NGHBÊN CỨU TÁC DỤNG DƯỢC LÝ THựC NGHỆM TRÊN SỎI TIÉT NIỆU VÀ PHÂN LẬP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH CỦA Ý DĨ {Coix lachryma - jobì L.) Pham Đức Vinh* Trần Thúy Ngần^, Đỗ Thị Yấn^ Đào Hồng Hạnh^, Nguyễn Thị Đông^ HDKH: TS Nguyễn Quỳnh Chi'*, TS Nguyễn Thùy Dương' ' môn Dược lực, ^Sinh viên K62, K63 ^Trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương ''Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội Từ khóa: acid p-coumaric, carvci oxalat, Coix lachryma -jobỉ L„ sỏi tiết niệu, Ỷ dĩ Tóm tắt Nghiên cứu thực nhằm mục đích đánh giá tác dụng ức chế hình thành sỏi canxi oxalat in vitro in vivo dịch chiết nước toàn phần phân lập hoạt chất có tác dụng thân Ỷ d ĩ (Coix lachryma-jobi L.) Dịch chiết nước Ỷ d ĩ có tác dụng ức chế phụ thuộc nồng độ đổi với hình thành sỏi canxi oxalat, đồng thời làm tăng tỷ lệ COD/COM mô hĩnh ỉn vitro sử dụng đĩa 96 giếng Trên chuột cống trắng giống đực gây sỏi tiết niệu cách bố sung ethylen glycol 0,75% nước uổng hàng ngày, dịch chiết nước Ỷ d ĩ 2,52 g/kg thể tác dụng làm giảm sổ lượng sỏi lắng đọng thận so với lô chứng bệnh sau 28 ngày điều trị Từ phãn đoạn cỏ tác dụng ức chế sỏi mạnh nhất, phân đoạn ethyl acetat, phân lập acid p-coumaric, thể tác dụng ức chế sỏi in vitro mạnh so với natri citrat với giá trị ICịo 2,35 mM Các kêt tạo sở cho việc phát triển Ỷ dĩ thành dược liệu tiềm điều trị sỏi tiết niệu Đặt vấn đề Sỏi tiết niệu bệnh lý phổ biến, ảnh hưởng đến khoảng 12% dân số toàn cầu Cùng với phát triển y học đại, kỹ thuật ngoại khoa áp dụng điều trị để loại bỏ sỏi khỏi đường tiết niệu, nhiên phương pháp gây tai biến tỷ lệ tái phát cao [3], Thêm vào đó, chưa có thuốc hóa dược thực hiệu để điều trị sỏi tiết niệu, đặc biệt dự phòng tái phát sỏi Vì vậy, xu hướng sử dụng thuốc có nguồn gốc từ dược liệu điều trị sỏi tiết niệu ngày quan tâm Ý dĩ {Coix ỉachryma-jobi L.) loài địa Việt Nam sử dụng từ lâu y học cổ truyền với tác dụng bồi bổ thể, lợi tiểu, ừị phù thũng, tê thấp, tiểu tiện sỏi [ ] chưa nghiên cứu theo định hướng tác dụng điều trị sỏi tiết niệu Vì vậy, nghiên cứu thực với hai mục tiêu: (1) Đánh giá tác dụng ức chế sỏi tiết niệu in vitro in vivo dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ; (2) Phân lập hoạt chất có tác dụng ức chế sỏi tiết niệu từ thân Ý dĩ Nguyen liệu phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu Dược liệu Thân ý dĩ, thu hái Từ Liêm, Hà Nội vào tháng 10 năm 2011 Mau dược liệu Bùi Hồng Quang - Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật định tên khoa học Coix lachryma-Jobi L., họ lúa (Poaceae) Dịch chiết toàn phần thu phương pháp sắc với dung môi nước, cô đặc đến dạng cao lỏng 1:1 Các phân đoạn dịch chiết thu phương pháp chiết lỏng - lỏng với dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform, ethylacetat Hóa chất động vật Tất hóa chất sử dụng nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích Chuột cống trắng giống đực, chủng Wistar, khối lưọng 180 ± 20 g Học viện Quân Y cung cấp, nuôi điều kiện tiêu chuẩn Phương pháp nghiên cứu Đánh giá tác dụng ức chế tinh thể canxi oxalat in vitro thân Ỷ dĩ Đánh giá tác dụng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat in vitro dịch chiết toàn phần Ý dĩ đĩa 96 giếng Costar 3596 (Corning, Mỹ) theo phưoTig pháp mô tả Gohel Wong [4], Trên đĩa 96 giếng gồm có: giếng chứng, giếng natri citrat giếng thử cho tương ứng 160 ỊXÌ đung dịch nước tiểu nhân tạo, ịiì dung môi pha mẫu natri citrat dung dịch thử Tinh thể canxi oxalat tạo thành thêm 20 /xl dung dịch acid oxalic 0,04 N vào tất giếng Đo mật độ quang (OD) hệ thống máy ELISA bước sóng 620 nm thời điểm 30 phút sau phản ứng Tính tỷ lệ ức chế (%ƯC) quan sát hình ảnh tinh thể giếng kính hiển vi soi ngược vào thời điểm kết thúc thí nghiệm Đánh giá tác dụng ức chế sỏi canxi oxaỉat in vivo thân Ỷ d ĩ Đánh giá tác dụng ức chế hình thành sỏi canxi oxalat dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ mức liều 2,52 g/kg chuột cống trắng với mô hình gây sỏi thực nghiệm mô tả Karadi VR cộng [6 ] Tác nhân gây sỏi ethyl en glycol, bổ sung nước uống hàng ngày chuột nồng độ 0,75% vòng 28 ngày Quan sát tiêu mô bệnh học thận kính hiển vi phân cực, mồi tiêu quan sát 10 vi trường khác (x40), tính số đám sỏi trung bình/vi trưÒTig Phân lập hoạt chất có tác dụng Đánh giá khả ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat phân đoạn dịch chiết Ý dĩ đĩa 96 giếng Phân đoạn có tác dụng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat mạnh lựa chọn để phân lập chất, sử dụng phương pháp sắc ký cột phương pháp kết tinh lại cấu ừúc hóa học chất phân lập xác định phổ khối (MS) phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Tác dụng ức chế tinh thể canxi oxalat chất phân lập đánh giá phương pháp in vitro X lý số liệu Số liệu lưu trữ xử lý phần mềm SPSS 16.0 Tiến hành kiểm chuẩn trước xử lý số liệu theo phương pháp thống kê y học Sự khác biệt coi có ý nghĩa thống kê p < 0,05 Kết Tác dụng ức chế tinh thể canxi oxalat in vitro dịch chiết toàn phần Ý dĩ Dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ (YD) đánh giá tác dụng ức chế tinh thể canxi oxalat in vitro mức độ pha loãng khác nhau: 1/1, 1/4, 1/16, 1/64 Bảng 3.1 Tác dụng ức chế hình thành túứi thể canxi oxalat dịch chiết nước Ý dĩ Chú-ng (n=8) AOD %ư'c 0,31 ± 0,03 Citrat lOmM (n=8) Y D l/4 Y D l/1 Y D l/6 Y D l/1 (n=8) (n=8) (n=8) (n=8) 0,21 ± 0,02"* 33,1% 0,17 ±0,01** 0,29 ± 0,02’ 0,26± 0,02’* 0,23 ± 0,02’* 45,2% 4,9% 15,0% 26,1% * p < 0,05 so với chứng; ** p < 0,01 so với chứng Dịch chiết toàn phần Ý dĩ bắt đầu thể tác dụng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat độ pha loãng >1/64, tác dụng ức chế tăng dần theo nồng độ Tác dụng ức chế dịch chiết Ý dĩ tương tự chứng dương natri ciừat yếu hon so với natri citrat tất nồng độ thử Khi có mặt dịch chiết Ý dĩ, tinh thể canxi oxalat có xu hướng chuyển tìr dạng COM sang dạng COD So vói giếng có mặt naừi citrat, mật độ sỏi giếng có mặt dịch chiết Ý dĩ dày tỷ lệ COD/COM cao kích thước tinh thể COD nhỏ ' •• ù'/- ^ a b c Hình Hình ảnh tinh thể canxi oxalat tạo thành điều kiện chất thử (a), có natri citrat (b), có dịch chiết ý dĩ 1/1 (c) (x40) Tác dụng ức chế sỏi canxi oxalat in vỉvo dịch chiấ toàn phần Ỷ dĩ Sau tuần sử dụng hóa chất gây sỏi, hình thành sỏi thận nhận thấy rõ hầu hết chuột thuộc lô chứng bệnh so với lô chứng thưòng Dịch chiết nước Ý dĩ mửc liều 2,52 g/kg thể tác dụng ức chế hình thành sỏi thận, làm giảm rõ rệt sổ lượng đám sỏi lắng đọng thận so với lô chứng bệnh Không có khác biệt có ý nghĩa thống kê số lượng sỏi lô Ý dĩ lô chứng dương natri citrat + Chứng bệnh C liứng tb n N n tn ciu at 2.52g.1vg I Ýílĩ 2.52 g/kg Hình Số lượng đám sỏi tiêu mô bệnh học thận lô (n=8 ) * p < ,0 so với lô chứng thường, **p < ,0 so với lô chứng bệnh Trên hình ảnh tiêu mô thận, không quan sát thấy lắng đọng sỏi thận lô chứng thường Lô chứng bệnh có nhiều đáni sỏi kết tập vùng nhu mô (bao gồm vùng vỏ vùng tủy) vùng nhú ứiận Lô chứng dương natri citrat lô ý dĩ có vài đám sỏi nhỏ nằm rải rác vùng ; ị ■ '- - ' ¿ s k " '* *• , ’ * ' , m 2a 2b 2c 2d Hình 3, Hình ảnh tiêu mô bệnh học thận dưód kính hiển vi phân cực (H&E, X40) a: chứng thưòng, b: chứng bệnh, c: chứng dưomg, d: Ý dĩ; : vùng nhu mô, : vùng nhú Kết phân lập hoạt chất Lựa chọn phân đoạn ức chế tinh thể canxi oxalat mạnh Ba phân đoạn (PĐ) dịch chiết Ý dĩ n-hexan, chloroform, ethyl acetat đánh giá tác dụng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat nồng độ ,1 mg/ml cồn tuyệt đối để tìm phân đoạn có tác dụng ức chế mạnh Bảng Tác dụng ức chế tinh ứiể canxi oxalat phân đoạn dịch chiết Ý dĩ AOD %ưc PĐ chloroform PĐ ethyl acetat Chứng PĐ n-hexan (n=8) (n=8) (n=8) (n=8) 0,34 ± 0,03 0,35 ± 0,04 0,29 ± 0,04 12,8% 10,3% 25,6% 0,39±0,04 * p < 0,05 so với chứng Trong ba phân đoạn n-hexan, chloroform, ethyl acetat, có phân đoạn ethyl acetat có tác dụng ức chế tinh thể canxi oxalat rõ rệt, với tỷ lệ ức chế thời điểm 30 phút 25,6% Do đó, phân đoạn ethyl acetat lựa chọn để phân lập chất Phân lập chất từ phân đoạn ethyl acetat Sau chiết xuất phân đoạn từ kg dược liệu khô ban đầu thu 2,7 g cắn ethyl acetat, đem phân lập sắc ký cột silica gel (cỡ hạt 40 - 60 Ịj,m, Merck) với hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat (1:1) thu phân đoạn kí hiệu EAl, EA2, EA3, đó, phân đoạn EAl cho thấy có vết chất sắc ký đồ Tinh chế EAl phương pháp kết tinh lại thu 24 mg tinh thể hình kim màu trắng, ký hiệu YOl Phổ khối (MS) chất YOl có pic ion phân tử m/z 163 [M-H]' Khối lưọfng phân tử YOl 164 tưoTig ứng với công thức phân tử CgHgOa- Dựa liệu phổ IH-NMR, phổ 13C-NMR, phổ HMBC cho phép kết luận YOl acid (£)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-propenoic hay acid p-coumaric IH - NMR (500 MHz, MeOD) ô (ppm): 6,30 (IH, d, / = 16 Hz, H3); 6,82 (2H, dd, 8,5 Hz; 2Hz, H3’, H5’); 7,45 (2H, dd, / = 8,5 Hz; 2Hz, m \ H ’), 7,61 (IH, d, J = 16 Hz, H2) 13C - NMR (125 MHz, MeOD) ỗ (ppm): 115,6 (C2); 116,8 (C3’, C5’); 127,2 (cr), 131,1 (C2 ’, C ’); 146,7 (C3); 161,1 (C4’), 171,0 (Cl) Hình Công thức cấu tạo acid (£)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-propenoic Đánh giá tác dụng ức chế tinh thể canxi oxalat in vitro acidp-coumaric Acid p-coumaric pha cồn tuyệt đối nồng độ từ , - mM đánh giá tác dụng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat in vỉtro đĩa 96 giếng Kết thể hình 3.5 -> IC = 2,35 (1,47 - 3,10) mM - > I C o= , (8,29-11,16) mM ►-acid p-coiixiimic Hình 5, Tác dụng ức chế hình tinh thể canxi oxalat acid p-coumaric naừi citrat nồng độ thấp ( ImM), acid p-coumaric thể tác dụng ức chế hình thành tinh thể rõ rệt, tác dụng ức chế tăng dần theo nồng độ Phần trăm ức chế tối đa đạt 72,0% nồng độ 10 mM Tác dụng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat acid p-coumaric mạnh chứng dương natri citrat, với giá trị IC 50 2,35 mM (khoảng tin cậy 95%: 1,47 - 3,10) so với 9,61 mM (khoảng tin cậy 95%: 8,29 - 11,16) natri citrat Bàn luận Canxi oxalat thành phần phổ biến sỏi tiết niệu, chiếm khoảng 80% trưòng họp sỏi tiết niệu nói chung Quá trình hình thành sỏi canxi oxalat thể trải qua giai đoạn chính, bao gồm: bão hòa nước tiểu, tạo nhân tinh thể, lớn lên tinh thể, kết tập tinh thể gắn tinh thể vào tế bào biểu mô ống thận [2], Trên sở đó, áp dụng mô hình in vitro ỉn vivo phù họfp để đánh giá tác dụng ức chế hình thành sỏi canxi oxalat Ý dĩ Trên mô hình in vỉtro sử dụng đĩa 96 giếng, Ý dĩ thể tác dụng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat tăng dần theo nồng độ, đồng thời làm tăng số lượng tinh thể COD, giảm số lưọng tinh thể COM Điều giảm nguy lắng đọng sỏi thận COM dạng tinh thể dễ kết tập, dễ gắn với tế bào biểu mô ống thận, khó đào thải tinh thể COD [1], Khi so sánh với số nghiên cứu khác giới [4, 7], phương pháp in vitro áp dụng nghiên cứu có hạn chế chưa đánh giá tác dụng Ý dĩ lên giai đoạn trình hình thành tinh thể canxi oxalat nước tiểu Tuy nhiên, kết in vitro nghiên cứu mang tính sàng lọc, tạo sở để tiếp tục nghiên cứu tác dụng thuốc động vật thực nghiệm Gây sỏi chuột cống trắng ethylen glycol mô hình áp dụng rộng rãi giới để đánh giá tác dụng thuốc điều trị sỏi tiết niệu [6 ] Việt Nam, lần mô hình triển khai áp dụng Dịch chiết Ý dĩ mức liều 2,52 g/kg thể tác dụng ức chế hình thành sỏi thận sau 28 ngày điều trị tưcmg tự chứng dương natri citrat Tuy nhiên, natri citrat làm tăng đáng kể thể tích pH nước tiểu, Ý dĩ mức liều nghiên cứu không làm thay đổi thông số so sánh với lô chứng bệnh (số liệu phần kết quả) Điều cho thấy tác dụng ức chế hình thành sỏi tiết niệu Ý dĩ liều nghiên cứu không liên quan đến tác dụng lợi tiểu đề cập y văn [2], Như vậy, tác dụng Ý dĩ theo số chế sau; ức chế giai đoạn tạo nhân, lớn lên kết tập tinh thể; thay đổi dạng tinh thể ức chế gắn tinh thể vào tế bào biểu mô ống thận Từ phân đoạn ethyl acetat phân đoạn có tác dụng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat mạnh nhất, phân lập acid p-coumaric, acid hữu có mặt phổ biến thực vật phân lập từ hạt Ý dĩ [2] Một số nghiên cứu tác dụng sinh học acid p-coumaric cho thấy chất có tác dụng chống dị ứng, chống oxy hóa, chống ung thư [5, ] chưa đánh giá tác dụng sỏi tiết niệu nghiên cứu công bố Theo kết nghiên cứu này, acid p-coumaric có tác dụng ức chế mạnh hình thành tinh thể canxi oxalat tác dụng phụ thuộc nồng độ Như sơ kết luận acid p-coumaric thành phần có tác dụng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat thân Ý dĩ Tuy nhiên, nghiên cứu bước đầu, để phát triển Ý dĩ trở thành dược liệu tiềm điều trị dự phòng sỏi tiết niệu, cần cỏ phương pháp chuẩn hóa dược liệu đánh giá hiệu thông qua thử lâm sàng Kết luận Dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ thể tác dụng ức chế hình thành sỏi tiết niệu in vitro in vivo In vitro, tác dụng Ý dĩ tăng dần theo nồng độ với tác dụng ức chế tối đa đạt 33,1% dịch chiết 1/1; in vivo, Ý dĩ đường uống mức liều 2,52 g/kg làm giảm lắng đọng sỏi thận gây ethylen glycol tương tự chứng dưomg natri citrat Đã phân lập acid p-coumaric có tác dụng ức chế hình thành tinh thể canxi oxalat in vitro phụ thuộc nồng độ với giá trị IC50 2,35 mM Tài liệu tham khảo Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr.844-846 Chen H.J., et al.(2010), Mast cell dependent allergic responses are inhibited by ethanolic extract of adlay testa, Journal o f Agricultural and Food Chemistry, 58(4), pp 2596-2601 Coe Fredric L., et al Pathology and treatment of kidney stone, Medical progress, vol 327, pp 1141-1150 Gohel Wong s.p (2006), Chinese herbal medicines and their efficacy in treating renal stones, Urology Research, 34, pp 365-372 Jaganathan KS, et al (2013), Events associated with apoptotic effect of pCoumaric acid in HCT-15 colon cancer cells, World Journal Gastroenterol 21, pp.7726-7734 Karadi VR, et al (2006), Effect of Moringa oleífera Lam root-wood on ethylene glycol induced urolithiasis in rats, Journal o f Ethnopharmacology, 105, pp 306-311 M Beghalia, et al (2008), Inhibition of canxium oxalate monohydrate crystal growth using Algerian medicinal plants, Journal o f medicinal plants research, pp 66-70 Takahashi H., et al.(1999), Coumaroyl triterpenes from Casuarina equisetifolia, Phytochemmistry, 51, pp 543-550  ...toàn phần thân Ý dĩ; ( 2) Phân l p hoạt chất có tác dụng ức chế sỏi tiết niệu từ thân Ý dĩ Nguyen liệu phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu Dược liệu Thân ý dĩ, thu hái Từ Liêm, Hà Nội vào tháng 10... acetat l a chọn để phân l p chất Phân l p chất từ phân đoạn ethyl acetat Sau chiết xuất phân đoạn từ kg dược liệu khô ban đầu thu 2,7 g cắn ethyl acetat, đem phân l p sắc ký cột silica gel (cỡ... tiểu, Ý dĩ mức liều nghiên cứu không l m thay đổi thông số so sánh với l chứng bệnh (số liệu phần kết qu ) Điều cho thấy tác dụng ức chế hình thành sỏi tiết niệu Ý dĩ liều nghiên cứu không liên