Bước đẩu nghiên cứu tổng hợp L-dopa từ L-tyrosin Phạm Thị Hiền, Nguyễn Đình Luyện, Thái Nguyễn Hùng Thu Trường Đại học Dược Hà Hội SUM M ARY L-d o p a (LD) is a k ey d ru g in th e tre a tm e n t o f P a rk in so n 's d isease LD w a s o b ta in e d via a fo u r-step p a th w a y : (i) E sté rifica tio n o f L-tyrosin w ith m e th a n o l to p ro d u c e L-tyrosin m eth y l e ste r (2); (ii) A cy la tio n o f in p yrid in g a v e 0,N -diơ cetyl-L-tyro sin m eth y l ester (3); (Hi) A rra n g e m e n t rea ctio n o f 3, ca ta ly sts A lC lj to p ro d u c e L-ß-(3-acetyl-4-hydroxyphenyl)-N -acetylalanin (4); (iv) O xida tio n a n d h y d ro ly sis a ffo rd e d L-d o p a The stru c tu re o f th e p ro d u c ts a n d in term ed ia tes w a s d e m o n stra te d b y th e m e th o d o f in fra red sp e ctro sco p y, m a ss sp e c tro m e try a n d p ro to n n u cle a r m a g n e tic re so n a n c e sp e ctro sco p y S o m e co n d itio n s in flu e n cin g th e y ie ld o f the p ro c e ss w ere in vestig a te d Từ khóa: L-d op a, lev o d o p a , ,4-d ihydro xyp hen yl-L-a la n in , L-tyrosine, P arkinso n kết tổng hợp xác định cấu trúc LD Đặt vấn đề Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Parkinson bệnh lý thường gặp người già 60 tuổi Tỷ lệ mắc bệnh gia tăng theo tăng Nguyên liệu: L-tyrosin tách từ dịch thủy tuổi thọ trung bình giới L-dopa (LD) tiến thuốc chuyển hóa dopamin, thay dopamin phân nguổn keratin khác (nguyên liệu đạt điểu trị hội chứng suy tháp bệnh nhân bị chuẩn nguyên liệu theo tiêu chuẩn Dược điển Anh Parkinson nên LD xem thuốc chủ chốt 2007) điểu trị bệnh Parkinson ưu điểm L-dopa bổ sung dopamin kịp thời chế bệnh sinh Do nhu cẩu sử dụng LD ngày cao Tuy nhiên đến chưa thấy có sở nghiên cứu tổng hợp Hóa chất: Aceton, HCI, H^so^, ethanol tuyệt đối, ether dáu hỏa, ethyl acetat, methanol, NaOH, ninhydrin, pyridin (tinh khiết hóa học - Trung Quốc); dược chất nước Chúng tiến hành nghiên cứu tổng hợp anhydrid acetic, hydrogen peroxyd, natri carbonat khan, nhôm clorid khan, nitrobenzen (for synthesis - Merck - Đức); giấy thị vạn năng, nước cất (tiêu sừng ) Nguồn keratin sẵn có Việt Nam chuẩn sở - Việt Nam) Phương pháp nghiên cứu: Tổng hợp L-dopa từ L-tyrosin thông qua bốn chê' phẩm ngành công nghiệp khác Sau giai đoạn sơ đồ sau [5], [1 ], [2]: LD từ L-tyrosin (là sản phẩm thu từ trình thủy phân nguồn keratin khác nhau: tóc, móng, COOH MeOH/ H2SO4 COOMe Ac20 /pyridjn NH2 HO (1) 70-80°C/12h HO' ^ 10-40°c/4h AcO' (3 ) AlCls/nitrobenzen 110-125“C/4-6h COOH HO' NHAc H202/Na0 H ầ - Sử dụng phương pháp hóa học, vật lý, hóa lý để tách tinh chế chất trung gian sản phẩm tạo thành acetic vào hỗn hợp nguyên liệu tan hết Trong suốt trình phản ứng trì nhiệt độ thích hợp, khuấy tiếp Khi phản ứng kết thúc, - Kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm theo dõi phản ứng sắc ký lớp mỏng (bản mỏng Silicagel thêm vào hỗn hợp phản ứng 100 ml ethyl acetat chiết loại pyridin dung dịch H C I1M (3 lẩn, dung môi khai triển n-butanol:acid acetic: nước=9:2:2,5), xác định hệ số dịch chuyển (Rf) dịch sản phẩm, cất thu hổi dung môi đến thu lần 70 ml) Cuối rửa nước, thu dung - Xác định cấu trúc chất trung gian sản cắn dạng siro Thêm ethyl acetat khuấy cho phẩm phổ hồng ngoại (IR) ghi máy đo phổ hổng ngoại Perkin Elmer (Mỹ); phổ khối tan hoàn toàn, sau thêm ether dẩu hỏa, khuấy lượng (ESI-MS) ghi máy khối phổ Agilent thu kết tủa Lọc, sấy thu 6,32 g tủa thô Hiệu suất phản ứng 75,5% 6310 lon Trap (Đức), LC-MSD-Trap-SL (Đức), máy Để tìm điểu kiện tốt cho phản ứng đo phổ khối lượng phân giải cao FT-ICR-MS-Varian tổng hợp 0,N-diacetyl-L-tyrosin methyl ester với 910MS (Đức); phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton {'H-NMR) ghi máy Brucker AV-500MHZ hiệu suất cao nhất, tiến hành khảo sát yếu tố ảnh (Mỹ) - Xử lý kết quả, sổ liệu nghiên cứu phẩn mểm Excel Kết nghiên cứu hưởng đến quy trình: Dung mòi thực phản ứng (pyridin, dd NaOH 30%, dd Na2C03 thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng tỷ lệ mol chất tham gia phản ứng Hiệu suất phản ứng tốt (76,88%) với dung môi phản ứng pyridin; tỷ lệ mol ACjO: ester = 2,25:1; phản ứng nhiệt độ 25°c thời gian Tổng hạp L-tỵrosin methyl ester (2) Thực phản ứng ester hóa 15 g (0,083 mol) L-tyrosin (1) 400 ml methanol, xúc tác HjSO^ đặc Đun hổi lưu hỗn hợp 12 Theo dõi phản ứng sắc ký lớp mỏng Sau phản ứng, hỗn Tủa thô kết tinh lại hỗn hợpethanol/ nước sôi ( / ) Hợp chất có t“ : 105 - 107“C; = 0,88; IR (KBr, em '): 3256 (-NH amid), 1745 (-C=0 ester), 1633 hợp phản ứng để nguội nhiệt độ phòng, cất thu (-c=0 amid), 1558 (-C=C- thơm); ESI-MS (m/z): 301,6 ([M+Na]+) hổi dung môi cắn thu hòa tan nước, làm lạnh điều chỉnh pH - dung dịch Tổng hỢp L-lĩ-(3-acetyl-4-hydroxypbenỵl)-Nacetylalanin (4) Na^COj bão hòa, xuất tủa Lọc, thu tủa thô Khối lượng sản phẩm (m) thu 12,46 g Hiệu suất 77,1 % Cho vào bình cầu khô g (10,75 mmol) nguyên liệu 36 ml nitrobenzen Khuấy cho tan hết, thêm Tinh chế tủa thô : Hòa tan dung dịch HO IM , làm lạnh điểu chỉnh pH vể - dung dịch Na^COj bão hòa, xuất tủa Lọc, rửa thu sản phẩm Sản phẩm có t“ : 134-ISÓ^C; Rf = 0,45; IR(KBr, em ’); 3208 (-NH^, vùng 3100-3010 (-C-H thơm), 2833 (H3C-), 1731 (-c=0 ester) 3,6 g (26,96 mmol) AICI3 khan, hỗn hợp đun hổi lưu khoảng nhiệt độ 125- 130“C Trong trình đun có kiểm tra sản phẩm tạo thành sắc ký lớp mỏng Thử nghiệm phương pháp tinh chế sản phẩm theo phương pháp sau: a, Phương pháp tác giả L Bernardi cộng (1970) [1]: Sau phản ứng kết thúc làm Tổng hợp 0,N-diacetyl-L-tỵrosin methyl ester lạnh bình cầu thêm nước Thêm tiếp dần dẩn Cho 18 ml pyridin vào bình cầu cổ dung tích tách nitrobenzen cất kéo nước Nhôm (3) Na^CO^ khan vào hỗn dịch trên, khuấy Sau 100 ml, làm mát bên nước đá Nghiến hydroxyd dạng gel lọc nóng dạng đóng nhỏ 5,85 g (30 mmol) cho vào dung môi đả chuẩn bánh hấp thụ vào nước vài lẩn, rửa với HCI bị Sau nhỏ từ từ 7,1 ml (75 mmol) anhydrid Dịch lọc nước rửa chiết với ethyl acetat cất thu hổi dung môi dịch chiết ethyl acetat, để kết tinh đặc (với tỷ lệ 2:1) Hỗn hợp phản ứng đun hói thu Phương pháp khó loại nitrobenzen, lưu 1 8°c vòng cất loại bỏ bớt acid thêm 10 phẩn nước sôi Dung dịch thêm 0,1 g khó lọc loại AKOH)^ dạng keo không kết tinh Na^SjOj g than hoạt để tẩy màu vòng 30 sản phẩm b, Tinh chế theo phương pháp tác giả H phút Lọc loại bỏ than hoạt Làm lạnh dịch lọc 0°c Bretscheneider cộng (1973) [5]: Hỗn hợp phản đưa pH 5,5 dung dịch NaOH 2N thu ứng làm lạnh đến nhiệt độ phòng, thêm hỗn LD Tủa thô lọc rửa với nước lạnh, sau với aceton Sản phẩm sấy khô chân hợp nước đá acid HCI đặc Lớp nitrobenzen tách Pha nước rửa ethyl acetat không Tinh chế tủa thô: Hòa tan tủa thô hỗn hợp Cô đặc pha nước, để lạnh 12 tủa rắn xuất Lọc thu sản phẩm Phương pháp dễ loại nước acid HCI32%, thêm g than hoạt để tẩy nitrobenzen nhôm clorid Tuy nhiên, sản màu, lọc nóng để loại than hoạt, thu lấy dịch lọc Làm phẩm chưa tinh khiết Không kết tinh Cải tiến phương pháp thu phương lạnh dịch lọc 5°c đưa pH 5,5 dung dich pháp kết tinh sau; Chiết hỗn hợp sau phản ứng lẩn ethyl acetat Thu lấy dịch chiết pha hữu Chiết pha hữu thu hai lẩn NaOH 2N Thu lấy dịch chiết pha nước Loại nitrobenzen thừa ether dầu hỏa Dịch chiết làm lạnh 5°c NaOH 2N thu tinh thể màu trắng Lọc thu lấy tinh thể rửa với nước lạnh, sau với aceton rổi sấy khô chân không thu 0,9 g sản phẩm tinh khiết Hiệu suất 80,6% Sản phẩm có f : 275 - 276"C; R, = 0,45; IR (KBr, sau điểu chỉnh vế pH =1 acid HCI đậc thu em '): dải hấp thụ từ3600-3000 (-0H phenol -NHj), 3076 (-CH thơm), 1730 (-C=0 acid), 1570 (-C-C- tủa Sấy khô tủa thu 1,25 g hợp chất thơm), 1254 (-C-0- phenol); Hiệu suất 43,87% Hợp chất có t° :1 -1 “C ;R = 0,61; IR (KBr, em ’): 3355 (-NH amid), 1726 (-C=0 ester), 1641 (-c=0 amid), 1554 (-C=C- thơm); ESI-MS (m/z): 263,9 ESI-MS (m/z): 198 ([M+H]+); Công thức phân tử dựkiến:C,H„NO^ ’ H-NMR (500MHz, DP+CF3CO OD) ô (ppm): 6,65 (1H, d (J=8,0), H-C3,); 6,57 (1H, d (J=1,5), 6,49 ([M-H]-); ’ H-NMR (500MHz, DMSO) ô (ppm); 11,82 (1H, (1H, dd (J=8,0; 1,5), H-C^,); 4,04 (1H, dd (J=7,0; 5,5), H - g ; 3,00 ( H, dd (J=14,5; 5,0), 2,87 (1H, dd s, H-0); 8,19 (1H, d (J=8,0), H-N); 7,75 (1H, d (J=2,0), H-C,,); 7,39 (1H, dd (J=8,0; 2,0), H-C^,); 6,87 (1H, d (J=7,5), H-C^,); 4,39 (1H, m, H-C-COOH); 3,02 (1H, dd (J= H ; 11,5) H < 3) Các giá trị ỗ (ppm) D-dopa phổ ’H-NMR lẩn lượt 6,99 (d,J=8,0); 6,93 (s); 6,83 (d, J=8,0); 4,43 (J=13,5; 4,5), H.-Cp; 2,82 (1H, m, H < 3); 2,62 (3H, s, H3C-C0 -Ar), 1,78 (3H, s, HjC-CO-NH) Tổng hợp L-dopa (LD) Hòa tan nguyên liệu 1,5 g (5,56 mmol) 13 (dd, J=7,2; 5,6); 3,32 (dd, J=14,4; 5,6) 3,20 (dd, J=14,4; 7,2) [3] Từ liệu phổ IR, phổ khối lượng phổ proton với giá trị tài liệu tham khảo cho phép để xuất hợp chất LD acid (S)-2- ml dung dịch NaOH 1N Thêm từ từ ml dung dịch amino-3-(3,4-dihydroxyphenỵl) propanoic 7,1%, phản ứng trì nhiệt độ phòng vòng 24 Hỗn hợp phản ứng acid hóa Bàn luận 2,16 ml acid HC11N, sau cất đến kiệt Chất rắn hoà tan với aceton nóng, phần muối - Về phản ứng tạo diacyl từL-tyrosin methyl ester vô không tan lọc qua phễu lọc thủy tinh (2): Nhiệt độ phản ứng tỷ lệ mol chất tham gia Dịch lọc cất đến kiệt lần thu hợp phản ứng ảnh hưởng nhiểu đến hiệu suất phản ứng: chất trung gian Nhiệt độ phản ứng phù hợp khoảng 25°c Khảo sát lựa chọn tác nhân thủy phân amid Có thể nhiệt độ thấp nhưo - 5°c xảy chọn quy trình sau: Sản phẩm trung gian phản ứng N-acyl hóa khả phản ứng acyl hòa tan hỗn hợp acid acetic băng HCI nhóm -OH phenol yếu nhiệt độ thấp Khi nâng dẩn nhiệt độ khả phản ứng acỵl nhóm -OH phenol tăng lên xảy thời phản ứng 0-acyl hóa N-acyl hóa Tỷ lệ mol anhydrid acetic: L-tyrosin methyl ester = 2,25:1 hiệu suất phản ứng lớn Nguyên nhân phản ứng diacyl nên tỷ lệ mol tối thiểu 2:1, tăng tỷ lệ mol lên 2,25:1 hiệu suất tăng lên tăng thêm xảy phản ứng triaq^l tạo sản phẩm phụ làm giảm hiệu suất - Vê phản ứng chuyển vị Fries nhôm Việc loại phức hợp ảnh hưởng lớn đến kết tinh sản phẩm Chỉ cán lẫn lượng nhỏ nhôm sản phẩm không kết tinh Dựa đặc tính này, thay đổi phương pháp kết tinh để loại hết lượng nhôm dư lẫn sản phẩm Về phản ứng thủy phân từ đến LD: sử dụng tác nhân HBr 48% phản ứng xảy mãnh liệt, gây khó khăn tinh chế sản phẩm Vì tiến hành thay HBr hỗn hợp add HCl đặc: acid acetic băng (tỷ lệ :2) Kết cho thấy phản ứng tốt, hiệu suất cao sản phẩm dễ tinh chế AlClj acid Lewis có vai trò xúc tác cho phản ứng Một điểu kiện để acid Lewis Kết luận phát huy tác dụng phản ứng phải thực điểu kiện khan nước Sự diện lượng nhỏ nước làm ngưng phản ứng acid Lewis tác Đâ tổng hợp L-dopa từ L-tỵrosin có nguồn gốc nước (đạt tiêu chuẩn nguyên liệu làm dụng với nước bị phân hủy Vì vậy, thuốc theo chuyên luận Dược điển Anh 2007) cấu phản ứng cẩn thực môi trường khan nước, dung môi sửdụng nitrobenzen, xúc tác AICI3 trúc sản phẩm chất trung gian chứng minh cách đo phổ hổng ngoại, phổ khối khan, hóa chất thiết bị cẩn làm khô trước phản ứng [4], yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng acyl hóa L-tyrosin Trong phản ứng, tạo phức hợp lượng phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Các methyl ester khảo sát TÀI LIỆU THAM KHẢO Bernardi L , Golfredo (1973), Process fo r the preparation o fL-d op a., Th e Unites States Patent and Trad em ark O ffice, u s 3717673 Brady w T (1957), Th e synthesis o f 0-m ethyl-N -acetyl-L-tyrosine, California Institute o f Technology Chen F Y., Uang B J (2001), "Enantioselective Synthesis o f (R)-3-(3,4-D ihydroxyphenyl) alanine from tert-Butyl Glycinate", The Jo u rn a l o f O rganic Chem istry, 65(10), pp 3650-3552 Ogata Y Tab uch i H {1964), "A study on th e m echanism o f Fries reaction", Tetrahedron, 20(7), pp 1661 -1566 B retschneider H Hohenlohe-O ehringen K., Kaiser A., W ölcke u , (1973), "Eine neue Synthese des 3-[3,4-Dihydroxy-phenyl]-L-alanins (L-DOPA) aus L-Tyrosin", Helvetica chim ica acta, 56(8), pp 2857-2860  ... - Về phản ứng tạo diacyl t L- tyrosin methyl ester vô không tan l c qua phễu l c thủy tinh (2): Nhiệt độ phản ứng tỷ l mol chất tham gia Dịch l c cất đến kiệt l n thu hợp phản ứng ảnh hưởng nhiểu... nhóm -OH phenol yếu nhiệt độ thấp Khi nâng dẩn nhiệt độ khả phản ứng ac l nhóm -OH phenol tăng l n xảy thời phản ứng 0-acyl hóa N-acyl hóa Tỷ l mol anhydrid acetic: L- tyrosin methyl ester = 2,25:1... giả H phút L c loại bỏ than hoạt L m l nh dịch l c 0°c Bretscheneider cộng (1973) [5]: Hỗn hợp phản đưa pH 5,5 dung dịch NaOH 2N thu ứng l m l nh đến nhiệt độ phòng, thêm hỗn LD Tủa thô l c rửa