TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN TÍN TRỌNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN Aeromonas hydrophila PHÂN LẬP TỪ CÁ LÓC (Channa striata) BỊ BỆNH XUẤT HUYẾT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN Cần Thơ – 2011 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN TÍN TRỌNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN Aeromonas hydrophila PHÂN LẬP TỪ CÁ LÓC (Channa striata) BỊ BỆNH XUẤT HUYẾT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts PHẠM MINH ĐỨC Cần Thơ – 2011 LỜI CẢM TẠ Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn ñối với người thân gia ñình, Ba Mẹ ñã tạo ñiều kiện ñể cho học tập thực ñề tài tốt nghiệp Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñối với cán hướng dẫn: Ts Phạm Minh Đức ñã tận tâm dẫn, ñộng viên cho khuyên quý báu trình tiến hành thực ñề tài hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô Bộ môn Sinh học Bệnh Thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ ñã truyền ñạt kiến thức quan tâm giúp ñỡ trình thực ñề tài Đồng thời xin gởi lời cám ơn ñến anh chị môn, bạn lớp bệnh học thủy sản khóa 33, ñặc biệt cám ơn bạn Phan Vĩnh Thịnh, bạn Đoàn Nhật Tân lớp bệnh học thủy sản khóa 33 ñã nhiệt tình, quan tâm, giúp ñỡ suốt thời gian thực ñề tài Xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày tháng năm 2011 Sinh viên thực Nguyễn Tín Trọng i TÓT TẮT Đề tài: “Nghiên cứu khả gây bệnh vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá lóc (Channa striata) bị bệnh xuất huyết” ñược thực nhằm xác ñịnh LD50 Aeromonas hydrophyla gây bệnh cá lóc, làm tiền ñề cho nghiên cứu sau Chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophyla CĐ1012 dùng thí nghiệm ñược thu ao cá bệnh có biểu bệnh xuất huyết tách ñàn, bỏ ăn bơi lội lờ ñờ mặt nước, mắt lồi ñục, xuất huyết thân, vi xương nắp mang, cá bơi dạng xoắn, vẩy dễ bị rụng lấy ra, nuôi ao ñất huyện Cờ Đỏ, thành phố Cần Thơ Sau ñó, mẫu ñược phân lập, tách ròng phân tích phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học Bệnh Thủy sản, Khoa Thủy sảnTrường Đại học Cần Thơ Chủng vi khuẩn CĐ1012 thu ñược lần thu mẫu, ñược ñịnh danh phương pháp PCR xác ñịnh chủng Aeromonas hydrophyla Sau ñó, thí nghiệm cảm nhiễm ñược thực phương pháp tiêm chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophyla CĐ1012 lên cá lóc giống cỡ 20-25 g/con với mật ñộ vi khuẩn 3,67x104, 3,67x105, 3,67x106, 3,67x107 CFU/ml Sau 14 ngày tiêm, kết cho thấy tỉ lệ cá chết 100% mật ñộ 3,67x107 CFU/ml thấp 30% mật ñộ 3,67x104 CFU/ml Từ ñó xác ñịnh ñược giá trị LD50 1,16x106 CFU/ml Đa số cá chết ñều có dấu hiệu bệnh lý giống nhau, giống với dấu hiệu cá bệnh ñược thu mẫu ao nuôi Hai chủng vi khuẩn CT1107 CT1109 thu ñược sau gây cảm nhiễm tái ñịnh danh phương pháp PCR Aeromonas hydrophila ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ i TÓT TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu .1 1.2 Mục tiêu ñề tài .2 1.3 Nội dung ñề tài PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược cá lóc 2.2 Tình hình nuôi số bệnh thường gặp cá lóc ĐBSCL 2.3 Sơ lược kết nghiên cứu bệnh cá vi khuẩn Aeromonas 2.4 Một số nghiên cứu ñộc lực vi khuẩn Aeromonas hydrophila .8 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian ñịa ñiểm nghiên cứu 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Dụng cụ trang thiết bị 3.2.2 Hóa chất môi trường 3.3 Phương pháp nghiên cứu .9 3.3.1 Thu mẫu cá bệnh .9 3.3.2 Phân lập vi khuẩn 10 3.3.3 Định danh vi khuẩn .10 3.4 Thí nghiệm gây cảm nhiễm 10 3.4.1 Cá thí nghiệm 10 3.4.2 Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn 10 3.4.3 Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm 11 iii 3.4.4 Quan sát thu thập số liệu 12 3.5 Xử lý số liệu 13 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14 4.1 Dấu hiệu bệnh lý 14 4.2 Phân lập ñịnh danh vi khuẩn 14 4.3 Kết thí nghiệm gây cảm nhiễm 16 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 22 5.1 Kết luận .22 5.2 Đề xuất 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO 23 PHỤ LỤC 27 iv DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 4.1: Các tiêu vi khuẩn 15 Bảng 4.2: Thời gian cá bắt ñầu chết 18 Bảng 4.3: Các chủng vi khuẩn tái phân lập ñược cá gây cảm nhiễm 19 Bảng 4.4: Kết tiêu 12 chủng vi khuẩn tái phân lập cá gây cảm nhiễm 20 v DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1: Cá lóc môi trề, lóc bông, lóc ñen cá chành dục Hình 3.1: Hệ thống xô thí nghiệm gây cảm nhiễm 12 Hình 4.1: Cá lóc bệnh nuôi Cờ Đỏ 14 Hình 4.2: Chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila CĐ1012 phân lập cá lóc nuôi ao ñất 15 Hình 4.3: Kết ñịnh danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila 15 Hình 4.4: Cá bị xuất huyết sau gây cảm nhiễm 16 Hình 4.5: Biểu ñồ tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm 17 Hình 4.6: Chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila CT1107 phân lập cá gây cảm nhiễm 19 Hình 4.7: Kết tái ñịnh danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila 20 vi PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Thủy sản ngành có vai trò quan trọng ñem lại hiệu kinh tế ñáng kể cho ñất nước Trong ñó nuôi trồng thủy sản Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) chiếm 70% sản lượng nuôi trồng nước Theo báo cáo Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, sản lượng thủy sản năm 2010 ñạt 2.450,8 nghìn tấn, 107,6% so với kỳ năm 2009 Tính ñến quý ñầu tiên năm sản lượng thủy sản với kim ngạch 1,1 tỉ USD, tăng 22% so với kỳ Chỉ riêng tháng 3/2011, xuất thủy sản ước ñạt 400 triệu USD, sản lượng khai thác ñạt 600.000 tấn, tăng 2% so với kỳ (www.laodong.com.vn) Bên cạnh, cá tra ñối tượng có giá trị kinh tế cao cá lóc ñối tượng tương ñối dễ nuôi, chất lượng thịt ngon, ñược nuôi với nhiều mô hình khác (như nuôi ao ñất, ao nổi, mùng lồng bè) nuôi quy mô nhỏ ñể xóa ñói giảm nghèo nuôi thâm canh với mật ñộ cao (Lê Xuân Sinh Đỗ Minh Chung, 2009) Theo kết ñiều tra Dương Nhựt Long ctv (2003) cho biết sản lượng cá lóc nuôi năm 2002 toàn vùng ĐBSCL ñạt 5.294 tấn, sản lượng tập trung chủ yếu tỉnh: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ Kiên Giang Đến năm 2009 sản lượng cá lóc ñạt 40.000 tấn, tăng gần lần so với năm 2002 (Báo cáo tỉnh ĐBSCL, 2010) Sự tăng nhanh sản lượng ñạt ñược lợi nhuận cao nên người dân ñã mở rộng diện tích nuôi với mật ñộ cao Điều ñáng quan tâm kinh nghiệm người dân hạn chế, mà cụ thể việc quản lý nguồn nước Người dân thường thải trực tiếp lượng nước từ ao nuôi sông mà không qua xử lý Chính nguyên nhân ñã làm nguồn nước ngày ô nhiễm, tạo ñiều kiện thuận lợi cho tác nhân gây bệnh phát triển Trong thời gian gần ñây loài thủy sản nuôi khu vực ĐBSCL nhiễm bệnh quanh năm bệnh gan thận mủ, xuất huyết, bệnh ñẹn miệng, bệnh trắng da,… Theo Từ Thanh Dung (2005) tần số xuất ñộng vật thủy sản vi khuẩn chiếm tới 50,9% Theo ñiều tra Nguyễn Thanh Phương ctv (2007) số nông hộ nuôi cá tra ghi nhận bệnh xuất huyết xuất vào mùa lũ chiếm tới 88% Xuất phát từ nhu cầu phòng trị bệnh người nuôi, ñề tài “Nghiên cứu khả gây bệnh vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá lóc (Channa striata) bị bệnh xuất huyết” ñược thực 1.2 Mục tiêu ñề tài Nghiên cứu khả gây bệnh vi khuẩn Aeromonas hydrophila CĐ1012 cá lóc phương pháp gây cảm nhiễm nhằm góp phần cung cấp tài liệu cho nghiên cứu chuyên sâu bệnh vi khuẩn gây cá 1.3 Nội dung ñề tài - Phân lập ñịnh danh vi khuẩn cá lóc bị xuất huyết - Xác ñịnh LD50 vi khuẩn Aeromonas hydrophila CĐ1012 cá lóc ñiều kiện gây cảm nhiễm - Giếng M: Maker - Giếng 1: ĐC (-) Aeromonas hydrophila - Giếng 2: ĐC (+) Aeromonas hydrophila - Giếng 3: Mẫu CT1107 - Giếng 4: Mẫu CT1109 Từ kết tái ñịnh danh vi khuẩn phương pháp PCR vi khuẩn ta kết luận Aeromonas hydrophila tác nhân gây bệnh xuất huyết cá lóc gây cảm nhiễm Trong thí nghiệm gây cảm nhiễm Lý Thị Thanh Loan (2008) cá tra, kết thu mẫu phân lập cá gây cảm nhiễm có loài Aeromonas hydrophila Trước ñây, theo báo cáo Tanasomwang Saitanu (1979) ñã tìm thấy vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết nhiễm trùng máu cá basa nuôi bè gỗ Ngoài ra, số tác giả nhận ñịnh Aeromonas hydrophila tác nhân gây bệnh xuất huyết cá chép (Cyprinus carpio) cá trê trắng giống (Clarias batrachus) (Saitanu et al., 1982; Angka, 1990) 21 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Gây cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila cá lóc với tỉ lệ cá chết từ 30-100% mật ñộ từ 3,67x104-3,67x107 CFU/ml Giá trị LD50 = 1,16x106 CFU/ml Vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh cá lóc có dấu hiệu bệnh lý xuất huyết thân vi, bụng có nhiều ñốm ñỏ, vẩy dễ bị rụng lấy ra, mắt phù mờ ñục 5.2 Đề xuất Tiếp tục thí nghiệm cảm nhiễm chủng A hydrophila khác ñể tìm hiểu ñộc lực vi khuẩn cá lóc Ngoài ra, thực mô học lên nội quan: gan, thận tỳ tạng giai ñoạn gây cảm nhiễm nhằm làm rõ phá hủy mô học cá bị nhiễm bệnh Từ ñó, xác ñịnh khả xâm nhập vi khuẩn lên cá xác rõ rệt Tiến hành làm kháng sinh ñồ khảo sát tính kháng thuốc vi khuẩn A hydrophila cá lóc với nhiều loại thuốc kháng sinh nhiều vùng khác ñể có cách sử dụng hợp lý thuốc kháng sinh tránh ñược nhiều thiệt hại 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO Angka, S.L., 1990 The Pathology of the Walking catfish Clarias batrachus (L), infected intraperitoneally with Aeromonas hydrophila Asian Fish Sei 3: 343-351 Austin, B and D Austin, 1986 Bacterial fish pathogens disease in farmed and wild fish second edition Azad, A.K., D.R Stanford, S Sarkar, A.K Hopper, 2001 Role of the nuclear pools of aminoacyl - tRNA synthetases in tRNA nuclear export Mol Biol Cell 12: 1381-1392 Barrow, G.I and R.K.A Feltham, 1993 Cowan and Steel’s manual for the indentification of medical bacteria, third edition Cambridge University press Cambridge 331 pp Bartie, K., Đ.T.H Oanh, G Huy, C Dickson, M Cnockaert, J Swings, N.T Phương, A Teale, 2006 Tạp chí công nghệ sinh học (1): p31-40 Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, 2010 Báo cáo ñịnh kỳ hàng tháng (01/2008-7/2010) Bùi Quang Tề Vũ Thị Tám, 2000 Những bệnh thường gặp tôm cá biện pháp phòng trị Nhà xuất Nông nghiệp 79 trang Bùi Quang Tề, 2006 Bệnh học thủy sản Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản I, 164 trang Chi cục Thủy sản tỉnh An Giang, 2009 Sở Nông nghiệp Phát triển Nông thôn báo cáo kết ñiều tra thủy sản thời ñiểm 01-10 hàng năm diện tích sản lượng cá lóc Chi cục Thủy sản tỉnh Đồng Tháp, 2009 Báo cáo kết ñiều tra thống kê kinh tế kỹ thuật thủy sản tỉnh Đồng Tháp quý năm 2009 Chi cục Thủy sản tỉnh Hậu Giang, 2009 Báo cáo tổng kết tình hình sản xuất nuôi trồng thủy sản Citarasu, T., K Alfred Dhas, S Velmurugan, V Thanga Viji, T Kumaran, M Michael Babu and T Selvaraj, 2011 Isolation of Aeromonas hydrophila from infected ornamental fish hatchery during massive disease outbreak International Journal of Current Research 2: 037-041 Đỗ Thị Hòa Nguyễn Thị Muội, 2004 Giáo trình bệnh thủy sản NXB Nha Trang Đoàn Nhật Phương, 2001 Xác ñịnh LD50 thử nghiệm vaccine phòng bệnh vi khuẩn (Aeromonas hydrophila) cá chép (Cyprinus carpio) Luận văn Đại học Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ Đoàn Nhật Phương, Trần Cẩm Loan Phạm Thanh Hương, 2006 Ảnh hưởng vitamin C lên khả miễn dịch không ñặc hiệu cá tra 23 (Pangasianodon hypophthalmus) với vi khuẩn A hydrophila Đề tài cấp trường 2004-2005 Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ Dương Nhựt Long, 2003 Giáo trình kỹ thuật nuôi cá nước Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ Esteve, C., E.G Biosca and C Amaro, 1993 Virulence of A hydrophila and some other bacteria isolated from European eels Anguilla anguilla reared in fresh water In diseases of Aquatic organisms Vol 16: 15-20 Inglis, V., R.J Roberts and N.R Bromage, 1993 Bacterial disease of fish 196-210 Lê Xuân Sinh Đỗ Minh Chung, 2009 Khảo sát mô hình nuôi cá lóc (Channa micropeltes Channa striatus) ĐBSCL Kỷ yếu hội nghị khoa học thủy sản toàn quốc Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh: Trang 436-447 Lư Trí Tài, 2010 Tìm hiểu số tác nhân gây bệnh nuôi cá lóc (Channa striata) thâm canh Đồng Bằng Sông Cửu Long Luận văn Cao học Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ Lý Thị Thanh Loan, 2008 Hiện trạng môi trường bệnh cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ĐBSCL-giải pháp khắc phục Báo cáo tham luận hội nghị Giải pháp phát triển bền vững nghề nuôi chế biến cá tra ĐBSCL Mazumder, S., T Majumdar, S Datta, D Ghosh, A Chakraborty and R Goswami, 2007 Role of virulence plasmid of Aeromonas hydrophila in the pathogenesis of ulcerative disease syndrome in Clarias batrachus 44: 401-406 Ngô Minh Dung, 2007 Nghiên cứu khả gây bệnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila cá tra (Pangasius hypophthalmus) Luận văn Đại học Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ Ngô Thị Ngọc Thủy, 1998 Nghiên cứu số ñặc ñiểm sinh hóa Aeromonas hydrophila gây bệnh ñốm ñỏ cá trắm cỏ (Ctenopharyngodonidelus) chọn chủng chế vaccine phòng bệnh Luận văn Đại học Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ Nguyễn Tấn Đạt, 2002 Khảo sát bệnh ký sinh trùng vi khuẩn tôm xanh nuôi ao ruộng lúa mật ñộ thấp Luận văn Đại học Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ Nguyễn Thanh Phương, T.T.T Hoa, V.N Út, H.T Giang, C.T Anh, N.T.T.Hằng, P.T.N Thảo, Đ.T.M Thy N.T.T Thảo, Đ.T.H Oanh, N.M Hậu, N.Q Thịnh Đ.N Phương, 2007 Quan trắc môi trường xác ñịnh tác nhân gây bệnh cá da trơn (Pangasianodon hypophthalmus Pangasius bocourti) tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) tỉnh An Giang 24 Nguyễn Thị Diệp Thúy, 2010 Phân tích số tiêu kinh tế-kỹ thuật mô hình nuôi cá lóc ĐBSCL Luận văn Cao học Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ Nguyễn Thị Như Ngọc, 1997 Xác ñịnh tác nhân vi khuẩn gây bệnh tuột nhớt cá bống tượng (Oxyeleotris marmoratus, Bleeker) Luận văn Đại học Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ Nguyễn Thị Thu Hằng Phạm Minh Đức, 2009 Giáo trình bệnh truyền nhiễm 1: Nấm Ký sinh trùng ñộng vật Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ, 147 trang Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005 Sưu tầm thiết lập hệ thống lưu trữ loại vi khuẩn phân lập tôm cá Khoa Thủy sản-Trường Đại học Cần Thơ Báo cáo khoa học Đại học Cần Thơ-Bộ Giáo Dục Đào Tạo Panangala, V.S., C.A Shoemaker, V.L Van Santan, K Dybvig and P.H Klesius, 2007 Multiplex-PCR for simultaneous detection of three fishpathogenic bacteria, E ictaluri, F columnare and A hydrophila Diseases of aquatic organisms 74: 199-208 Phạm Đăng Phương, 2010 Khảo sát tình hình quản lý môi trường sức khỏe cá lóc nuôi ĐBSCL Luận văn Cao học Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ Phạm Thanh Liêm, Ambok Bolong Abol-Munafi, Mohd Azni Ambak, Siti Shapor Siraj Đoàn Nhật Phương Khả kháng bệnh cá trê lai (Clarias macrocephalus x C gariepinus) hệ F1 lai sau F1 với vi khuẩn Aeromonas hydrophila Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ 2008 (1): trang 195-203 Rahman, M.H., S Suzuki and Kawai, 2000 The effect of temperature on Aeromonas hydrophila infection in goldfish Carassius auratus Rahman, M.H., S Yesmin, M Afzal Hussain, A.R Khan, F Pervin and M.A Hossain, 2004 Aeromonas hydrophila Infection in Fish of Swamps in Bangladesh Pakistan Journal of Biological Sciences 3: 409-411 Reed, L J and H Muench, 1938 A simple method of estimating fifty percent end points American Journal of Hygiene 27: 493-497 Roselynn, M and W Stevenson, 1988 Vaccination against Aeromonas hydrophila In Fish Vaccination 9: 112-113 Saitanu, K., S Wongsawang and K Poonsuk, 1982 Red sore disease in carp (Cyprinus carpio) In Asian Fish Health Bioliography and Abstracts I: Southeast Asia Fish Health Section Asian Fisheries Society Manila, Philippines, 1992 Animal Dis 3: 79-86 Tanasomwan, V and K Saitanu, 1979 Ulcer disease in strided catfish Animal In Asian Fish Health Biblography and Abstracts I: Southeast Asia Fish Health Section Asian Fisheries Society Manila, Philippines, 1992 Dis 2: p 131-133 25 Thune, R.L., Graham, T.E., Riddle, L.M and Amborski, R.L, 1982 Extracellular proteases from Aeromonas hydrophila : Partial purification and effects on age-0 channel catfish Trans Am Soc., 111: 749-754 Trương Thủ Khoa Trần Thị Thu Hương, 1993 Định loại cá nước vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ Từ Thanh Dung, 2005 Bài giảng bệnh học thủy sản Ventura, M.T and J.M Grizzle, 1987 Evaluation of portals of entry of Aeromonas hydrophila in channel catfish Aquaculture 65: 205-214 www.laodong.com.vn/Tin-Tuc/Xuat-khau-thuy-san-2011-Tang-san-luongrong-thi-truong/39299 Xuất Thủy sản 2011: Tăng sản lượng-rộng thị trường Đăng ngày: 13/04/2011, truy cập: 29/05/2011 26 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phiếu thu mẫu cá bệnh Ngày thu mẫu: Họ tên chủ hộ: ……………………………….; Điện thoại: ……………… Địa chỉ: Tuổi hay cỡ cá: ……………………….; Trọng lượng (g): Diện tích ao (m2): ; Chiều sâu (m): Mật ñộ thả nuôi (con/m2): ; Nguồn giống: Ngày thả cá: Cải tạo ao: ; Hóa chất cải tạo (liều lượng): Loại thức ăn: Số lần cho ăn: ; Nguồn nước: Các tiêu môi trường: nhiệt ñộ: ;pH: ;N-NH4+: ;N-NO2-: ;N-NO3-: Màu nước ao: Có thay nước hay không: .; Thời gian thay nước: Ngày xuất bệnh: Số cá chết hàng ngày: Dấu hiệu bệnh lý Bên Hoạt ñộng bơi lội: Màu sắc thể: Vết thương da: Tập tính bắt mồi: Dấu hiệu khác: Bên Có dịch bên thể: Màu sắc hình dạng gan, thận, tỵ tạng: Màu sắc hình dạng quan: 27 Dấu hiệu khác: Loại thuốc phòng trị, liều lượng: Hiệu ñiều trị: 28 Phụ lục 2: Chỉ tiêu xác ñịnh giống vi khuẩn Aeromonas (Barrow Feltham, 1993) Hình dạng khuẩn lạc Gram Di ñộng Oxidase Catalase O/F Glucose O/129 Dạng tròn, màu vàng, lồi, nhẵn + + + + - 29 Phụ lục 3: Phương pháp thực số tiêu sinh lý sinh hóa vi khuẩn Quan sát hình dạng màu sắc khuẩn lạc Các chủng vi khuẩn ñược cấy môi trường thạch TSA, ủ 28°C sau 24 tiến hành quan sát hình dạng màu sắc khuẩn lạc ghi nhận kết sau: khuẩn lạc có dạng tròn, lồi, nhẵn có màu vàng môi trường TSA Nhuộm Gram Cho giọt nước cất lên lame, dùng que cấy triệt trùng lấy khuẩn lạc trãi ñều lên giọt nước Để mẫu khô tự nhiên Hơ lướt lame lên ñèn cồn ñể cố ñịnh vi khuẩn Nhuộm Crystal violet (dung dịch 1) lên lame khoảng phút, rửa lame nước cất ñể lame hết màu tím Để lame khô nhiệt ñộ phòng Nhuộm Iodine (dung dịch 2) phút, rửa lame nước cất Rửa lame dung dịch Cồn : acetone (dung dịch 3) ñể tẩy màu, rửa lame khoảng giây Rửa lame lại nước cất ñể khô nhiệt ñộ phòng Nhuộm Safranin (dung dịch 4) khoảng phút, rửa lại nước ñể khô tự nhiên Quan sát lame kính hiển vi quang học vật kính 100X có giọt dầu Ghi nhận: vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn Tính di ñộng (phương pháp giọt treo) Cho Vaseline lên góc lamelle ñặt ngửa lamelle lên bàn Dùng pipet tiệt trùng nhỏ giọt nước muối sinh lý lên lamelle Tiệt trùng que cấy, lấy khuẩn lạc hòa tan vào giọt nước muối lamelle Dùng lame ñặt nhẹ nhàng lên lamelle cho lame không chạm vào giọt nước muối sinh lý chứa vi khuẩn Cẩn thận lật thật nhanh lame ñể giọt nước ñược treo ngược lamelle Đặt lame lên kính hiển vi, quan sát ñược vi khuẩn di ñộng vật kính 40X Phản ứng Oxidase Dùng que cấy tiệt trùng lấy vi khuẩn ñĩa lên que thử Oxidase Quan sát que thử 30 giây que thử chuyển màu xanh ñậm hay tím ñậm cho phản ứng Oxidase dương tính (+) không chuyển màu âm tính (-) Phản ứng Catalase Nhỏ giột dung dịch H2O2 3% lên lame Dùng que cấy tiệt trùng lấy vi khuẩn cho vào dung dịch H2O2 3% Phản ứng Catalase dương tính (+) có tượng sủi bọt, Catalase âm tính (-) không sủi bọt 30 Khả lên men oxy hóa ñường glucose (O-F test) Chuẩn bị môi trường O/F Môi trường O/F trước tiên ñược ñun bếp từ khuấy cho tan hoàn toàn Tiệt trùng 121°C 15 phút, ñể nguội khoảng 45°C Thêm 1% glucose nguyên chất tiệt trùng vào Cho ml - ml môi trường vào ống nghiệm Chuẩn bị ống nghiệm chứa môi trường O/F ñã tiệt trùng Dùng que cấy tiệt trùng lấy vi khuẩn ñĩa agar cấy thẳng vào ống nghiệm chứa môi trường O/F, sau ñó phủ 0,5-1 ml dầu paraffin tiệt trùng vào ống nghiệm tạo ñiều kiện yếm khí (F), ống lại kiểm tra tính hiếu khí vi khuẩn (O) Để ống nghiệm vào tủ ấm 28-30°C Đọc kết quả: sau 1-7 ngày Lên men (F): (+) ống có phủ paraffin chuyển sang màu vàng Oxidation (O): (+) ống không phủ paraffin chuyển sang màu vàng Phản ứng O/129 Test dùng ñể phân biệt nhóm vi khuẩn Aeromonas Vibrio Vi khuẩn Aeromonas kháng (âm tính) Vibrio nhạy cảm (dương tính) với hợp chất Các bước thực hiện: - Dùng que cấy tiệt trùng lấy vi khuẩn cho vào ống nghiệm lấy nước muối sinh lý tiệt trùng lấy nhẹ Dùng pipet tiệt trùng hút vi khuẩn ống nghiệm cho giọt lên ñĩa agar Dùng que trải thủy tinh trải ñều vi khuẩn ñĩa agar Đậy nấp ñĩa ñể khoảng phút Dán ñĩa giấy tẩm O/129 nồng ñộ 10 µg 150 µg lên ñĩa agar Ủ tủ ấm 28 - 30°C ñọc kết sau 24 Kết quả: Vi khuẩn mẫn cảm với O/129 tạo nên vòng tròn vô trùng ≥ 15 mm quanh ñĩa tẩm O/129 Môi trường dinh dưỡng dùng ñể test O/129 phải có nồng ñộ muối thích hợp cho vi khuẩn Vibrio phát triển, thông thường sử dụng môi trường TSA NA + 1,5 NaCl 31 Phụ lục 4: Định danh vi khuẩn phương pháp PCR vi khuẩn Chiết tách acid nucleic (Theo Bartie et al., 2006) - Nuôi tăng sinh vi khuẩn (16-18 giờ) ml LB - Rút 750 µl dung dịch vi khuẩn 100 µl TE (10 mM Tris HCl mM EDTA) vào ống eppendorf - Đun 95°C vòng 15 phút - Làm lạnh nước ñá - Ly tâm 14000 vòng/ phút phút Rút phần dung dịch cho vào ống eppendorf (trữ -20°C chưa sử dụng) Phương pháp ño hàm lượng - Hàm lượng ADN mẫu ñược xác ñịnh máy so màu quang phổ sử dụng bước sóng 260 nm 280 nm - Đầu tiên, sử dụng 500 µl nước cất ñể tạo mẫu blank - Sau ñó ño hàm lượng ADN mẫu với 500 µl dung dịch ADN ly trích (pha loãng 100 lần, µl ADN + 495 µl nước cất) nhấn nút ño ñể ñọc số máy Khi có kết ta tính toán hàm lượng ADN theo công thức: AND (µg/ml) = Giá trị ño 260 nm x 50 x ñộ pha loãng Qui trình PCR phát A hydrophila (theo Panangala et al (2007) có chỉnh sửa) Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch ñại quy trình PCR phát A hydrophyla Hóa chất/ dung dịch Nước cất PCR Buffer MgCl2 dNTPs Đoạn mồi (Aero Fd) Đoạn mồi (Aero Rs) Taq DNA polymerasa ADN mẫu Tổng cộng Hàm lượng 1X 1,5 mM 200 µM 0,4 µM 0,4 µM 2,5 UI 20 ng 25 µl Chu kỳ nhiệt 95°C phút 95°C 30 giây 32 Thể tích (µL) 54,4 4,8 1,6 3,2 3,2 1,6 µl 24 µl 58°C 45 giây 72°C 30 giây 72°C 10 phút Điện di Quá trình ñiện di ñược thực với dung dịch TAE 0,5X thạch chứa 1,5% agarose Đun nóng dung dịch agarose tan hoàn toàn lò vi sóng Sau ñó, ñể dung dịch nguội khoảng 50-60°C cho Ethidium bromide vào lắc ñều ñổ agarose vào khay Thể tích gel tùy thuộc vào kích cỡ khay ñựng gel Độ dày gel cần cao ñáy lược gel khoảng 0,3-0,5 cm bề dày gel không 0,8 cm Cho gel vào bồn ñiện di Thêm dung dịch ñiện di cho vừa bao phủ gel Sử dụng thang DNA cho gel ñể xác ñịnh khối lượng phân tử sản phẩm PCR Dùng pipet hút 8-10 µl cho mẫu cần phân tích trộn với giọt dung dịch nạp mẫu (loading dye 6X) vào giếng Khi ñã cho mẫu cần phân tích vào giếng lại, nối bồn ñiện di với nguồn ñiện ñể chạy Sử dụng dòng ñiện 100-150 V (không vượt qua 150 V) ñể chạy gel Ngừng ñiện di màu xanh ñậm di chuyển khoảng 1/2-2/3 gel Sau ñó tiến hành ñọc kết Đọc kết Kết ñiện di ñược ghi nhận máy ñọc gel Vilber Lourmat (Pháp) Căn vào thang DNA kb plus ñể xác ñịnh trọng lượng phân tử Sản phẩm khuếch ñại ñặc hiệu vạch vị trí 209 bp 33 Phụ lục 5: Các chủng vi khuẩn ñược phân lập mẫu cá Ngày thu Số mẫu cá 01/11/2010 23/11/2010 08/12/2010 21/12/2010 Dấu hiệu Có ñốm xuất huyết thân, vây, quanh miệng, lưỡi, xuất vết loét ăn xâu vào cơ, bụng chướng to Gan bầm ñen, thận bóng bị xuất huyết Có ñốm xuất huyết thân, có vết loét ăn xâu vào Thân bị xuất huyết có nhiều vết loét, xoang bụng chứa dịch nội tạng bị hoại tử 34 Chủng vi khuẩn Ghi ĐT1001 Thận CĐ1011 Gan CĐ1012 Gan CĐ1013 Thận Phụ lục 6: Bảng theo dõi số lượng cá chết hàng ngày thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn A hydrophila Mật ñộ vi khuẩn tiêm từ 3,67x104, 3,67x105, 3,67x106, 3,67x107 CFU/ml 104 Bể Số cá 15 Ngày 1 Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 10 Ngày 11 Ngày 12 Ngày 13 Ngày 14 105 15 1 3 3 4 4 15 1 4 6 6 106 15 1 2 3 5 5 15 3 5 7 8 10 35 107 15 1 2 3 6 15 2 5 11 12 14 15 15 0,85% NaCl 15 1 4 6 10 11 13 13 15 15 15 0 0 0 1 1 1 15 0 0 0 0 1 1 1 Không tiêm 15 0 0 0 0 0 0 0 [...]... trường, cách quản lý chăm sóc hoặc là do một loại vi khuẩn khác gây ra Hơn nữa vai trò của vi khuẩn chỉ ñược công nhận khi nó luôn ñược phân lập từ cá bệnh ñó và trong gây cảm nhiễm thực nghiệm Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể của ký chủ tạo nên sự nhiễm bệnh hay không, ở mức ñộ nào là còn tùy thuộc vào khả năng gây bệnh của vi khuẩn ấy Kết quả tái phân lập trên cá gây cảm nhiễm ñược 12 chủng vi khuẩn (Bảng... bể Cá xuất huyết ở bụng, mắt, gốc vi ngực, vây lưng và cuốn ñuôi Khi giải phẫu thì thận bị sưng và xuất huyết Trong thí nghiệm gây cảm nhiễm của Lý Thị Thanh Loan (2008) thì cá tra sau khi gây cảm nhiễm với A hydrophila có biểu hiện xuất huyết trên thận, hậu môn sưng ñỏ và các tia vây xuất huyết A B Hình 4.4: Cá bị xuất huyết sau khi gây cảm nhiễm (A) Cá bị ñốm xuất huyết, (B) Nội tạng bị xuất huyết. .. 2005) Vi khuẩn Aeromonas sp di ñộng gây bệnh trên nhiều loài thủy sản nước ngọt Ở Vi t Nam, các loài cá nuôi lồng, bè và ao nước ngọt thường gặp bệnh ñốm ñỏ như cá lóc, cá trắm cỏ, cá trôi, cá chép, cá basa,… bệnh ñỏ chân ở ếch, ñốm nâu ở tôm càng xanh (Bùi Quang Tề, 2006) Theo kết quả nghiên cứu của Lư Trí Tài (2010) cho thấy vi khuẩn Aeromonas phân lập trên cá lóc nuôi ao ở An Giang và Đồng Tháp bị bệnh. .. chết ñược giải phẫu và tái phân lập vi khuẩn ở gan và thận của cá Vi c tái phân lập và ñịnh danh vi khuẩn là hết sức cần thiết ñối với lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng Nó giúp xác ñịnh chính xác tác nhân gây bệnh ñể chắc chắn rằng vi khuẩn phân lập ñược là chủng vi khuẩn ban ñầu ñem gây cảm nhiễm Bởi vì tỉ lệ chết biểu hiện bệnh chưa hẳn xác ñịnh là do vi khuẩn ñem gây cảm nhiễm gây ra mà còn do nhiều yếu... VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Gây cảm nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên cá lóc với tỉ lệ cá chết từ 30-100% ở mật ñộ từ 3,67x104-3,67x107 CFU/ml Giá trị LD50 = 1,16x106 CFU/ml Vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá lóc có dấu hiệu bệnh lý như xuất huyết trên thân và các vi, trên bụng có nhiều ñốm ñỏ, vẩy dễ bị rụng khi lấy ra, mắt phù và mờ ñục 5.2 Đề xuất Tiếp tục thí nghiệm cảm nhiễm các chủng... cá lóc: bệnh xuất huyết (50,7%), bệnh ký sinh trùng (49,6%), bệnh ghẻ lở (hay còn gọi là bệnh lở loét) (19,5%), bệnh gan thận mủ (13,3%), bệnh ñẹn họng (ñỏ xoang miệng) (15%), bệnh chướng hơi sình bụng (8,8%) và bệnh nấm trên thân cá (3,5%) 2.3 Sơ lược kết quả nghiên cứu bệnh cá do vi khuẩn Aeromonas Dấu hiệu bệnh lý Đặc ñiểm do Aeromonas gây ra làm cho ñộng vật mắc bệnh xuất huyết, hình thành các...PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về cá lóc Theo Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993), ở Đồng Bằng Sông Cửu Long có 4 loài cá lóc: cá lóc ñen (Channa striata), cá lóc bông (Channa micropletes), cá dầy (Channa lucius) và cá chành dục (Channa gachua) Hình 2.1: Cá lóc môi trề, lóc bông, lóc ñen và cá chành dục (Nguồn: Dương Nhựt Long, 2003) Cá lóc phân bố rộng từ Trung Quốc ñến Vi t Nam, Campuchia,... chủng A hydrophila khác nhau ñể tìm hiểu ñộc lực của vi khuẩn này trên cá lóc Ngoài ra, thực hiện mô học lên các nội quan: gan, thận và tỳ tạng ở các giai ñoạn khi gây cảm nhiễm nhằm làm rõ sự phá hủy mô học trên cá khi bị nhiễm bệnh Từ ñó, xác ñịnh khả năng xâm nhập của vi khuẩn lên cá chính xác và rõ rệt hơn Tiến hành làm kháng sinh ñồ và khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn A hydrophila trên cá lóc. .. ñục, xuất huyết ở các vây và xương nắp mang, cá bơi dạng xoắn Giải phẫu bên trong các cơ quan nội tạng của cá thấy thận xuất huyết, gan nhợt nhạt (Hình 4.4) Dấu hiệu bệnh lý của cá sau khi gây cảm nhiễm cũng giống như dấu hiệu bệnh lý của cá bị xuất huyết nuôi ở vèo trong ao ñất mà ta quan sát ñược Theo Đoàn Nhật Phương và ctv (2006) tiến hành gây cảm nhiễm vi khuẩn A hydrophila trên cá tra thì ña số cá. .. 1: ĐC (-) Aeromonas hydrophila - Giếng 2: ĐC (+) Aeromonas hydrophila - Giếng 3: Mẫu CT1107 - Giếng 4: Mẫu CT1109 Từ kết quả tái ñịnh danh vi khuẩn bằng phương pháp PCR vi khuẩn ta có thể kết luận Aeromonas hydrophila là tác nhân chính gây bệnh xuất huyết trên cá lóc gây cảm nhiễm Trong thí nghiệm gây cảm nhiễm của Lý Thị Thanh Loan (2008) trên cá tra, kết quả thu mẫu và phân lập trên cá gây cảm nhiễm ... TRỌNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN Aeromonas hydrophila PHÂN LẬP TỪ CÁ LÓC (Channa striata) BỊ BỆNH XUẤT HUYẾT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH... cho nghiên cứu chuyên sâu bệnh vi khuẩn gây cá 1.3 Nội dung ñề tài - Phân lập ñịnh danh vi khuẩn cá lóc bị xuất huyết - Xác ñịnh LD50 vi khuẩn Aeromonas hydrophila CĐ1012 cá lóc ñiều kiện gây. .. nuôi cá tra ghi nhận bệnh xuất huyết xuất vào mùa lũ chiếm tới 88% Xuất phát từ nhu cầu phòng trị bệnh người nuôi, ñề tài Nghiên cứu khả gây bệnh vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá lóc