linarin 37 3.4.2 .Ọuy trình tinh chế linarin 40 3.4.3 Sơ đô quy trinh tinh chê linarin 40 BÀN LUẬN .42 Bảng 3.1: pcết định tính tlavonoid dược liệu .15 Bảng 3.2: Kểt chiết xuất llavonoid toàn phần theo phương pháp chiết lạnh 18 Bảng 3.3: Kết chiết xuất ílavonoid toàn phần theo phương pháp chiết nóng 20 Bảng 3.4: Kiết định lượng linarin tlavonoid toàn phần 22 Bảng 3.5: Ket khảo sát độ lặp lại quy trình chiết xuất .23 Bảng 3.6: Ket định lượng linarin cẩn linarin thô sau quy trình phản lập 34 DANH MỰC CÁC HÌNH Hình 1: Cúc hoa vàng Hình 3.1: sác kỷ đồ vết linarin chuẩn mẫu thừ2 17 Hình 3,2: sắc ky đồ hệ: C!oroform-methanoỉ-nước (5:1:0^1 > , ,27 Hỉnh 3: sác ký đồ vết linarin chuẩn vết linarin thô sau chạy sắc ký cột hấp phụ .30 Hình 3.4: sác ký đồ hệ 33 Việt Nam lả nước có y học dản tộc phát triển từ lâu dời, có truyền thống sử dụng thuốc nguồn gốc dược liệu Các vị dược liêu đựơc sử dụng trực tiếp dang phận thán, rễ, lá, hoa, quả, hạt thang thuốc, dưởi dạng dịch chiết, cao khô dược liệu, đưa vào dạng bào chế đại viên nén, viên nang, dung dịch tiêm Các thuốc có nguồn gốc dược liệu sử dụng với tỷ lệ không nhỏ cộng đổng, sở điều trị Bên cạnh tru điểm thừa nhận hiệu điều trị số loại bệnh, tính an toàn điều trị kéo dài vấn đề chất lượng độ đồng chất lượng liều dùng khác vấn đề quan tâm nhà bào chế kiểm nghiệm thuốc Đó điểm khác biệt thuốc tân dược thuốc dược Vì thế, để chuẩn hoá chất lượng thuốc, cần phải định lượng xác hàm lượng hoạt chất có vị liệu đưa vào sử dụng Linarỉn ílavonoid có khả giảm đau, hạ sốt, chống viêm đặc biệt có tác dụng ức chế phát triển tế bào ung thư tuyển tiền liệt khỉ kết hợp với acid chlorogenic Một số nguồn dược liệu chứa linarỉn Cúc hoa vàns, mương núi, liễu ngư, hoa mật mông Linarin coi họp chất thiên nhiên vỉ chưa có bẩt kì tài liệu công bố phưcrng pháp tảng hạp linarin theo đường hoá học, cách nhát để có linarin chiết xuất từ dược liệu Do đỏ, tiến hành thực khoá luận “ Nghiên cứu chiết xuất, phân lộp, tỉnh chế lỉnarin từ Cúc hoa vãng” nhằm giải vấn đề tạo chất chuẩn linarin phục vụ công tác kiểm nghiệm chế phẩm chứa dược liệu có linarin - nội dung nằm đề tài nhảnh đề tài cấp nhà nước mang mã sổ KC.10.16.02/06-10: “Nghiên cửu chiết tách, tỉnh chế $ố hợp chất thiên nhiên đặc trưng từ dược liệu để làm chất chuẫn phục vụ kiểm nghiệm dược iiệu” Mục tiêu đề tài: Khảo sát lựa chọn quy trình chiết xuất ílavonoid toàn phàn từ Cúc hoa vàng Xây dựng quy trình phân lập Hnarỉn từ ílavonoid toàn phần Cúc hoa vàng Xây dựng quy trình tinh chế linarin với độ tinh khiết > 95% đạt tiêu chuẩn làm chất chuẩn phục vụ kiểm nshiệm dược liệu CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN 1.1 Đối tượng nghiên cúu 1.1.1 Cúc hoa vàng 1.1.1.1 Đặc điểm thục vật 111, [2Ị, [41, |6|, |7|, |8|, [91 Tên khoa học; Chrysanthemum irtdicum L Tên đồng nghĩa: Chrysanthemum procumbens Lour Tên khác: Kim cúc, dã cúc, cam cúc, hoàng cúc, Hình L Cúc hoơ vàng Ckryscmthemum ịndicum L Cây thảo, sống hàng năm, hay sống dai, cao khoảng lm Thân mọc thẳng, nhằn, có khía dọc, phân cảnh Lá mọc so le, chia làm nhiều thủy, mép có rang cưa nhọn, không đều, mặt màu lực đen sẫm, mặt nhạt, cuống ngắn, có tai gốc Cụm hoa hình đầu, nách hay đỉnh cành, đường kính - l,5cm, cuống dài - 5cm; hoa hình lưỡi nhỏ, màu vàng, xếp hai vòng; hoa hình ống, tràng dài 2mm, mào lông; tràng hoa hình ống ngắn hon trảng hoa hình lưỡi, có thùy tam giác nhọn màu vảng Quả bế, có mào lông Mùa hoa, tháng 10-12 tháng năm sau 1.1.1.2 Phân hố sinh thái [1|, [2], Ị4|, [6], [7], [8Ị, [9] Cúc hoa có nguồn gốc vùng Đông Á: Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Việt Nam, Lào, Thái Lan, Ân Độ Cúc hoa trồng làm cảnh, từ lâu trồng làm thuốc Trung Quốc, Nhật Bản ỏ Việt Nam vậy, dùng lảm thuốc từ sớm trồng nhiều lảng Nghĩa Trai (Hưng Yên), Nhật Tản (Hà Nội), Tế Tiêu (Hà Tây) Cây ưa khí hậu mát (10° - 35°C), độ ầm 80%, ánh sáng vừa phải, thường dược trồng vườn, công viên, cánh dồng với mục đích lấy hoa làm thuốc hay ướp chè, nấu rượu Cây hoa nhiều, hàng năm, hỉếm có hạt Mùa đông có tượng rụng tàn lụi Chính lúc này, người ta thường cảt bỏ phần thân, cành, giữ lại géc để tái sinh làm giống trồng vào mùa xuân năm sau 1.1.1.3 Trồng trọt thu háỉ [2J, |6Ị, [7|, [8j, J9| Được trồng bẳng mẩu thân, dài chừng 20cm Mửa trồng tốt tháng 5-6 Sau 4-5 tháng hắt đầu thu hoạch (trồng cuối tháng 5, thu hoạch tháng 9; trồng tháng 6, thu hoạch tháng lữ - 11) Có thể trồng từ tháng 3, đến tháng phát trụi đi, sau lại nảy mầm, tháng 10 thu hoạch hoa nhiều tốt hon Bộ phận dùng lả cụm hoa, hoa hái vảo lúc trời khô ráo, đem xông lưu huỳnh kỹ, xong nén chặt khoảng đêm, nước chảy đen dược, sau phơi nắng nhẹ (khoảng 3—4 nấng) hay sáv 40° - 50ũ c đến khô Nếu trời râm ban đẽm phải sấv lưu huỳnh, Bâo quản chỗ khô 1.1.1.4 Thành phần hóa học Ị4Ị Trong Cúc Hoa có chứa tinh dầu, carotenoỉd, acỉd amin, vỉtamin A, Aavonoìd số loại sesquiterpen 4Tiến hành định lượng sơ cắn linarin thồ lóp mỏng dùng hệ dung môi: Cloroíòrm - methanol - 30nước hành khảo sát lựa chọn hệ dung môi (5:1:0,1) pha động phương pháp cho quy trình Hình đồ sắc ký tiến phân lập 3.3: sắc ký - Dung dịch chuẩn: Pha dung dịch hấp phụ linarỉn chuẩn methanol có nồng độvết chuẩn khoảng lmg/mh Ỉìnarìỉi vả ỉìnarịn - Dưng dịch thử: Dung địch rửa giải từ trình phân lập chạy Chẩm 10pl dung dịch chuẩn thử lên mỏng, khai triển sắc ký đến sắc ký cột dung môi 10 cm, lấy mỏng ra? để khô không khỉ màu hơí ammoniac *Yêu cầu: Trên sắc ký đồ, dung dịch thử cỏ vết giống hình dạng, màu sắc giá trị Rf với vết dung dịch ỉinarin chuấn kết luận ống nghiệm cỏ linarin + Sau hứng dịch đồne thời kiểm tra sắc ký lớp mỏng ta thấy ràng: - Ống từ dển 41 vết íinarin, chửng tỏ khống chứa ỉinarin - Ồng từ 42 đến 102 kiểm tra thấy có vết linarin - Ống íừ 103 trở có vết linarin có thêm vét tạp khác Do mục đích thu linarin tĩnh khiết thoả mãn yêu cầu chất chuẩn phục vụ kăềm nghiệm dược liệu nên lấy phân đoạn dịch từ ống 42 đến ống 102, gộp tất phân đoạn dịch lại vào bình cầu Đem cất quay bay hết dung mõi ta thu cắn iitiarin thô sấy cắn 60°c vòng sau đem cân ta thu 4,23 lOg linarin thô, ta gội sản phẩm phân lập vết thỏ sau 31 Qua hình ảnh sắc ký đồ ta thấy lỉnarin thô sau chạy qua cột hấp phụ tinh khiết trước cồn lần lượne, nhỏ tạp chất Do vậy, tiến hành phân tách tiếp cản cách cho chạy qua cột Sephadex 3.3.2.2 Giai đoạn 2: Phân tách cột Sephadex 3.3.2.2.1 Diều kiện phân lập - Cột thuỷ tinh có van điều chỉnh tốc độ chảy dung môi, dài 50cm đường kính 3cm - Chất nhồi cột: Sephadex LH-20 - Dung môi pha động: methanol 3.3.2.2.2 Mô tả trình phẳn lập - Chuẩn bị cột sác ký: Lắp cột thẳng đừng trẽn giá, khoá van Lót lớp mong phía đáy cột, van đề chất nhồi cột không chày khởi cột - Nhồi cột: Ngâin ngập 100 g Sephadex LH-20 methanol 48 IChuấv để tạo hồn dịch, rót từ từ vả liên tục vào cột (dùng đũa thuỷ tinh giúp rót hồn dịch lên thành cột, tránh tạo bọt khí) Mở khoá cột dung mồi chảy từ từ, hứng dung tnỗỉ để ngược trở lại cột, tránh đé khô cột Cho dung môi chảy tiếp 32 tục đến cột on định (trong £ÌỞ) Khoả van cột lại, ỷ đảm báo dung môi ngập cột Sephadex - Đưa mẫu lên cột: Hòa toàn sản phẩm phân lập (khoảng 4,2g) 15 methanol (cỏ thể đun cách thủy để tăng khà tan) chuyển vào cột (đồ từ từ vào thành cột để tránh sáo động lớp chất nhồi cột), dùng pipet tráng vỏng quanh bên thành cột - Tiến hành mở khoá van vả hứng dung môi chảy vào ống nghiệm 2ml với tốc độ 2ml/phút Chú ý hứng phải bồ sung dung môi lên cột đảm bảo cột Sephadex ngập dung môi - Liên tục kiểm tra dịch rửa giải sắc ký lớp mỏng dùng hệ dung môi Cloroíbrm - methanol - nước (5:1:0,1) tiến hành để phát phân đoạn linarin - Gộp ống chứa phản đoạn linarin lại, cho vào bình nón nhỏ, đem cất quay thu hồi dung môi thu cắn Đem sấy cấn 60°c vòng đem cân ta thu 3,312 lg linariti thô, gọi sản phẩm sau phân lập *Tiến hành thù độ tinh khiết sơ linarin sản phẩm phân lập bàng cách chấm sẳc ký với hệ dung môi khác nhau: ' Hệ ỉ: Cloroíòrm - methanol - nước (5:1:0,1) - Hệ 2: Ethyl acetat - acid formic - nước (8:1:1) - Hệ 3: Ethyl acetat - acid formic - acid acetic khan - nước (100:11:11:26) Kết ta thu hình ảnh sắc ký đồ: Với C: vết linarin chuẩn T: vết mẫu thử Cc = 23,5pg/ml sc= 3536,14 m (mg) Diện tích Sj Hàm lượng X (%) 25,1 87,61 25,4 3308,94 34 35 3347,72 25,2 3323,64 87,65 87,59 xác ml dung dịch vào bình định mức 5ữml, pha loãng vừa đủ methanoỉ, Trung bình 87,62 0,45pm STTlọc qua màng Hàmlọc lượng linarỉn (%) *Kết quả: 87,2 Dựa vào diện 86,9tích pic sác ký đồ thu được, tính hàm lượng lập theo bảng 3.6, linarỉn cắn phân 86,8 Hàm lượng (%) ỉinarin Cúc hoa tính theo côns thức: 87,4 X(%) =Ẽi-x—£c—X100 87.3 sc m x 10 TR 87,12 Trong đó: Sf, Sc: Diện tích pic mẫu thử mẫu chuẩn 0.49 s Hình 3.4; sác kỷ đò hệ ỉ Hình 3.5; sắc ký đỏ hệ Hình 3.6; sắc ký đỏ hệ Cc: Nồng độ linarin chuồn (|Lig/ml) * RSD 0,56sắc ký đo ta nhận thây vết $ẳn phẳitì phạn lập chạy sác ký Từ hỉnh ảnh * Ta3thấy 2%,nhau chứng quy lập linarin xâyvét linarin m:hơn Lượng cân cancho sautrình lập lớp mỏng với hệ RSD đung nhỏ môi khác đềutỏ 1phân vếtphản duy(mg) giốngvừanhư Bảng 3.6: Kết định ỉưọng linarin cán ỉinarìn thô sau trình phân lập dựng độ ta lặpcólạithế cao chuẩn Docỏvậy kết luận sơ sản phẩm sau phần lập tinh khiết * Sơ đồ*Cụ quy trình linarin Aavonoid toàn phần hoasau vàngphàn ỉập theo thê taphân xáclậpđịnh hàmtừ lượng linarĩn sản Cúc phẩm Dược điển Trung Quốc với điểu kiện sắc ký sau: - Cột: Rp (5 ịxm), dài 25cni - Pha động: Methanol - nước - acid acetic (52: 46: 2) - Bước sóng: 334 nm - Thẻ tích tiêm: 20 \x\ - Tốc độluận: dòng:Sau Iml/2phút *Kết lần phân tách dùng sắc ký cột hấp phụ cột Sephadex, sản *Pha mẫu: phẩm phân lập dẵ đạt độ tinh khiết khoảng 87,6%, dạt yêu cầu độ tinh khiết đối Dung Linarin dướiđược áp suất với -chất saudịch ỉinarin phân chuẩn: lập đồng thời chuần lượng linarinsấythôở 50*c, phân lập giảm cao trước khỉ dùng, Pha dung dịch chuẩn cỏ nồng độ khoảng 23 pg/nil methanol (22,08%) - Dung mẫu thử:củaCân 3.3.3 Đánh giá dịch độ ốn định quychính trìnhxác khoans 25 mg cắn sau phân lặp sấy ởTiến 50(*c, suất giảm khỉ 5dùng vào bìnhlần định mức lượng lOOml, hòa hànhdưới quy áp trình phân lập trước lần, sau ta định linarin tan (có thểcắn đun cáchlập thủy tăng độ tan) vừa 3.7 đủ bàng methanol Mút phân Kếtđếquả dược tómvà tắtlàm bảng Bảng 7: Kết khảo sát độ lặp lại cửa quy trình phản lập 36 37 3.4* Nghiên cứu xây dựng quy trình tinh chế linarin 3.4.1 Khảo sát xây đựng quy trình tinh chế linarin Trong trình khảo sát xây dựng quy trình chiết xuất ílavonoid toàn phẩn, chúng tồi nhận thấy rằng, quy trình chiết xuất bàng đung môi methanol nóng cho hiệu suất chiết riêng ỉinarin cao hẳn quy trình khác, đồng thời với quy trình chiết dùng dung môi methanol nhiệt độ phòng cho hiệu suất chiết linarin thấp, nghĩ điều độ tan khác linarin dung môi methanol nóng nhiệt độ phòng, Do chủng tiến hành khảo sát cụ thể độ tan linarin methanol điều kiện nóng nhiệt độ phòng *Khảo sát độ tan linarin methanol nhiệt độ thường - Cân xác khoảng 5m£ cắn linarin (hàm lượng linarin khoảng 87,6%) cho vào côc có mỏ - Tiến hành thêm lượng 0,5ml dung môi methanol vào cốc Lắc cho vào bình siêu âm nhiệt độ thường giúp cho linarin nhanh tan Quan sát thấy dung dịch đục chứng tỏ linarin chưa tan hét, thấy dung dịch trở nên suốt không vẩn đục tức linarin tan hoàn toàn - Két thấy ràng để hoà tan hoàn toàn 5,23 lOmg linarin cần 89ml methanoỉ nhiệt độ phòng Tức độ tan linarin methanol nhiệt độ phòng khoảng 0,0588 mg/mh *Khảo sát độ tan linarin melhanol nóng - Cốc có mỏ chứa 89ml methanol hoà tan khoảng Smg Ịinarin thí nghiệm đem đun cách thuỷ bay bớt dung môi đến khoảng 20ml - Đổ toàn sang bình định mức nhỏ có nắp đậy kín Mở nắp bình, tiếp tục cho vào đun nóng cách thuỷ 6ơ°c, cho bay hêt dung môi đặt bình vào bình Cc = 24,4pg/ml sc=3605,22 m (mg) Diện tích Sf Hàm lượng X (%) 12,6012 91,78 12,9802 1708,94 38 39 1727,72 12,3098 1689,64 92,90 90,01 91,56khi cho phải đậy kín Trung -+ Thề Thêm dần lượng Q,5ml methanol, ý sau tíchdần tiêm: 20bình nỉ nắp bình+tránh để dòng: bay methanol, Tốc độ iml/phút - Quan sát đến lượng methanol vừa đủ để hoà tan hoàn toàn linarin Pha mẫu: dừng lại.+ Dung dịch linarin chuẩn: Linarin chuẩn sáy 50°c, áp suất - Ket dùng thây mg linarin hoà tan toàn25trong tối thiếu giảm trước Pha 5,23 dung10dịch chuẩn có nồng độ hoàn khoảng Ịig/ml 12ml methanol điều kiện đun nóng 60°c Tức độ tan ỉianrin methanol methanol 0,4359 mg/ml H-Ở60°c Dungkhoảng dịch mẫu thử: Cân xác khoảng 12 mg cắn sau phân lập Từ ởkhảo chúng tôỉ trước khảngkhiđịnh: tan đinh tốt dung môi sếy 50°c,sátdưới áp suất giảm dùngLinarỉn vào bình mức 50ml, hòa niethanoỉ nóng vả tan methanoỉ nhiệt độ phòng tan (có thể đun cáchrâtthủy để tăng độ tan) làm vừa đủ methanoh Hút Dựadung vào dịch kết chúngđịnh mức tiến hành quyvửa trình linarin xác ml trên, vào bình 50mỉ,khảo pha sát loãna đủ tinh bằngchế methanol, sau mảng tiến hành với khoảng 50mg linarin thô (hàm lượng khoảng 87,6%) lọc qua lọc 0,45|um Tiến hành mẫu vảo hệ thống sắc ký Cân chínhtiêm xác2 102,4367mg lỉnarin thố, cho vào bình nón đáy nhọn, thêm Hàm lượng (%) linarin cán tính theo công thức: khoảng 250ml methanol Đun nóng dồng thời siêu âm cho linarin tan hoàn toàn - Để dung dịchX(%) nguội nhiệt độCrphòne, thấy xuẳt kết tủa bình X 100 - Đặt bình vào tủ lạnh,Scsau m x5hì Olấy quan sát thấy chất kết tủa láng xuống Trong 5jr; Sc' Diện tích pic mẫu thử mẫu chuẩn phần đáy nhọnđó: bỉnh nón độ (ịig/ml) - Dùng pipet Cc: hút Nồng phần dung môi linarin bên chuẩn tủa ý tránh xáo trộn lớp tủa m:đếnLượng cân sau đem phân lậptủa.(mg) phía khoảng lOOmlcan tiến hành lọc lấy ĩcết - Rửa tủa thu nhiềutóm lầntátbằng bảng methanol 3.8 ta thu cẳn có màu trắng ngà sấy tủa 60°c Bảng 3.8rvòng Kêt định lượng ỉinarìn ỉrong ĩìnarin thô sau trình tinh chê *Đem định lượng linarin cắn thu bàng sác ký lỏn£ hiệu cao theo Dược điển Trung Quốc - Điều kiện sắc ký cụ thể sau: + Cột: Rp 18 (5 Ịim), dài 25cm + Pha động: Methanol - nước - acid acetic (52: 46: 2) + Bước sóng: 334 nm 40 Từ bảng kết ta thấy ràng sau tinh ché trên, hàm lưựng linarin tăng từ 87,6% ỉên 91,5% Do cho lặp lại trinh tinh chế nhiều ỉần ta thu linarin hàm lượng > 95% thoã mần yêu cầu chất chuẩn phục vụ kiểm nghiệm dược liệu Chúng tiến hành lặp lại trình thêm lần nữa, sau lần tiến hành xác định độ tinh khiết linarin Kết sau: sau lần hàm lượng lỉnarin 94,06%, sau hàm lượng đạt 96,07% Tức sau lần tinh chế vậy, thu linarin đạt tiẻu chuẩn độ tinh khiết chất chuẩn phục vụ kiểm nghiệm dược liệu Tiến hành thực quy trình tinh chế lần, thấy ràng quy trình ta cần tiến hành tinh chế đến lần thứ thu linarin đạt hàm lượng > 95% Do xây dựng quy trình tinh chế linarin sau 3.4.2 Quy trình tỉnh chế linarin - Cân xổc khoảng lOOmg linarin thô, cho vào bình nón đáy nhọn, thêm 250ml methanol Đun nóng đồng thời siêu âm cho linarin tan hoàn toàn - Đe dung dịch nguội nhiệt độ phòng - Đặt bình vào tủ lạnh, sau 12h lấy quan sát thấy có kết tủa lắng xuống phần đáy nhọn bình nón - Dùng pipet hút phàn dung môi bên tủa, tránh xáo trộn lóp tủa phía đén khoảng lOOml tiến hành đem lọc lấy tủa - Rửa tủa nhièư bàng methanol ta thu cán có màu tráng ngà - Đem xác định hàm lượng linarin bàng sắc ký lỏng hiệu cao Nếu hàm lượng linarin 95% ta tiến hành lặp lại trình đến thu dược linarin hàm lượng > 95% 3.4.3 So' đồ quy trình tinh chế linarìn 41 42 BÀN LUẬN VẾ quy trình chiết xuất Thông thường, chiết xuất tìavonoid toàn phần, người ta thường dùng dung môi ethanol methanoỉ điều kiện chiết nóng* Trong tiến hành khoá luận, phát điểm đặc biệt độ tan iinarin: khồng tan nước dung môi thông thưởng, kể dung môi methanol lại tan methanol điều kiện đun nóng Do quy trình chiết xuất sử dụng dung môi methanol điều kiện chiết nóng chủng đă xây dựng cho hiệu suất chiết linarin cao quy trinh phân lập sẳc ký cột ỉầ phương pháp hay dùng phân lập hợp chất thiên nhiên từ dược liệu có ưu điểm đơn giản dễ tiến hành, tách hầu hét chất Trong giai đoạn đầu, sử dụng sắc ký cột phân tách linarin từ tlavonoid toàn phần Củc hoa cỏn lẫn nhiều tạp Sản phẩm thu sau giai đoạn chứa tạp chất hơn, chung tiến hành phân lập cột Sephadex Kết sau giai đoạn phân tách thu linarin thô đạt độ tinh khiết chất sau phân ỉập (87,6%) dồng thơi lượng thu cao (22,08%) quy trình tinh chế Trong nội dung khoá luận, tinh chế Iinarin phương pháp kết tinh dựa khả kết tinh linarin methano! từ điều kiện đun nóng điều kiện nhiệt độ thường, Cách tinh chế vừa đơn giản dễ thực hiện, tiết kiệm chi phí đồng thờỉ sản phẩm tinh chẻ có độ tinh khiết cao thoả mãn yêu cầu làm chất chuẩn phục vụ kiểm nghiệm dược liệu Ngoài ra, có 43 KÉT LUẬN VÀ ĐÈ XUÁT Kết luận Sau hoàn thành khoá luận, thực số nộí dung sau: - Biết cách vận dụng kiến thức học để tiến hành nghiên cứu đề tài, từ việc thu thập tài liệu, khảo sát, lựa chọn điều kiện đề xây dựng quy trình - Xây dựng quy trình chiêt xuât ílavonoid toàn phần Cúc hoa đon giãn, dề tiến hành, sử dụng dun% môi quen thuộc quan trọng cho hiệu suất chiết thành phần linarin cao - Xây dựng quy trình phân lập lmarin từ Ạavonoid toàn phản ổn định, phù hợp với điều kiện trang thiết bị có Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương - Biết cách khai thác đặc điềm đặc biệt cua chất ứng dụng vào quy trình tinh ché Cụ thế, dã ứng dụng khả kết tinh methanol linarin dể xây dựng quy trình tinh ché đơn giản, dễ thực tốn kém, cho sản phẩm đạt độ tinh khiết thoả mãn làm chất chuẩn kiểm nghiệm dược liệu Đề xuất TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc, vị thuôc Việt Nam, NXB Y học Hà Nội, tr 604-605 Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, NXB trẻ, 3, tr 283-284 Trường Đại học Dược Hà Nội (1998), Bài giảng Dược liệu, tập 1, tr 259323 Viện Dược Liệu (2004), Cây thuốc động vật ỉàm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học kỷ thuật, tập II, tr 574-579 Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2007), Đàm bào chất lượng thuốc so phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr 107-118; tr 230-249 Võ Văn Chi (1969), Cây cỏ thưởng thấy Việt Nam, NXB Khoa học kỷ thuật, tập 1, tr 263-264 Võ Vãn Chỉ (2003), Từ đỉển thực vật thông dựng, NXB Khoa học kỳ thuật, tập 1, tr.66h Võ Vãn Chi (1977), Tử điển cầy thuốc Việt Nan?, NXB Y học, tr.340 Võ Vãn Chi, Trần Hợp (1999), Câv cỏ có ích Việt Nơm, NXB Giáo Dục, tập 1, tr.507-508 TIẾNG ANH 10 Cheng w, immunodưlatory Li J, actĩvitìes You T, of the Hu c extracts (2005), from “Anti-inílamatory the inílorescense and of Chrysanthemum indicum Linne”, JEthnởpharmacơh 101 (1-3): 334-7 11 Fermandez SP, Wasowski c,  Loscaỉzo LM, Granger RE, Johnson GA, Paladini AC, Marder M (2006), “Central nervous System depressant aetion of ílavonoid glycosids”, European journaỉ of 'pharmacoỉogy, 539(3): 168-ỉ 76 12 Han s,  Sung KH,Yim D, Lee s, Lee CK, Ha NJ, Kim K (2002);’ The effect of linarin on LPS-induced cytokine produetion and nitric oxide inhibition in murỉne macrophages cell line RAW264.7.” Archives of pharmacaỉ research, 25 (2): 170-177 13 Hause BM, Schulz KH (1976), “Chrysanthemum allergy III, identiíìeation of the allergens”, Arch DemiaíỡỉRỔS, 255 (2): 111-121, 14 Hiroji Ina, Hideo íida (1981), “Linarin monoacetate from thalictrum aquilegiíòlium”, Phytochemỉstry, 20 (5):1176-1177 15 Tang H, Huang X, Yang Y, zhang Q (1997), “Studies on the antilipid peroxidation of nine sorts of Chinese herbal medicines with the function of protecting liver”, Zhong Yao Cai, 20 (12):624-626 16 Kong LD, Cai Ys Huang ww,  Cheng Ch, Tan RX (2000), “Inhibittion of xanthin oxidase by some Chenese medicinal plants uses to treat gout”, J Etỉmophơrmacỡl, 73 (1-2): 199-207 17 Lu D, Lu GR, Zou JM (2005), “Determination of linarin in Yuye Jiedu gnanule by RP-HPLC ”, Zhonggỉiỡ Zhong Yao Za Zhi, 30 (93), 191-192 18 Mariano Martinez-Vazquez, Teresa Q.Ramirrez Apan, Hidemi Aguilar M, Robert Bye (1996), “Analgesic and Antipyretỉc Activỉties of an Aqueous Estract and of the Flavone Linarin of Buddlei cordata”, Planta Medìca 62: 137-140 19 Markus Ganzera , Astris Purcher and Hermann stuppner (2005), “Differentiation of Cirsmm japonỉcum and c.setosum by TLC and HPLCMS, Phyíởchem Anơỉ, 16, 205-209 20 Matinez-Vazquez M, Ramisez Apan TO, Lastra AL, Bye R (1998), “A comparative study of the anaỉgesic and anti-ìnflammatory activities of pectolinarin ĩsolated from Cirsium sub coriaceum and iĩnarin ỉsolated from Buddleia cordata.”, Pìanta medica, 64 (2): 134-137 21 Matsuda H, Morỉkawa T, Toguchida I, Harima s, Yoshikawa M, (2002), “Medicinal flọwers, VI.Absolute glycosỉdes and a stereostructures phenynbutanoỉd glycoside of two from new the Havanoĩie flowers of Chrysantheraum indicum L.itheir inhibitory activities for rat lens aldose reductase”, Chem Pharm Buỉỉ (Tokyoj, 50 (7);972-5 22 Oinonen pp, Jokela JK, Hatakka AI, Vuorela PM, (2006) “Linarin, a selective acetyỉchollnesterasẹ inhibitọr frorn Mentha arvensis”, Fitoierapỉa, 77(6): 429-434 23 Qunlin Zhang *, Jun Li, Chao Wang, Weĩ Sun, Zhongtang Zhang, Wen.ming Cheng (2007), “A gradient HPLC method for the quallty control of chlorogenic acid, linarin and luteolin in Flos Chiysanthemi suppository”, Jonrnaỉ of Pharmaceuticaĩ andBiomedicaỉ Anaìysis, 43,753-757 24 Rodriquez-Zaragoza s, Ordaz c, Avi3a G? Munoz JL, Romode Vivar A (1999), “ ỉn vitro evaluation of the amebicidal activity of Buddiea cordata (Laganiaceae, H.B.K) on several strains of Acanthamoeba, dournaỉ ỡf athnopharmacoỉogy, 6Ố (3):327-334 25 Schulz KH, Hausen BM, Walhofer L, Schimỉdt-Loữer “Chrysanthemum allergy Pt II: Experỉmental studies p (1975), on the caưsatỉve agents’*, Arch DermatoỉForschy 25 ỉ (3):235-244 26 Shi Y, Shi RB (2007), uRe!ative adscription of components in the effectỉve íractions of Yinqỉao decoction and ĩts composing indÌYÌduaỉ herbs”, Yơo Xưe Xue Bao, 42 (2): 192-196 27 Shi Y, Shi RB, Liu B, Lu YR (2001), “studies on antỉviral ílavonoids in yinqiaosan powder”, Zhỡỉĩgguỡ Zhortg Yaa Za Zhi, 26(5):320-323 28 Singh RJP, Aqrawaỉ P,Yim D, Aqrawal c, Aqravval R (2005), “Aeacetin inhibits cell grovvth and cell cycle progressin, and induces apoptosis in human prostate cancer ceỉỉs: ctructure-activitỵ reỉatỉonship with linarin and linarin ecetate”, Carcỉmgensìs, 26 (4):845-854 29 V.Vrchovskay, LSpỉlkova Y, P.Valạntẹ Ọz, C.Sousaz, P.B.Àndradez, R.M.Seabraz (2008), “Assessing the antioxidative propertỉes and Chemical composition of Linarin vulgaris ỉníỊusion” Naturaì Product Research, Vok 22,No 9,735-746 30 WANGJun-xian? LI Jiao- she, YANG Guang - de , LU Ping and Zhu Yu - hong (2001), “Dẹtermination of linarin in Buddleia oííĩcinalis Maxim By RP - HPLC”, 21 (2), 103-104 31 XIONG Li, CHEN Xiao - hui, GAO Xun, Mao Zheng - yan, BI Kai shun (2008), “Content determination of quercetin-7-O- -L-rhamnoside in Hyperium japonicum by HPLC”, Youmal of Shenyang pharmaceutical unĨYersity, 25 (10):806-809 32 Xu Long, YAO Xiao- lei, HE Xiao-hua, ZENG Jìan-guo, PENG Qinghua (2008), “Determination of íĩavonoids in Buddleia officenalis Maxim with HPLC, Journaỉ ofTCM ưnl OfHunana, voi 28, no.5,21-24 33 Y, Jia, Y.-J Li2 X-J Tan, Q Li, K.-S Bi (2006), “RP-HPLC Determination of Linarin in Beagle Dog Pỉasma After Administraỉtion of Yejuhua Injection”, Chromaỉtographìạ,64, 303-305 34 Yoshikawa M, Morikawa T, Toguchida I, Haroma s, Matsuda H (2000), “Medicinal flowers II Inhibitors of nitric oxide production and absolute stereostructures of five new gemacrane — type sesquiterpenes, kikkanols D, D monoacetate, E, F, and F monoacetate from the flowers of Chrỵsanthernum indicum L.” Chem Pharm Buỉỉ (Tokvo), 48 (5):651-656 [...]... PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên 2 mẫu Cúc hoa: - Mầu 1: Mau Cúc hoa được tho hái tại Văn Lâm, Hưng Yên, theo hình thái và theo Dược điển III là loài Chrysanthemum indicum - Mầu 2: Mau Cúc hoa được đặt mua, được trồng tại vùng Nộỉ Mông, Trung Quốc Cả 2 mẫu đều được phơi sấy khỏ và say thô Nguyên lỉệu để phân lập là Bavonoid toàn phần thu được từ quy trình... chỉ sau 3 lần tinh chế như vậy, chúng tôi đã thu được linarin đạt tiẻu chuẩn độ tinh khiết của chất chuẩn phục vụ kiểm nghiệm dược liệu Tiến hành thực hiện quy trình tinh chế như trên 5 lần, thấy ràng trong mỗi quy trình ta chỉ cần tiến hành tinh chế đến lần thứ 3 là thu được linarin đạt hàm lượng > 95% Do vậy chúng tôi xây dựng quy trình tinh chế linarin như sau 3.4.2 Quy trình tỉnh chế linarin - Cân... cáclinarin dung môi khác nhau pháp sắc ký lóp mỏng (TLC) 3.1.2 Địnhvói tính bằng phương 4 -• Phương Phản ửng với H2SO4 đặc +++ toàn phần: sắc ký cột pháp phân lập ỉinarỉn ra khỏi ílavonoid *Định tính linarin tròng cả 2 mẫu Cúc hoa bẳn£ phưcmg pháp sắc ký lớp hú ý:- +++: Phảnpháp ứng dưong rẩt rõkết Phưong chếtính linarin: tinh nhiều lần trong dung môi phân cực Định tínhtinh ílavonoid trong Cúc hoa vàng. .. khi phân lập - Với chất có khả năng kết tinh, ta cỏ thể dùng phưong pháp kết tinh nhiều lần trong các dung môi và diều kiện về nhiệt độ hay pH khác nhau - Giống như trong quá trình phân lập, ta có thể tinh chế bằng cách cho chạy nhiều lần qua các cột sác ký hấp phụ 12 - Ta cùng có thể tinh chế bằng sắc ký phân loại theo kích cỡ (SEC), còn gọỉ là sắc kỷ rây phân tử hay sẳc ký ỉọc qua gel Cách tỉnh chế. .. 2,5911 2,41 3 luận: 105,6544 *KÌt 2,5345 - Mầu Cúc hoa ỉ Trung khỏngbỉnh có linarin 2,40 2,41 Phuoììg pháp chiết nóng Dung 3*2*L2.-Lần Mầu Cúc hoa 2 cô linarin toàn Hàm lượng tlavonoíđ toàn liệu Flavonoid môỉ *TiếnDược hành Do vậy từ đây về sau chúng tôi chỉ tiến hành nghiên cứu với mẫu Cúc hòa 2 phần (g) phần trong dược liệu (%) (g) vá gọi chung hoa Ethanol 1 ỉà Cúc 102,5231 3,4532 3,37 I' J 1 70% 2 106,3451... phần thu được từ quy trình chiết xuất Cúc hoa Nguyên liệu để tinh chế là cắn linarin thô thu được từ quy trình phân lập ỉinarỉn 2.2 Phuoìig tiện nghiên cứu - Cân phân tích Mettỉer Toledo AB 204 (Viện Kỉếm Nghiệm thuốc Trung ương) - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Aeilent 1200 - Máy cất thu hồi dung môi Rotavapor của hãng Buchi - Dụng cụ thủy tinh các loại - Cột thiiy tinh các cỡ - Bản mỏng tráng sẵn silicagel... lOOml, hòa hànhdưới quy áp trình phân lập trước như trên lần, sau ta định linarin tan trong (có thểcắn đun cáchlập thủy tăng độ tan) vừa 3.7 đủ bàng methanol Mút chính phân Kếtđếquả dược tómvà tắtlàm ở bảng Bảng 3 7: Kết quả khảo sát độ lặp lại cửa quy trình phản lập 36 37 3.4* Nghiên cứu xây dựng quy trình tinh chế linarin 3.4.1 Khảo sát xây đựng quy trình tinh chế linarin Trong quá trình khảo sát... gút, dịch chiết methanoỉ của Cúc hoa có hoạt tính ức chế xanthin oxidase mạnh thứ hai Như vậy, tác dụng điều trị bệnh gut phần nào là do hoạt tính ức chể Xanthin oxida&e [16] 6 Hai Flavanon glycosỉde mới ((2S)- SL (2R)-eriodictyol“7-0-6»D- glucopyranosidurronic) trong Cúc hoa cố hoạt tính ức chế aldose reductase ở thủy tinh thể chuột nhắt trắng [21], Tinh dầu cất từ nụ Cúc hoa, đã được thử trên các chủng... quy lập linarin xâyvét linarin m:hơn Lượng cân của cancho sautrình lập lớp mỏng với hệ RSD đung nhỏ môi khác đềutỏ 1phân vếtphản duy(mg) nhất giốngvừanhư Bảng 3.6: Kết quả định ỉưọng linarin trong cán ỉinarìn thô sau quá trình phân lập dựng độ ta lặpcólạithế cao chuẩn Docỏvậy kết luận sơ bộ sản phẩm sau phần lập khá tinh khiết * Sơ đồ*Cụ quy trình linarin Aavonoid toàn trong phần của hoasau vàngphàn... cắn thu được ở 60°c  trong vòng 3 giờ sau đó đem cân, từ đó ta tĩnh được hàm lượng ílavonoid toàn phần chiết xuất được * Sơ đổ quy trình chiết xuất ílavonoid toàn phẩn từ Cúc hoa: 25 26 3.3 Nghiên cứu xây dựng quy trình phân lập 3.3.1 Nghiên cửu lựa chọn hệ dung môi pha động * Tiến hành Chưng tôi đã tham khảo một số tài liệu và thấy rằng, trong phân lập các Havonoid bàng phương pháp sắc ký cột thường ... gel hay dược dùng trình tinh chế 13 CHƯƠNG 2: ĐỚI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Chúng tiến hành nghiên cứu mẫu Cúc hoa: - Mầu 1: Mau Cúc hoa tho hái Văn Lâm, Hưng Yên,... pháp tảng hạp linarin theo đường hoá học, cách nhát để có linarin chiết xuất từ dược liệu Do đỏ, tiến hành thực khoá luận “ Nghiên cứu chiết xuất, phân lộp, tỉnh chế lỉnarin từ Cúc hoa vãng” nhằm... quy trình tinh chế lần, thấy ràng quy trình ta cần tiến hành tinh chế đến lần thứ thu linarin đạt hàm lượng > 95% Do xây dựng quy trình tinh chế linarin sau 3.4.2 Quy trình tỉnh chế linarin -