Nghiên cứu định lương serotonin huyết tương sắc ký lỏng hiệu cao với detectơ huỳnh quang ChửThị Thanh Huyền*, Đặng Thị Ngọc Lan*, Nguyễn Thị Kiểu Anh*, Tạ Mạnh Hùng**, Kiều Công Thủy***, Vương Văn Tịnh***, Hoàng Thái Hòa**** *Trường Đại học Dược Hà Nội **Viện Kiểmnghiệm thuốc Trung ương ***Bệnh viện Tâmthân Trung ương I **** Bệnh viện Đa khoa Đức Giang - Hờ Nội SUMMARY A rapid, sensitive and accurate analytical method using HPLC-FLD has been validated for serotonin determination in human c plasma The following conditions were used: Luna Gemini 18e column (250 x 4.6 mm; ụm); mobile phase: methanol: 10 mM acetate buffer solution pH 4.0 (6:94, v/v); flow rate: 1.5 ml/min; injection volumes: 100 ịÁÌ and 20 fjL; excitation and emission wavelengths were set a t285 and345 nm, respectively The linear ranges were 1.02-10.2 ng/ml and 10.2-510 ng/ml with good correlation (r>0.999) The average recovery was 88 -100.4% The precision o f the analytical method was satisfied with R5D less than Ỉ 5% at three levels ofLQC, MQC and HOC The method can be applied to measure serotonin concentration in plasma o f depressed patients in order to improve therapeutic drug monitoring Từkhoá; serotonin, huyết tương, HPLC-FLD, nồng độ, bệnh nhân trâm cảm Đặt vấn đề Serotonin chất hóa học trung gian nội sinh quan trọng hệ thẩn kinh trung ương, có vai trò quan trọng sinh bệnh lý Người ta rối loạn trầm cảm hậu giảm nồng độ serotonin khe synap, kiểm soát nổng độ serotonin dịch sinh học cẩn thiết [1] Serotonin dịch sinh học định lượng HPLC với loại detectơ huỳnh quang [2], điện hóa [3], khối phổ [5], detectơ huỳnh quang hay sử dụng độ nhạy cao, đơn giản kinh tế Bài báo trình bày kết nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng serotonin huyết tương (HT) sắc ký lỏng hiệu cao với detectơ huỳnh quang (HPLC - FLD) bước đẩu ứng dụng xác định nồng độ serotonin HT bệnh nhân trầm cảm, tiến tới phục vụ công tác điểu trị Nguyên vật liệu, thiết bị phương pháp nghiên cứu Hóa chất - thuốc thử Natri acetat; acid percloric; Đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích - Acid acetic; methanol (MeOH): Dùng cho HPLC (Merck - Đức) - Chất đối chiếu serotonin hydrochloric! hàm lượng 98,0% (Sigma - Aldrich, Mỹ) - HT trắng (lựa chọn mẫu HT trắng có nổng độ serotonin thấp): Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương - Mẫu thử: HT người tình nguyện (NTN) khỏe mạnh bệnh nhân (BN) mắc bệnh trầm cảm điểu trị Bệnh viện Tâm thẩn Trung ương Itừtháng 11 năm 2009 đến tháng năm 2010 Thiết bị nghiên cứu - Hệ thống HPLC Shimadzu với detectơ huỳnh quang, phẩn mềm LC Solution 1.22 (Nhật) - Máy ly tâm lạnh Sartorius Sigma -16K (Đức) - Tủ lạnh sâu MDF -192 (Đức) - Máy lắc xoáy Labinco L46 (Hà Lan) Phương pháp nghiên cứu - Pha dung dịch chuẩn gốc serotonin: Cân xác chất đối chiếu serotonin hydrochloric! hòa tan hỗn hợp dung môi MeOH: nước (1:1) để dung dịch chuẩn gốc có nồng độ serotonin 255 |ig/ ml Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng MeOH thành dung dịch chuẩn thứ cấp có nổng độ từ 1,02 đến 510 ng/ml - Chuẩn bị mẫu để xây dựng phương pháp: Lấy ml dung dịch serotonin chuẩn có nổng độ xác định, cô dòng khí N2, hòa tan cắn 1000 |jl HT trắng Lắc xoáy phút - Xử lý mẫu: Lấy 1,00 ml HT (của NTN/ BN/ mẫu để xây dựng phương pháp), thêm 300 ^1 dung dịch acid percloric 14% Lắc xoáy phút, ly tâm 10000 vòng/phút phút Lấy dịch đem sắc ký - Điều kiện sắc ký: Cột sắc kí Luna Gemini C18e (250 X 4,6 mm, |am ); nhiệt độ cột: 40°C; pha động: MeOH - dung dịch đệm acetat 10 mM pH 4,0 (6 : 94); tốc độ dòng : 1,5 ml/phút; thể tích tiêm mẫu: 100 |jl 20 |jl; phát detectơ huỳnh quang với bước sóng kích thích phát xạ lẩn lượt 285 nm 345 nm Kết bàn luận Thẩm định phương pháp phân tích - Tính chọn lọc: Phân tích mẫu sau: Mẫu chuẩn; Dung dịch serotonin chuẩn nồng độ 51 ng/ml pha động Mẫu HT trắng, mẫu HT trắng thêm serotonin chuẩn: Xử lý mẫu theo qui trình Tiến hành sắc ký Kết trình bày hình Nhận xét: Kết hình cho thấy, pic serotonin có thời gian lưu khoảng 4,6 phút, pic gọn, cân đối, không bị xen phủ với pic khác (A) Trên sắc đổ mẫu HT trắng có pic nhỏ vị trí tương ứng với thời gian lưu serotonin serotonin chất nội sinh có HT (trong khoảng - phút) (B) Khi thêm chuẩn serotonin vào mẫu HT trắng pic ứng với thời gian lưu serotonin tăng lên (C) Do vậy, phương pháp phân tích có tính chon loc serotonin mV(x100) jDetectorA:Bc285tím,Bn:345nm 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 (A) 5.0 s.o í 2!s 5.0 (B) 7.5 10.0 m (C) a 0.0 (D) Hình V Sẵc kí đỗ (A) mẫu serotonin chuẩn nóng độ 51 ng/iĩìL: (B) mâu huyễt tương trổng: (Q mõu huỵét tương trổng thêm chuổn; (D) máu Hĩ bệnh nhân SŨU điểu trị Khoảng nồng độ tuyến tính: Trong mẫu Chuẩn bị hai dãy chuẩn HT trắng với HT trắng có lượng serotonin ban đẩu nên nổng độ thêm serotonin lẩn lượt 1,02 -10,2 ng/ tiến hành xây dựng phương pháp ml (đường chuẩn - thể tích tiêm mẫu 100 |jl) định lượng serotonin HT theo kỹ thuật 10.2 - 510 ng/ml (đường chuẩn -thể tích tiêm mẫu thêm đường chuẩn 20 |jl) Xử lý mẫu tiến hành sắc ký Kết Do nổng độ serotonin mẫu thực (HT NTN trình bày bảng khỏe mạnh nhóm đối chứng HT BN mắc bệnh Nhận xét: Kết bảng cho thấy có phụ trẩm cảm trước sau điều trị) có khác biệt lớn thuộc tuyến tính chặt chẽ diện tích pic nồng Để đáp ứng yêu cẩu thẩm (í nh phương pháp phân tích độ serotonin khoảng nổng độ khảo sát (1,02 thuốc dịch sinh học (r > 0,99), tiến hành 10.2 ng/ml 10,2 - 510 ng/ml) với hệ số tương quan xây dựng đường chuẩn để đảm bảo phân tích r đểu lớn 0,99 đáp ứng yêu cẩu qui định phân nồng độ serotonin tất mẫu thực tích thuốc dịch sinh học [4], Khoảng nồng độ Bảng 1: Kă quò kháo sát Iđioỏng nông độ tuyến tính serotonin huỵét tương Đường chuẩn Đường chuẩn Nồng độ (ng/mlj Diên tích pic (mv.giây) Nồng độ (ng/mlj Diện tích pỉc (mV.glây) 10,2 421127 1,02 559663 2,04 623480 51 1193975 3,06 668517 102 2067587 5,10 790573 204 3914091 7J4 919152 306 5647099 10,2 1088118 510 9431754 Hệ số tương quan: r = 0,9996 Phương trình hổi quy: y = 57842 x + 499589 Hệ sổ tương quan: r = 0,9999 Phương trình hổi qui: y= 17936 x + 242377 lựa chọn khảo sát ứng với khoảng nồng độ serotonin HT NTN khỏe mạnh bệnh nhân mắc bệnh trầm cảm Độ đúng, độ xác: Tiến hành xác định mức nồng độ (LQC, MQC, HQC) khoảng nồng độ tuyến tính Xác định độ xác độ cách thêm xác serotonin vào HT trắng mức nổng độ 2,04; 4,59 8,16 ng/ml (đối với đường chuẩn 1) 25,5; 255; 357 ng/ml (đối với đường chuẩn 2) Mỗi nổng độ làm song song mẫu Kết trình bày bảng Bảng 2: Két quà kháo sát độ đúng, độ xác Đường chuẩn Mẫu LQC (2,04ng/ml) MQC (4,59ng/ml) HQC (8,16ng/ml) Nồng độ (ng/mlj Độ (%) Đường chuẩn Trung bình (%) RSD(%) Mẫu Nồng đô (ng/ mlj Độ (%) 2,02 99,0 23,0 90,2 2,14 104,9 22,1 86,7 1,97 96,6 23,4 91,8 2,06 101,0 24,4 95,7 2,14 104,9 22,8 89,4 100,4 3,89 LQC2 (25,5 ng/ml) 1,96 96,1 23,7 92,9 3,97 86,5 234,0 91,8 4,49 97,8 234,8 92,1 4,07 88,7 237,7 93,2 4,25 92,6 232,7 91,3 100,1 92,2 5,24 MQC2 (255ng/ml) 4,50 98,0 255,2 4,12 89,8 244,9 96,0 7,19 88,1 361,6 101,3 7,17 87,9 358,1 100,3 7,05 86,4 7,16 87,7 6,98 7,53 351,5 98,5 361,1 101,1 85,5 356,1 99,7 92,3 355,6 99,6 88,0 2,64 HQC2 (357ng/ml) Trung bình (%) RSD(%) 91,1 3,41 94,1 3,62 100,1 1,06 Nhận xét: Độ xác với giá trị độ lệch chuẩn tương đối từ 1,06 đến 5,24% ( ... Trên sắc đổ mẫu HT trắng có pic nhỏ vị trí tương ứng với thời gian lưu serotonin serotonin chất nội sinh có HT (trong khoảng - phút) (B) Khi thêm chuẩn serotonin vào mẫu HT trắng pic ứng với thời... trắng với HT trắng có lượng serotonin ban đẩu nên nổng độ thêm serotonin lẩn lượt 1,02 -10,2 ng/ tiến hành xây dựng phương pháp ml (đường chuẩn - thể tích tiêm mẫu 100 |jl) định lượng serotonin. .. Từ kết thẩm định tính chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ xác, giới hạn