BÀI NGHIÊN CỨU * Nghiên cứu chiết xuất artemisinin từ Thanh cao hoa vàng carbon dioxyd siêu tứi hạn Phạm Thị Hiển, Nguyễn Văn Hân Trường Đại học Dược Hà Nội SUMMARY Artemisinin is the most commonly drug for treatment of malaria In this research, we have researched on extraction ofortemisinin from Artemisia annua L using supercritical fluid Artemisinin was successfully extracted by supercritical fluid composed of carbon dioxide and 50 ml n-hexơnein hours with temperature and pressure fixed at 50°c and 200 bar, respectively Từ khóa: Artemisia annua, artemisinin, carbon dioxyd siêu tới hạn, Thanh cao hoa vàng Đặt vấn đề Artemisinin thuốc chống sốt rét có hiệu cao, đặc biệt với ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum kháng cloroquin Ngày nay, artemisinin dẫn xuất lựa chọn hàng đầu để điểu trị bệnh sốt rét mở nhiều triển vọng điểu trị mới: kháng tế bào ung thư, chống oxỵ hóa Do nhu cẩu sử dụng artemisinin dẫn chất ngày cao.Trên giới, có nhiều tác giả nghiên cứu sản xuất artemisinin Trong đó, chiết xuất artemisinin từ Thanh cao hoa vàng (Artemisiơ annuo L) phương pháp chủ yếu Việc dùng dung môi hữu để chiết xuất artemisinin ngày chứng tỏ có nhiều nhược điểm: độc hại, dễ cháy nổ ô nhiễm môi trường Chiết xuất dung môi siêu tới hạn (như carbon dioxyd siêu tới hạn) thay cần thiết cho việc sửdụng dung môi hữu thông thường [4] Với nguồn nguyên dược liệu sẵn có Việt Nam với dung môi carbon dioxyd rẻ tiền, dễ kiếm, tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: Chiết xuất artemisinin từ Thanh cao hoa vàng dung môi carbon dioxyd siêu tới hạn khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến trình chiết xuất Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu Nguyên liẹu Lá Thanh cao hoa vàng (Artemisiơ onnua L.) thu mua Vĩnh Tường-Vĩnh Phúc Aceton, cloroform, ethyl acetat n-hexan, natri hydroxyd (tinh khiết hóa học-Trung Quốc); artemisinin chuẩn 993% (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương), ethanol 96%, carbon dioxyd 99,9% (Việt Nam) 32 I Nghiên cúuduợcThông tin thuõc I Số 1/2015 Thiết bị Hệ thong chiết xuất siêu tới hạn Separex (Pháp, dung tích bình chiết lít); Máy cất quay chân không Bùchi B-490 R-220 (Thụy Sỹ); Máy đo quang phổ UV-VIS Hitachi (Mỹ);Tủ sấy điện MEMMERT (Đức) Phương pháp nghiên cứu Xác định hàm lượng artemisinin Thanh cao hoa vàng phương pháp đo quang kết hợp sắc ký lớp mỏng theo Dược điển Việt Nam IV [1], Chiết xuất artemisinin từ Thanh cao hoa vàng carbon dioxyd siêu tới hạn, tham khảo phương pháp tác giả M Kohler (1997) [3] Y L Lin (2006) [5] Các bước tiến hành sau: Chuẩn bị nguyên liệu: Lá Thanh cao hoa vàng sấy khô điểu kiện nhiệt độ 50-60°C giờ, xay thành bột thô, rây qua cỡ rây mm Chiết xuất 100 gam bột nguyên liệu làm ẩm với 50 ml dung môi, ủ Sau nạp nguyên liệu vào bình chiết.Tiến hành chiếtxuất thu lấy sản phẩm Trường hợp không dùng dung môi, cắn chiết hòa vào 30 ml n-hexan nóng để kết tinh 48 Nếu dùng dung môi dịch chiết cất loại hết dung môi, hòa cắn thu đượcvào 30 ml n-hexan nóng rổi để kết tinh 48 Lọc lấy tinh thể artemisinin, rửa tinh thể xăng công nghiệp nóng thu artemisinin thô Tinh chế artemisinin: Artemisinin thô hòa tan phần ethanol 96% cốc có mỏ, thêm than hoạt với lượng 5% artemisinin thô Đun cách thủy khuấy 10 phút Lọc nóng qua phễu Buchner để loại than hoạt, rửa bâ than ethanol nóng thu lấy dịch lọc Gộp dịch lọc dịch rửa, để ầ kết tinh nhiệt độ phòng 24 giờ, lọc lấy tinh thể phễu Buchner, rửa tinh thể lẩn ethanol, sấy khô nhiệt độ 60°c, thu artemisinin tinh khiết Kết nghiên cúu Xác định hàm lượng artemisinin Thanh cao hoa vàng Hàm lượng artemisinin Thanh cao hoa vàng xác định 0,48% Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết Ảnh hưởng dung môi: Sử dụng dung môi là: ethanol 96%, n-hexan aceton Kết trình bày bảng Báng Ảnh hưởng củũ dung môi đễn hiệu suất chiết (n=3) Đồng dung môi Khối lượng artemisinin chỉết (mg) Hiệu suất chiết (%) Không dùng dung môi Ethanol 96% n-hexan Aceton 192,19 40,0 241,11 50,2 389,46 81,1 260,72 54,3 Kết cho thấy sử dụng dung môi cho hiệu suất chiết tốt sử dụng carbon dioxỵd siêu tới hạn Đổng dung môi n-hexan cho hiệu suất chiết tốt (81,1%) Do vậy, n-hexan sử dụng làm dung môi chiết cho thí nghiệm Ảnh hưởng áp suất chiết: Tiến hành chiết xuất điểu kiện áp suất khác nhau: 100±10 bar; 150±10 bar; 200±10 bar; 250±10 bar; 300±10 bar Kết trình bày bảng 2: Báng Ảnh hưởng cùa áp suất đễn hiệu suất chiểt (n=3) Áp suất chiết (bar) Khối lượng artemisinin chỉết (mg) 100±10 150±10 200±10 250±10 300±10 299,62 321,50 389,46 385,63 389,86 Hiệu suất chiết (%) 62,4 66,9 81,1 80,3 81,2 Kết bảng cho thấy: Khi tăng dẩn áp suất chiết từ 100 bar đến 200 bar hiệu suất chiết tăng lên từ 62,4% đến 81,1%.Tuy nhiên, tiếp tục tăng áp suất đến 300 barthì hiệu suất chiết không thay đổi Áp suất 200 bar lựa chọn cho khảo sát Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hiệu suất chiết Làm thí nghiệm khảo sát với nhiệt độ chiết khác nhau: 40; 50; 60°c Kết trình bày bảng Bảng Ảnh hưởng củo nhiệt độ chiắđến hiệu suất chiồ (n=3) Nhiệt độ chiết r o Khối lượng artemisinin chiết (mg) Hiệu suấtchỉết(%) 40 333,53 389,46 377,79 69,4 81,1 78,7 50 60 Kết bảng cho thấy: Khi tăng nhiệt độ bình chiết từ40 lên 50°c, hiệu suất chiết tăng nhanh từ 69,4% đến 81,1%.Tăng tiếp nhiệt độ lên 60°c hiệu suất chiết có xu hướng giảm Vậy nhiệt độ 50°c lựa chọn cho thí nghiệm khảo sát Ảnh hưởng thời gian chiết: Làm thí nghiệm khảo sát với thời gian chiết khác nhau: 1,2,3,4,6 Kết trình bày bảng Số /2 1Nghỉêncứuduợcẩhôngtlnthuõc 33 BÀI NGHIÊN CỨU Bảng Ảnh hưởng củũ thờigian chiết đến hiệu suát chiết (n=3) Thời gian (giờ) Khối lượng artemisinin chiết (mg) Hiệu suất chiết (%) 272,54 389,46 393,84 394,13 394,22 56,7 Kết bảng cho thấy: Tầng thời gian chiết hiệu suất chiết tăng từ 56,7% đến 82,1% Sau giờ, hiệu suất chiết đạt 81,1% hẩu không tăng thêm Vậy thời gian phù hợp Như vậy, từ kết khảo sát trên, thông số phù hợp cho quy trình chiết là: dung môi n-hexan, áp suất 200 bar, nhiệt độ 50°c, thời gian Đánh giá chất lượng sản phẩm artemisinin Sản phẩm artemisinin thu có đặc điểm sau: Tính chất: bột kết tinh, màu trắng Nhiệt độ nóng chảy: 156-157°c Hàm lượng: 99,44% Nhận xét: Sản phẩm artemisinin thu đạt yêu cẩu hình thức cảm quan, nhiệt độ nóng chảy hàm lượng artemisinin (> 98,5%) theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV Bàn luận Chiết xuất artemisinin từ Thanh cao hoa vàng theo phương pháp truyền thống n-hexan xăng công nghiệp, cẩn dùng lượng lớn dung môi (tỉ lệ dung môi/dược liệu khoảng 15/1), hiệu suất chiết thường đạt 60% [2], [4] Ngoài ra, dung môi dễ cháy nổ độc hại Phương pháp chiết xuất artemisinin từ Thanh cao hoa vàng sử dụng dung môi siêu tới hạn có ưu điểm sau: Dung môi carbón dioxyd rẻ tiển, không độc hại, thân thiện với môi trường Lượng đồng dung môi sử dụng (50 ml, tỉ lệ 1/2 so với dược liệu) 81,1 82,0 82,1 82,1 Hiệu suất chiết cao (đạt 80%) Carbon dioxyd siêu tới hạn dung môi phân cực hòa tan artemisinin Phải dùng thêm dung môi chiết để làm tăng hiệu suất chiết Qua khảo sát đâ chọn dung môi n-hexan cho hiệu suất chiết tốt Mặc dù ethanol 96% aceton có khả hòa tan artemisinin tốt n-hexan, n-hexan lại tan tốt carbon dioxyd siêu tới hạn Ngoài ra, thời gian, áp suất nhiệt độ ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất chiết Theo kết bảng 2, với áp suất chiết thấp, carbon dioxyd chưa hoàn toàn đạt tới trạng thái siêu tới hạn mong muốn, nên hiệu suất chiết thấp Khi áp suất chiết đạt 200 bar, hiệu suất chiết tăng ổn định Theo kết bảng 4, hiệu suất chiết tăng theo thời gian Tuy nhiên, với dung môi carbon dioxyd siêu tới hạn sau gẩn trình chiết đạt tới trạng thái bão hòa Do vậy, tăng tiếp thời gian hiệu suất chiết tăng lên không đáng kể Các kết thu tương tự với nghiên cứu công bố trước [3], [5] Kết luận Artemisinin đă chiết xuất thành công từ Thanh cao hoa vàng carbon dioxyd siêu tới hạn Qua khảo sát xác định thông số thích hợp cho quy trình chiết sử dụng dung môi n-hexan (tỉ lệ 1/2 so với dược liệu), áp suất 200 bar, nhiệt độ 50°c thời gian Artemisinin thu có hàm lượng đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV (99,44%) TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y té (2009), Dược điền Việt Nam IV, tr 895-896 Bộ Y tế (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, Tập 1,tr 145-241 Kohler M et al (1997), "Extraction of artemisinin and artemisinic acid from Artemisia annua L using supercritical carbon dioxide", Journal of Chromatography A, 785, pp 353-360 Lapkin A A et al (2006), "Comparative assessment of technologies for extraction of Artemisinin", Journal of Natural Products, 69(11), pp 1653-1664 Lin Y L et al (2006), "Response surface methodology to supercritical fluids extraction of artemisinin and the effects on rat hepatic stellate cell in vitro", Journal of Supercritical Fluids, 39, pp 48-53 34 I Nghiên cứudượclhông tin t h u ỗ c ! Số 1/2015 ... với nghiên cứu công bố trước [3], [5] Kết luận Artemisinin đă chiết xuất thành công từ Thanh cao hoa vàng carbon dioxyd siêu tới hạn Qua khảo sát xác định thông số thích hợp cho quy trình chiết. .. suất chiết thường đạt 60% [2], [4] Ngoài ra, dung môi dễ cháy nổ độc hại Phương pháp chiết xuất artemisinin từ Thanh cao hoa vàng sử dụng dung môi siêu tới hạn có ưu điểm sau: Dung môi carbón dioxyd. .. thu artemisinin tinh khiết Kết nghiên cúu Xác định hàm lượng artemisinin Thanh cao hoa vàng Hàm lượng artemisinin Thanh cao hoa vàng xác định 0,48% Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết