ỨNG DỤNG SÁC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO TRONG TIÊU CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU ĐINH LẢNG ( RADIXPOLYSCIASIS) Chừ Thi Thanh Huyền', Vũ Ngọc Ánh Trịnh Thị Nhung ' HDKH: PGS TS Nguyễn Thị Kiều Anh', ThS Nguyễn Huy Văn^ ThS Lâm Thị Bích Hồng^, TS Hà Vân Oanh' 'Trường Đại học Dược Hà Nội ^Công ty Cổ phần Traphaco Từ khóa: acid oleanolic, đinh lăng, HPLC, pic đảnh dấu Tóm tắt Phương pháp HPLCpha đảo detector u v bước sóng 208 nm; cột Inertsil ODS (250 X 4,6 mm; ịtm), pha động acetonitril: dung dịch HịP 04 0,1% (70 : 30) Định tính đinh lăng dựa cụm pic pic acid oleanoỉic lả “pic đảnh dấu ” có thời gian lưu khoảng 28 phút Các chất tách từ dược liệu đinh lãng có thời gian lưu tương đổi 0,61; 0,65; 0,72; 0,75; 1,00 1,08 Đồng thời tiến hành định lượng acid oleanolic dược liệu dựa vào đường chuẩn acid oleanolic xây dựng ngày phân tích với khoảng nồng độ - 40 ug/ml có r > 0,999 Hàm lượng acid oỉeanolic mẫu nghiên cứu nằm khoảng 0,011 mg/g đến 0,15 mg/g Đặt vấn đề Trong năm gần đây, đinh lăng có tên khoa học Polyscias /ruticosa (L.) Harm., họ Nhân sâm (Araliaceae) trở thành nguyên liệu sản xuất nhóm sản phẩm Hoạt huyết dưỡng não Theo khuyến cáo Tổ chức Y tế giới nghiên cứu thuốc từ dược liệu, yếu tố hiệu lâm sàng, độ an toàn, nghiên cứu chế tác dụng, cần phải có nghiên cứu thành phần hóa học phưong pháp đánh giá chất lượng dược liệu cách khoa học đầy đủ Tiêu chuẩn hóa sản phẩm với tiêu chí rõ ràng, kiểm soát thành phần hoạt chất cụ thể (định tính, định lượng) điều kiện tiên để sản phẩm hội nhập vào thị trường giới Nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu đầu vào sản xuất dược liệu đinh lăng, bước đầu xây dựng dấu vân tay cho dược liệu dựa việc định tính acid oleanolic năm chất có mặt đinh lăng, đồng thời định lượng acid oleanolic dược liệu sắc ký lỏng hiệu cao Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu, hóa chất thiết bị - Chất đối chiếu: Acid oleanolic, Tokyo Chemical Industry Company, hàm lượng 98,8%, độ ẩm 2,3% - Dung môi, hóa chât: Methanol (MeOH), Acetonitril (MeCN), acid phosphoric đặc loại HPLC Merck, Đức Acid hydrocloric đặc, cloroform loại tinh khiết phân tích, Trung Quốc - Thiết bị phân tích: Hệ thống máy HPLC detector UV-DAD Agilent Technologies 1260 Infinitive, Mỹ Cân phân tích Mettler Toledo AB 204, Thụy Sỹ (d = 0,1 mg) Các thiết bị dụng cụ khác phù hợp yêu cầu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Dược liệu đinh làng thu hái từ vùng khlác ba tỉnh Hòa Bình (4 mẫu), Nam Định (12 mẫu) Đắk Nông (3 mẫu) Công ty Traphaco cung cấp Phương pháp nghiên cứu - Xử lý mẫu; Qua tham khảo tài liệu [1, 5, 7, 8] tiến hành khảo sát, lựa chọn qui trình xử lý mẫu [4] sau: Cân xác khoảng 2,5 g bột dược liệu (dược liệu khô, nghiền nhỏ, rây qua rây cỡ 1400), thêm 40 ml MeOH vào đun sôi hồi lưu giờ, lọc lấy dịch, thêm 40 ml dung dịch acid hydrochloric 1/2, đun sôi hồi lưu Làm lạnh, lọc lấy cắn, rửa cắn nước đến hết acid sấy 60“c khoảng 15 phút Thêm vào cắn 25 ml cloro form, khuấy kỹ, làm nóng cách thủy 10 phút, để nguội, lọc Cô dịch lọc cách thủy đến cạn Hòa tan pha loãng cắn MeOH vừa đủ 10,00 ml, lọc qua màng lọc 0,45 ịim dung dịch tiêm sắc ký - Điều kiện sắc ký: Qua tham khảo tài liệu [1, 7, 8] tiến hành khảo sát thực tế, điều kiện sắc ký lựa chọn là: Cột: Inertsil ODS (250 X 4,6 ram; 5/im), bảo vệ cột Inertsil ODS (10 X 4,6 mm; Ịim), nhiệt độ cột 40°c ^ Pha động: MeCN : dung dịch H3PO 0,1% (70 : 30 tưtt) ^ Detector u v với X= 208 nm Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút Thể tích tiêm; 10 - Định tính; Dựa vào việc so sánh thời gian lưu pic ứng với acid oleanolic sắc ký đồ (SKĐ) mẫu thừ với mẫu chuẩn acid oleanolic làm song song phân tích HPLC Đồng thời, lựa chọn số pic đặc trung SKĐ mẫu thử sử dụng pic acid oleanolic “pic đánh dấu” để đưa kết luận dương tính xác định có mặt đinh lăng - Định lượng; Tiến hành xử lý mẫu thừ tiến hành sắc ký Tính nồng độ acid oleanolic dựa vào đường chuẩn xây dựng ngày phân tích với khoảng nồng độ acid oleanolic - ng/ml có hệ số tưofng quan hồi quy r > 0,999 Hàm lượng (mg/g) acid oleanolic dược liệu tính theo chế phẩm khô (mẫu thử xác định độ ẩm cân phưoTig pháp sấy nhiệt độ cao) tính theo công thức sau: C mx(lOO-a) Trong đó: C; nồng độ acid oleanolic dung dịch phân tích (ịig/ml) m: khối lượng bột dược liệu (g) a ; độ ẩm bột dược liệu cao khô dược liệu (%) Kết Định tính acid oleanolic dược liệu đỉnh lăng Tiến hành xử lý mẫu phân tích mẫu dược liệu theo điều kiện trên, kết cho thấy tất mẫu thử cho pic có thời gian lưu khoảng 28 phút, tương ứng với pic acid oleanolic tách riêng khỏi pic khác sắc ký đồ Hơn nữa, để khẳng định chắn có mặt acid oleanolic đinh lăng, tiến hành phân tích ừên hệ thống LC - MS/MS Thermo Scientific (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương) mẫu thử phân đoạn chứa acid oleanolic (từ khoảng 26 - 30 phút) Kết cho thấy phổ đồ mẫu thử xuất ion mẹ (ban đầu) có m/z 455,5 ứng với phân tử acid oleanolic (M = 456,7) ion tạo thành (con) có m/z 406,8 tương tự phổ đồ mẫu chuẩn acid oleanolic Hình sắc ký đồ phân tích đinh lăng HPLC (a) ì i [ _ jAJV ị Ể ^ is I (b) - Ị ”T toi' í , (c) Hình Sắc ký đồ số mẫu đinh lăng acid oleanolic chuẩn a) Mầu thử b) Mau thử c) acid oleanolic chuẩn Mặt khác, ừong SKĐ tất mẫu đinh lăng pic acid oleanolic có pic có thời gian lưu ổn định so với thời gian lưu pic acid oleanolic lựa chọn cụm bao gồm pic (trong pic acid oleanolic “pic đánh dấu”) dùng để định tính dược liệu đinh lăng Các pic có thời gian lưu tương đối 0,61; 0,65; 0,72; 0,75; 1,00 - acid oleanolic 1,08 Kết trình bày bảng Bảng Kết định tính định lượng acid oleanolic số mẫu Kêt định tính Ký hiệu mẫu Số tuổi Thòi gian lưu tirong đôi pic so vói pic acid oleanolic Kết định lirọng 0,61 0,65 0,72 0,75 1,00 1,08 Khôi lưọTig Độ ẩm (%) Hàm luọng (mg/g) NI + + + + + + (g) 25,352 6,58 0,0585 N2 + + + + + + 25,348 7,31 0,0711 N3 + + + + + + 25,200 9,93 0,1190 N4 + + + + + + 25,322 3,41 0,0504 N5 + + + + + + 25,627 3,26 0,0671 N6 + + + + + + 25,680 2,47 0,0759 N7 + + + + + + 25,279 5,44 0,1316 N8 + + + + + + 25,489 6,60 0,1255 N9 + + + + + + 25,583 9,05 0,1518 NIO + + + + + + 26,356 8,53 0,0947 N ll + + + + + + 25,318 6,56 0,0916 N12 + + + + + + 25,676 6,75 0,0837 H13 + + + + + + 25,495 4,96 0,1329 H14 + + + + + + 25,330 4,78 0,1026 H15 + + + + + + 25,359 5,23 0,1395 H16 + + + + + + 25,397 4,63 0,1175 D17 0,8 + + + + + + 25,769 6,49 0,0125 D18 0,8 + + + + + + 25,326 5,13 0,0113 D19 0,8 + + + + + + 25,498 3,85 0,0238 Định lượng acid oleanolic đinh lăng - Tiến hành xác định độ ẩm mẫu - Trong ngày phân tích mẫu dược liệu, xây dựng đường chuẩn acid oleanolic khoảng - )ag/ml, thiết lập phưong trình hồi quy biểu diễn mối tương quan diện tích pic nồng độ acid oleanolic chuẩn Yêu cầu đường hồi quy phải có dạng đường thẳng với hệ số tương quan r > 0,999 - Tính nồng độ acid oleanolic dung dịch sắc ký dựa vào diện tích pic acid oleanolic SKĐ phần định tính theo phưong trình hồi quy Từ xác định hàm lượng (mg/g) acid oleanolic dược liệu tính theo chế phẩm khô Kết trình bày bảng Kết bảng cho thấy: - Hàm lượng acid oleanolic mẫu dược liệu địa phương, tuổi có khác - Với mẫu đinh lăng có độ tuổi khác (3, 4, 5, tuổi) Nam Định, hàm lượng acid oleanolic khác biệt rõ rệt - Hàm lượng acid oleanolic dược liệu Đắk Nông thấp hẳn hai địa phương Hòa Bình Nam Định Bàn luận Chuyên luận “Đinh lăng” Dược điển Việt Nam IV [2] chưa đề cập tới tiêu định lượng, tiêu định tính dùng phản ứng hóa học để xác định có mặt saponin tinh bột Do đó, kết nghiên cứu góp phần cung cấp quy trình phân tích định tính, định lượng hoạt chất đinh lăng nhằm góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng dược liệu Định tính dược liệu dựa vào thời gian lưu tưong đối có sử dụng pic đánh dấu phân tích HPLC chưa nhiều, phương pháp lại sử dụng nhiều thực phân tích sắc ký lóp mỏng, sắc ký khí cần nghiên cứu đưa ứng dụng vào thực tế kiểm nghiệm Nghiên cứu phát triển phương pháp HPLC để tách, định tính cụm chất đinh lăng dùng acid oleanolic làm chất đánh dấu Các chất đinh lăng cho pic có giá trị thời gian lưu tương đối so với pic acid oleanolic là: 0,61; 0,65; 0,72; 0,75; 1,00 1,08 Định lượng dựa vào phương pháp thẩm định [4], tính hàm lưọng acid oleanolic mẫu thử dựa vào đường chuẩn acid oleanolic xây dựng ngày phân tích nên kết thu đáng tin cậy Hàm lưọng acid oleanolic dược liệu đinh lăng dao động khoảng từ 0,011 mg/g đến 0,15 mg/g Có khác hàm lượng acid oleanolic mẫu đinh lăng trồng địa phưcmg khác nhau, tuổi khác Tuy nhiên, thấy đinh lăng có số tuổi nhỏ tuổi có hàm lượng acid oleanolic thấp nhiều so với đinh lăng từ tuổi trở lên Sự khác biệt hàm lượng acid oleanolic liên quan đến khác biệt giống, thời gian thu hái, nơi canh tác, quy trình canh tác, khí hậu, thổ nhưỡng, cần có nghiên cứu quy mô rộng với nghiên cứu đồng yếu tố tác động đến hàm lượng acid oleanolic Trong nước có dược liệu tiêu chuẩn hóa định lượng hoạt chất nghiên cứu dược điển Các nghiên cứu kể đến “Nghiên cứu phát triển liệu chuẩn số dược liệu thường dùng phục vụ công tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu thuốc đông dược” [1] hay “Nghiên cứu thiết lập 10 chất chuẩn chiết tìr dược liệu” [3] Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ưong Một số chuyên luận Dược điển Việt Nam IV chuyên luận “Chè dây” định lượng phương pháp HPLC - u v sử dụng dung chất đối chiếu dihydromyricetin, chuyên luận “Thổ hoàng liên” chuyên luận “Vàng đắng” định lượng phương pháp HPLC - u v sử dụng chất đối chiếu berberin Do đó, nghiên cứu đóng góp nâng cao tiêu chuấn chât lượng dược liệu sản xuất nước So với nghiên cứu trước định lượng đinh lăng Việt Nam chủ yếu sử dụng phương pháp cân để định lượng saponin toàn phân, lần đẩu tiên xây dựng phưcmg pháp định lượng sapogenin biết đến có mặt đinh lăng (acid oleanolic) phương pháp đại HPLC Phương pháp HPLC định lượng acid oleanolic sử dụng nghiên cứu thẩm định theo tiêu thẩm định phương pháp phân tích thuốc nguyên liệu làm thuốc phương pháp HPLC gồm: Tính chọn lọc, đường chuẩn khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại độ ổn định dung dịch chuẩn Với điều kiện sắc ký không phức tạp, triển khai nhiều phòng thí nghiệm Việt Nam, chất phân tích acid oleanolic tách hoàn toàn khỏi tạp mẫu dược liệu vóả thời gian triến khai sắc ký khoảng 35 phút So với nghiên cứu Huahong Wang [7], phương pháp sử dụng nghiên cứu có khoảng nồng độ tuyến tính phạm vi mức nồng độ cao (5 - 40 Ịig/mì) với mục tiêu định lượng tất mẫu thử; so với nghiên cứu Yong-Xing Zhao [8] phương pháp nghiên cứu có khoảng nồng độ tuyến tính hẹp song có hệ số tưoíng quan tuyến tính r tưomg đương tất nghiên cứu Phương pháp tiến hành nghiên cửu có độ tốt (phần trăm tìm lại từ 96,4% đến 104,6%) Độ lặp lại thể trị số RSD % (4,06 4,11%) có giá trị tương đồng với nghiên cứu tác giả Huahong Wang [7] (RSD = ^83%) Kết luận Nghiên cứu tiến hành định tính, định lượng 19 mẫu dược liệu đinh lăng sử dụng phương pháp đại HPLC kết họfp với HPLC-MS có sử dụng chất đối chiếu Tuy nhiên, nghiên cứu tiến hành số lượng dược liệu không nhiều chưa đủ đại diện cho tuổi thu hái, vùng trồng, thời điểm thu hái, điều kiện canh tác, thổ nhưõng, khí hậu, nên tiếp tục ứng dụng phưong pháp để định lượng acid oleanolic nhiều mẫu đinh lăng để cỏ thể đưa khoảng hàm lượng quy định nhằm góp phần tiêu chuẩn hỏa nguồn nguyên liệu đầu vào Ngoài ra, nên tiếp tục phát triển phương pháp để định tính, định lượng đinh lăng chế phẩm thuốc chứa đinh lăng Tài liệu tham khảo Bộ Y tế (2009), Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp Bộ - Nghiên cứu phát triển liệu chuẩn so dược liệu thường dùng phục vụ công tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu thuốc đông dược, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Hà Nội Bộ Y tế (2009), Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp Bộ - Nghiên cứu phát triển liệu chuẩn sổ dược liệu thường dùng phục vụ công tác kiểm tra giảm sát chất lượng dược liệu thuốc đông dược, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ưong, Hà Nội Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội, tr 764-765, Phụ lục 5, PL 119-121, PL127-129 Bộ Y tế, Bộ Khoa học Công nghệ (2010), Báo cáo kết nghiên cứu đề tài nhánh thuộc đề tài nhà nước KC.IO.16/06-10 - Nghiên cứu thiết lập 10 chat chuẩn chiết từ dược liệu, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Hà Nội Chử Thị Thanh Huyền, Nguyễn Thị Kiều Anh, Trịnh Thị Nhung, Nguyễn Huy Văn, Lâm Thị Bích Hồng (2012), Nghiên cứu định lượng acid oleanolic cao khô đinh lăng sắc ký lỏng hiệu cao, Tạp chí Dược học, 438 (52), tr 34-38 Võ Xuân Minh (1992), Nghiên cứu saponin đinh lăng dạng bào chế từ đinh lăng, Luận án PTS Khoa học Y Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội Song Min Song, Taijun - Hang (2006), Determination of oleanolic acid in human plasma and study of its pharmacokinetics in Chinese healthy male volunteers by HPLC tandem mass spectrometry Journal o f Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 40 (1), pp 190-196 Huahong Wang, Zhezhi Wang, Wubao Guo (2008), Comparative determination of ursolic acid and oleanolic acid of Macrocarpium officinalis (Sieb et Zucc.) Nakai by RP - HPLC, Industrial crops and products, 28, pp 328-332 Yong-Xing Zhao, Hai-Jing Hua, Lin-Liu (2009), Development and validation of an HPLC method for determination of oleanolic acid content and partition of oleanolic acid in submicron emulsions, Pharmazie, 64(8), pp 491- 494  ... oleanolic cao khô đinh lăng sắc ký lỏng hiệu cao, Tạp chí Dược học, 438 (52), tr 34-38 Võ Xuân Minh (1992), Nghiên cứu saponin đinh lăng dạng bào chế từ đinh lăng, Luận án PTS Khoa học Y Dược, Trường... (ịig/ml) m: khối lượng bột dược liệu (g) a ; độ ẩm bột dược liệu cao khô dược liệu (%) Kết Định tính acid oleanolic dược liệu đỉnh lăng Tiến hành xử lý mẫu phân tích mẫu dược liệu theo điều kiện trên,... hàm lượng acid oleanolic Trong nước có dược liệu tiêu chuẩn hóa định lượng hoạt chất nghiên cứu dược điển Các nghiên cứu kể đến “Nghiên cứu phát triển liệu chuẩn số dược liệu thường dùng phục vụ