M CL C Trang Trang ph bìa M cl c Danh m c ch vi t t t Danh m c b ng Danh m c hình v L IM U NG 1: T NG QUAN TÀI LI U CH 1.1 Gi i thi u v ch t mang cellulose vi khu n (BC) 1.1.1 Khái quát chung v BC 1.1.2 Nguyên li u s n xu t BC 10 1.2 Gi i thi u v vi khu n ST LB 13 1.2.1 c m hình thái c a vi khu n Streptococcus thermophillus Lactobacillus bulgaricus 13 c m sinh lý, sinh hóa c a Streptococcus thermophillus 1.2.2 Lactobacillus bulgaricus 14 ng pháp b o qu n vi sinh v t 15 1.3 Các ph 1.3.1 Ph ng pháp c y chuy n b o qu n l nh 15 1.3.3 Ph ng pháp b o qu n l nh sâu 16 1.4 Tình hình nghiên c u vƠ c đ nh vi khu n ch t mang BC vƠ ngoƠi n c 18 CH NG 2: 2.1 it IT NG VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 20 ng nghiên c u 20 2.1.1 Nguyên li u hóa ch t 20 2.1.2 D ng c thi t b th 2.2 Ph ng pháp nghiên c u 21 2.2.1 Ph ph ng dùng 20 ng pháp c đ nh vi khu n ST LT ch t mang BC b ng ng pháp b y – h p ph 21 2.2.2 Ph ng pháp vi sinh 21 2.2.3 Ph ng pháp hóa sinh 25 2.2.4 Ph ng pháp phân tích hóa h c 26 2.2.5 Ph 2.3 Ph ng pháp b o qu n vi khu n đ c c đ nh ch t mang BC 26 ng pháp công ngh 27 2.3.1 Lên men s a chua 27 2.3.2 Lên men t o cellulose 27 2.4 Ph ng pháp b o qu n vi khu n đ 2.5 Ph ng pháp x lý s li u 29 CH c c đ nh ch t mang BC 28 NG 3: K T QU VÀ TH O LU N 30 3.1 K t qu phơn l p ST LT t s a chua vinamilk 30 3.2 Kh o sát s sinh tr ng vƠ phát tri n c a vi khu n ST LT b ng ph ng pháp đo m t đ quang (OD) máy quang ph UV ậ Vis 32 3.3 K t qu thu nh n BC 34 3.3.1 Thu nh n BC t t môi tr ng nuôi c y 34 3.3.2 X lý BC 36 3.4 C đ nh ST LT ch t mang BC 36 3.4.1 Ngâm BC 36 3.4.2 Kh o sát nhi t đ th i gian 37 3.4.3 Ki m tra hi u qu c a trình c đ nh giá th BC 40 3.5 Xác đ nh hi u qu c đ nh vi khu n lactic ch t mang BC sau th i gian b o qu n 42 3.5.1 Xác đ nh kh n ng s ng sót c a vi khu n lactic đ c c đ nh ch t mang BC sau m c th i gian b o qu n 42 3.5.2 Xác đ nh ho t l c vi khu n lactic c đ nh ch t mang BC sau m c th i gian b o qu n 43 3.6 ánh giá ph s ph ng pháp b o qu n vi khu n lactic ch t mang BC so v i m t ng pháp khác 44 K T LU N VÀ KI N NGH 46 TÀI LI U THAM KH O 48 PH L C DANH M C CH VI T T T STT Ký hi u Tên đ y d BC Bacterial cellulose ST Streptococcus thermophillus LB Lactobacillus bulgaricus AX Acetobacter xylinum DANH M C B NG STT S hi u 1.1 3.1 Tên B ng C u trúc BC m t s loƠi vi khu n c m khu n l c vƠ hình thái t bƠo c a vi khu n LB ST Trang 31 DANH M C HỊNH S STT hi u Tên hình Trang 1.1 1.2 S đ đ 1.3 MƠng BC 1.4 C u t o c a AX đ 1.5 Quy trình s n xu t th ch d a 12 1.6 TrƠ túi l c lipton 13 1.7 1.8 Streptococcus thermophillus 14 1.9 Lactobaccillus bulgaricus 14 10 1.10 11 1.11 B o qu n l nh 16 12 2.1 S đ phơn l p hai ch ng vi khu n ST LB 24 13 2.2 S đ quy trình công ngh s n xu t s a chua 28 14 3.1 16 3.2 Khu n l c vi khu n ST (1) LB (2) đư thu n t 31 17 3.3 Hình nh ng gi ng c a ch ng ST 32 18 3.4 Hình nh ng gi ng c a ch ng LB 32 19 3.5 20 3.6 Thu nh n BC 21 3.7 Kh i l 22 3.8 BC sau s y 36 23 3.9 BC tr 37 24 3.10 Ch ph m vi khu n lactic BC C u trúc cellulose (a) c a vi khu n (BC) (  20000 l n) vƠ (b) c a th c v t (PC) (  200 l n) ng t ng h p cellulose b i AX t đ c g b t môi tr ng nuôi c y c bao b c b i cellulose ng saccharose 10 11 13 ông khô vi khu n 16 Khu n l c h n h p hai vi khu n ST LB t s a chua vinamilk th bi u di n đ ng cong sinh tr ng c a ch ng LB ST 72 gi t t môi tr ng BC t o thƠnh ng nuôi c y m c th i gian c ngơm (1) vƠ sau ngơm d ch vi khu n (2) 30 33 35 35 38 Kh n ng s ng sót c a ch ph m vi khu n lactic ch t 25 3.11 26 3.12 Khu n l c c a ch ph m ST (1) LB (2) sau ho t hóa 40 27 3.13 Kh n ng sinh acid lactic c a m u vƠ m u th bi u di n kh n ng s ng sót c a vi khu n lactic 41 28 3.14 ch t mang BC sau m c th i gian b o qu n lƠ 43 mang BC 39 tháng vƠ 2,5 tháng 29 3.15 Kh n ng sinh acid lactic c a ch ph m vi khu n lactic qua m c th i gian b o qu n 44 án t ng h p GVHD: ThS Ngô Th Minh Ph - 1- L IM Hi n k thu t c đ nh t bƠo đ ng U c đ c p vƠ quan tơm r t nhi u, đ c bi t trình b o qu n, l u thông, cung c p gi ng cho l nh v c lên men t o s n ph m th c ph m T bƠo c đ nh có nhi u u m so v i t bƠo t do: Ti n l i vi c b o qu n, l u thông vƠ giúp gi m chi phí giai đo n chu n b gi ng Theo kh o sát nh ng ch t mang th đ nh t bƠo vi sinh v t: Aliganate, gelatin, x d a, v b ng dùng đ c i, táo, lêầ Tuy nhiên nh ng ch t mang truy n th ng nƠy b n ho c giá thƠnh đ t, v y vi c tìm ki m m t ch t mang m i có u th h n lƠ c n thi t Cellulose vi khu n h i đ nh ng u ki n c a m t ch t mang c đ nh t bƠo: Giá thƠnh r , đ tinh t cao, có kh n ng hút n gi m t t nh c u trúc m ng l c vƠ i cellulose, có th b sung tr c ti p vƠo s n ph m th c ph m mƠ không x y b t k ph n ng ph nƠo, bên c nh r t t t cho h tiêu hóa b i mang b n ch t lƠ cellulose gi ng nh th ch d aầnên đ c ch n lƠm ch t mang đ tƠi nƠy Hi n nhƠ máy s n xu t s a chua ng b ng ph i ta ch b o qu n gi ng ng pháp b o qu n l nh, nhơn gi ng c y chuy n vƠ ho t hóa nhi u l n Tuy nhiên chi phí cho vi c b o qu n l nh vƠ c y chuy n r t t n kém, bên canh ti n hƠnh ho t hóa vƠ c y chuy n nhi u l n s lƠm gi m ho t l c c a vi khu n lactic sau ậ th h Vì v y nhƠ s n xu t ph i ti n hƠnh mua ng gi ng tinh t t nhƠ cung c p gi ng, chi phí cho vi c mua ng gi ng t n chi phí r t cao Vì th , vi c c đ nh hai ch ng vi khu n ST LB giá th BC lƠ u c n thi t Ch ph m vi khu n lactic ch t mang BC mang l i r t nhi u thu n l i: i u ki n b o qu n d dƠng, l u thông, cung c p gi ng thu n ti n, ch đ ng vi c s d ng gi ng, đ c bi t ch ph m vi khu n lactic ch t mang BC v n th h th nh t T th c ti n yêu c u em đư ti n hƠnh đ tƠi “Nghiên c u k thu t c đ nh vi khu n Streptococcus thermophillus Lactobacillus bulgaricus cellulose s n xu t t vi khu n Acetobacter xylinum” v i mong mu n s mang l i nhi u s thu n l i h n vi c b o qu n, l u thông, cung c p gi ng, gi i quy t đ cv n đ nan gi i cung c p vƠ b o qu n gi ng cho nhƠ máy s n xu t s a chua c ng nh l nh v c khác c n đ n ch ph m nƠy Trong ph m vi đ tƠi nƠy em s SVTH: Lê Th B n – L p 09HTP án t ng h p - 2- GVHD: ThS Ngô Th Minh Ph ng ti n hƠnh nghiên c u u ki n t i u đ c đ nh ch ng vi khu n ST LB ch t mang BC vƠ kh o sát th i gian b o qu n, ho t l c c a ch ph m vi khu n lactic ch t mang BC sau c đ nh vƠ m c th i gian trình b o qu n Sinh viên th c hi n Lê Th B n SVTH: Lê Th B n – L p 09HTP án t ng h p GVHD: ThS Ngô Th Minh Ph - 3- CH ng NG 1: T NG QUAN TÀI LI U 1.1 Gi i thi u v ch t mang cellulose vi khu n (BC) 1.1.1 Khái quát chung v BC 1.1.1.1 M t s vi khu n sinh t ng h p BC BC đ 1998) Con đ c t ng h p b i m t s vi khu n (b ng 1.1) (Theo Jonas vƠ Farah, ng t ng h p vƠ c ch u hòa t ng h p BC nhau, nh ng c u trúc BC loƠi có k gi ng m i loƠi khác (Ross vƠ c ng s , 1991; Jonas vƠ Farah,1998) Có m khác bi t đáng k v thu c tính v t lý c a s n ph m celluose, ch y u lƠ chi u dƠi c a chu i glucan (đ c đ c tr ng b i m c đ polymer hóa), tính k t tinh vƠ tr ng thái tính ch t c a Tùy thu c vƠo m i loƠi mƠ tr ng thái k t tinh c a cellulose khác nhau, t xác đ nh tính ch t v t lý c a s n ph m nh đ b n, đ hòa tan dung môi, tính ch u nh h ng c a tác nhơn bi n tính [2,3] B ng 1.1 C u trúc BC m t s loài vi khu n [2] Gi ng C u trúc cellulose Acertobacter L p mƠng ngo i bƠo t o thƠnh dưi Achromobacter S i Aerobacter S i Agrobacterium S i ng n Alcaligen S i Pseudomonas Các s i không tách bi t Rhizobium S i ng n Sarcina Cellulose d hình Zoogloea Ch a xác đ nh rõ c u trúc AX (A.aceti ssp Xylinum, A.xylinus), lƠ vi sinh v t t o cellulose h u hi u nh t G n đơy đư đ c x p vƠo gi ng m i Gluconacertobacter, bao g m loƠi lƠ G.xylinus (Yamada avf c ng s , 1998,2000), G.hánenii, G.europaeus, G.oboediens G.intermedius [2,4] SVTH: Lê Th B n – L p 09HTP án t ng h p - 4- GVHD: ThS Ngô Th Minh Ph ng 1.1.1.2 C u trúc c a BC Cellulose lƠ m t polyme không phơn nhánh bao g m nh ng g c glucopyranose n i v i b i n i  ậ 1,4 Các nghiên c u c b n v BC cho th y BC có c u trúc hóa h c gi ng y h t PC (plant cellulose ậ cellulose th c v t) Tuy nhiên, c u trúc đa phơn vƠ thu c tính c a BC khác v i PC Các s i m i sinh c a BC k t l i v i đ hình thƠnh nên s i s c p (subfibril), có chi u r ng kho ng 1,5 nm LƠ nh ng s i m nh nh t có ngu n g c t nhiên [Kudlicka, 1989] Các vi s i n m bó (budle), vƠ cu i hình thƠnh d i (ribbon) (Yamanaka vƠ c ng s , 2000) Các d i có chi u dƠy ậ nm  chi u r ng 70 ậ 80 nm (Zarr,1977); 3,2  133 nm (Brown vƠ c ng s , 1976); 4,1  117 nm (Yumanaka vƠ c ng s , 2000) Trong chi u r ng c a s i cellulose đ c t o t g thông 30.000 ậ 75.000 nm hay g bulô (Betula) lƠ 14.000 ậ 40.000 nm (hình 1.1) Nh ng d i vi s i cellulose m n có chi u dƠi thay đ i t ậ  m làm hình thành nên c u trúc l i dƠy đ c, đ c n đ nh b i n i hydrogen BC khác v i PC v ch s k t ch t, v m c đ polymer hóa, th ng BC có m c đ polymer hóa t 2.000 ậ 6.000 (Jonas vƠ Farah, 1998); m t vƠi tr ng h p đ t t i 16.000 ậ 20.000 (Watanabc vƠ c ng s 1998) m c polymer hóa th c v t lƠ 13.000 ậ 14.000 (Teeri, 1997) [2,5] C u trúc c a BC ph thu c ch t ch vƠo u ki n nuôi c y (Watanabe vƠ c ng s , 1998a; Yamanaka vƠ c ng s , 2000) u ki n nuôi c y t nh, vi khu n t ng h p nh ng mi ng cellulose b m t c a d ch nuôi c y, t i ranh gi i gi a b m t d ch l ng vƠ không khí giƠu oxy Các mi ng BC nƠy đ tr ng t nh ( S ậ BC: Static BC) Các s i cellulose s c p liên t c đ nh ng l đ c đ y t c x p d c b m t c a t bƠo vi khu n, k t tinh l i thƠnh vi s i, vƠ b đ y xu ng sơu h n môi tr tr c g i lƠ BC môi ng dinh d ng Các d i cellulose t môi ng t nh t o nên m t ph ng song song nh ng không t ch c, có vai trò ch ng đ cho qu n th t bƠo AX (Jonas vƠ Farah, 1998) Các s i BC k đ t môi tr ng t nh n i v i vƠ nhánh h n s i BC đ l c (A ậ BC: Agitated ậ BC) A ậ BC đ c t o d c t o t môi tr ng i d ng h t nh , h t hình vƠ s i dƠi, chúng phơn tán r t t t môi tr SVTH: Lê Th B n – L p 09HTP c t o ng (Vadamme vƠ c ng án t ng h p GVHD: ThS Ngô Th Minh Ph - 39- đ nh BC t ng ng v i nhi t đ hóa ch ph m vi khu n lactic môi tr ph l c vƠ nuôi 54 gi , ti n hƠnh đ m l ng Tôi ti n hƠnh ki m tra b ng cách ho t ng dinh d ng thích h p b ng 1.1 nhi t đ 370C vƠ quan sát s t o thƠnh khu n l c vƠ ng t bƠo s ng đ a petri theo ph ng pháp đư đ c p m c 2.2.2.1 K t qu ki m tra kh n ng s ng sót c a vi khu n lactic ch t mang BC đ c th hi n c th hình 3.9 M t đ t bào (10^9 t bào/ml) 7,8 7,6 7,4 ST 7,2 LB 6,8 6,6 6,4 26 32 34 36 37 38 39 40 Nhi t đ (0C) Hình 3.11 Kh n ng s ng sót c a ch ph m vi khu n lactic ch t mang BC Nh n xét: - 370C l ng t bƠo vi khu n ch t mang BC đ t giá tr c c đ i - ST: 7,78*10^9 t bƠo/ml - LB: 7,63*10^9 t bƠo/ml Ch n đ c nhi t đ đ cao nh t lƠ 370C, t thích h p đ l ng ng v i th i gian V i vi c c đ nh b ng ph v i vi c s y m u nhi u ph d aầL 380C cho l ng t bƠo vi khu n ST LB đ t m t lƠ 54 gi ng pháp b y - h p ph ch t mang BC k t h p ng t bƠo s ng sót ch t mang BC r t l n so v i ng pháp c đ nh khác nh ng ch t mang nh gelatin, v b i, x ng t bƠo vi khu n lactic ch t mang BC nhi u đ n nh v y lƠ em đư l a ch n ph ng pháp c đ nh lƠ ph ng pháp b y ậ h p ph vƠ s d ng ch t mang BC đ c đ nh Giai đo n đ u, ta ngơm BC vƠo d ch vi khu n, k t h p s SVTH: Lê Th B n – L p 09HTP án t ng h p GVHD: ThS Ngô Th Minh Ph - 40- d ng cánh khu y 30 phút đ t ng hi u qu h p ph , BC s hút n n v tr ng thái ban đ u Khi n c vƠ tr ng ng c vƠo c u trúc BC, s mang c t bƠo vi khu n vƠo T i đơy t bƠo vi khu n s đ c h th ng s i cellulose ch t mang BC gi l i đ ng th i b m t BC c ng có t bƠo vi khu n đ c h p ph Ti p theo lƠ giai đo n b y t ng sinh, th i gian kéo dƠi ph thu c vƠo đ c m sinh tr ng c a ch ng vi khu n lactic c đ nh ch t mang BC Các t bƠo c đ nh s s d ng c ch t khu ch tán t môi tr mang BC đ nh t thêm m t l ng đ sinh tr ng vƠ phát tri n ch t ng l n t bƠo vi khu n lactic vƠ b m t ch t mang BC Trong nhi u ph ng pháp c đ nh ch t mang khác nh gelatin, x d a, h t ng c cầ giai đo n b y t ng sinh đ nh t thêm m tl ng l n t bƠo vi khu n giá th c n c đ nh Vì v y ph vi s nh v t ch t mang BC lƠ m t ph ng pháp c đ nh ng pháp u vi t, t n chi phí, u ki n b o qu n ch ph m l i d dƠng, g n nh , d l u thông vƠ cung c p gi ng 3.4.3 Ki m tra hi u qu c a trình c đ nh giá th BC 3.4.3.1 Ki m tra kh n ng s ng sót c a ch ph m vi khu n lactic ch t mang BC Ki m tra kh n ng s ng sót c a ch ph m vi khu n lactic ch t mang, b ng cách ho t hóa ch ph m vi khu n lactic c đ nh ch t mang BC môi tr ng dinh d ng thích h p b ng 1.1 ph l c vƠ nuôi 54 gi , vƠ quan sát s t o thƠnh khu n l c vƠ ti n hƠnh đ m l theo ph đ ng pháp đư đ c p nhi t đ 370C ng t bƠo s ng đ a petri m c 2.2.2.1, k t qu s ng sót c a vi khu n ST LB c th hi n c th hình 3.12 Hình 3.12 Khu n l c c a ch ph m ST (1) LB (2) sau ho t hóa SVTH: Lê Th B n – L p 09HTP án t ng h p GVHD: ThS Ngô Th Minh Ph - 41- ng Nh n xét: Ch ph m lactic c đ nh ch t mang BC sau ho t hóa l i cho kh n ng s ng sót r t cao Hình thái khu n l c c a hai ch ng vi khu n lactic ch t mang BC gi ng h t hình thái c a vi khu n lactic tr c c đ nh i u nƠy ch ng t sau trình c đ nh, vi khu n đư ch u nhi u tác đ ng nh khu y, s yầtuy nhiên vi khu n không h b đ t bi n hay bi n ch ng v hình thái, đ c bi t lƠ t l s ng sót c a vi khu n lactic ch t mang BC lƠ r t cao 3.4.3.2 Ki m tra ho t l c c a ch ph m vi khu n lactic so v i gi ng ng th ch nghiêng th h th nh t Ti n hƠnh lên men v i hai m u: - M u 1: Ch ph m vi khu n lactic c đ nh ch t mang BC - M u (M u đ i ch ng): Hai ch ng vi khu n lactic đư phơn l p đ qu n ng nghi m cb o th h th nh t Sau thu nh n ch ph m vi khu n lactic c đ nh ch t mang BC, em ti n hƠnh pha loưng vƠ gieo m u đ a petri có ch a môi tr ng dinh d ng thích h p b ng 1.1 ph l c Sau th i gian hai ngƠy, quan sát s phát tri n c a khu n l c, dùng que c y vô trùng l y m t l ng vi khu n lactic t ng đ ng vi khu n đư b o qu n ng th ch nghiêng đ ki m tra n ng l c lên men c a ch ph m vi khu n lactic c đ nh ch t mang BC b ng ph ng pháp công ngh vƠ ph ng pháp hóa h c đư đ c p m c 2.2.4 2.2.7 K t qu so sánh v i m u đ i ch ng đ c th hi n c th hình 3.13 Th tích NaOH tiêu t n (ml) 12 10 M2 M1 2 Th i gian (h) Hình 3.13 Kh n ng sinh acid lactic c a m u m u SVTH: Lê Th B n – L p 09HTP án t ng h p GVHD: ThS Ngô Th Minh Ph - 42- ng Nh n xét: - M1 M2: Kh n ng sinh acid lactic x p x b ng nhau, sau gi b t đ u đ t đ acid d ng - Ho t l c c a ch ph m vi khu n lactic c đ nh BC h u nh không thay đ i so v i ng th ch nghiêng - T đơy ta th y r ng ph th h th nh t ng pháp c đ nh vi khu n lactic ch t mang BC r t t t, đ m b o kh n ng s ng sót vƠ n ng l c lên men c a vi khu n lactic r t cao 3.5 Xác đ nh hi u qu c đ nh vi khu n lactic ch t mang BC sau th i gian b o qu n 3.5.1 Xác đ nh kh n ng s ng sót c a vi khu n lactic đ c c đ nh ch t mang BC sau m c th i gian b o qu n kh o sát kh n ng s ng sót c a vi khu n ST LB, c ng nh bi t đ ph c ng pháp b o qu n hai ch ng vi khu n ST LB giá th BC có hi u qu không sau tháng 2,5 tháng b o qu n ch ph m vi khu n lactic ch t mang BC 40C k t h p v i ph g pháp đư đ c p hóa l i hai ch ng vi khu n nƠy môi tr l c vƠ nuôi 54 gi , hƠnh đ m l m c 2.5 Em ti n hƠnh ho t ng dinh d ng thích h p b ng 1.1 ph nhi t đ 370C vƠ quan sát s t o thƠnh khu n l c vƠ ti n ng t bƠo s ng đ a petri theo ph ng pháp đư đ c p m c 2.2.2.1 Ti n hƠnh so sánh v i m u ban đ u Sau trình b o qu n ho t hoá l i em đư thu đ hai ch ng vi khu n ST LB đ cs l c đ th bi u di n hình 3.14 SVTH: Lê Th B n – L p 09HTP ng s ng sót c a M tđ t bào (10^9 t bào/ml) án t ng h p GVHD: ThS Ngô Th Minh Ph - 43- 7,85 7,8 7,75 7,7 7,65 7,6 7,55 7,5 7,45 7,4 7,35 ng ST LB Ban đ u tháng 2,5 tháng Th i gian b o qu n th bi u di n kh n ng s ng sót c a vi khu n lactic ch t mang Hình 3.14 BC sau m c th i gian b o qu n tháng 2,5 tháng T k t qu ta có nh n xét sau: Vi khu n ST LB đ c b o qu n b ng ph mang BC k t h p v i b o qu n l nh ng pháp c đ nh ch t 40C t l s ng sót r t cao Trong th i gian b o qu n s l ng t bƠo ch gi m m t l th i gian vƠ l ng t bƠo v n ng r t so v i ban đ u sau hai m c đ t m c 10^9 t bƠo/ml T đơy ta th y r ng ph ng pháp b o qu n vi khu n lactic ch t mang BC r t t t, kh n ng s ng sót c a vi khu n r t cao so v i nhi u ph ng pháp khác, u ki n b o qu n l i d dƠng, ch ph m vi khu n lactic ch t mang BC l i r t nh nên r t ti n l i b o qu n vƠ l u thông V i nghiên c u nƠy v n đ b o qu n gi ng nhƠ máy s n xu t s a chua c ng nh l nh v c khác c n đ n hai ch ng vi khu n lactic th t s đư đ c gi i quy t, vƠ gi m đ c r t nhi u chi phí vi c b o qu n c ng nh chu n b gi ng 3.5.2 Xác đ nh ho t l c vi khu n lactic c đ nh ch t mang BC sau m c th i gian b o qu n Ti n hƠnh ki m tra ho t l c c a ch ph m vi khu n lactic c đ nh ch t mang BC m c th i gian b o qu n b ng cách đánh giá thông qua n ng l c lên men s a chua theo quy trình công ngh hình 2.2 đ ki m tra kh n ng sinh acid lactic c a ch ph m vi khu n lacic c đ nh ch t mang BC qua th i gian Ti n SVTH: Lê Th B n – L p 09HTP án t ng h p - 44- GVHD: ThS Ngô Th Minh Ph hƠnh so sánh v i m u ban đ u (ch ph m vi khu n lactic v a thu nh n đ ng c) đ xem xét kh n ng sinh acid lactic có b thay đ i nhi u không K t qu đ c th hi n c th hình 3.15 Th tích NaOH tiêu t n (ml) 12 10 Ban đ u tháng 2,5 tháng 2 Th i gian (h) Hình 3.15 Kh n ng sinh acid lactic c a ch ph m vi khu n lactic qua m c th i gian b o qu n Nh n xét: - Ho t l c c a ch ph m vi khu n lactic c đ nh BC h u nh không thay đ i nhi u so v i m u ban đ u - T đơy ta th y r ng ph BC k t h p v i b o qu n l nh ng pháp b o qu n vi khu n lactic ch t mang 40C qua m c th i gian r t u vi t kh n ng sinh acid lactic h u nh không thay đ i nhi u 3.6 ánh giá ph m t s ph ng pháp b o qu n vi khu n lactic ch t mang BC so v i ng pháp khác So v i nhi u ph ng pháp khác ph ch t mang BC có r t nhi u u m n i tr i: ng pháp c đ nh vi khu n lactic i u ki n b o qu n d dƠng h n r t nhi u, không c n s h tr cao v c s v t ch t, thi t b cho vi c đ u t b o qu n nh ph ng pháp đông khô hay l nh sơu Bên c nh công vi c b o qu n vi khu n lactic ch t mang BC thao tác d dƠng h n nh ng l ng t bƠo vi khu n s ng sót ch t mang v n cho kh n ng s ng sót r t cao sau th i gian b o qu n lƠ m c 10^9 t bƠo/ml M t khác, BC có nhi u u th c a m t ch t SVTH: Lê Th B n – L p 09HTP án t ng h p GVHD: ThS Ngô Th Minh Ph - 45- mang nh : Nó lƠ m t ch t hút n c r t m nh nh ng n d ng t nên kh n ng bay h i n ng c BC đa ph n lƠ n c c c a BC c ng r t nhanh chóng vƠ đ t đ n đ khô c n thi t, n cho vi khu n lactic c đ nh BC không ph i tr i qua th i gian dƠi trình s y, u nƠy h n ch s nhi m khu n c ng nh gi m chi phí v m t n ng l ng tiêu hao V m t kinh t so sánh ph so v i ph ng pháp c đ nh vi khu n giá th BC ng pháp c đ nh khác nh gelatin, h t ng c cầthì kh n ng đ t đ n đ khô c n thi t c a ph ng pháp ph i tr i qua th i gian s y r t lơu, m t kho ng 72 gi vi khu n c đ nh BC ch m t kho ng 48 gi đ ng h (áp d ng ph ng pháp khác làm cho vi sinh v t d b nhi m khu n vƠ t n chi phí v m t n ng l ng) BC r t tinh t nên không ph i m t nhi u th i gian x lý nh đ t, cátầ nên h n ch đ đ ng đ c kh n ng nhi m t p Bên c nh BC r t ch c ngu n cung c p c ng nh có th t s n xu t r t d dƠng v i giá thƠnh r so v i ch t mang khác có giá thƠnh đ t nh gelatin, aliganateầ nh ng l ng vi khu n s ng sót ch t mang BC đ t giá tr cao so v i giá th c a ch t mang khác M t đ c m n i b t n a c a BC dùng đ c đ nh vi khu n lactic có tác đ ng b o v t bƠo (Yoshinaga et al.,1997) nh ng ch t mang truy n th ng nh aliganate ch a tìm th y tác đ ng v t bƠo hay ki m hưm t bƠo NgoƠi ra, ch t mang BC r t b n c h c, nên có th ch u nhi u tác đ ng th i gian b o qu n c ng nh l y m u aliganate r t d v b tác đ ng m nh V i nh ng đ c tính n i b t c a BC, k t h p v i ph đư thu đ ng pháp b y ậ h p ph c k t qu c đ nh vi khu n lactic cellulose s n xu t t vi khu n AX thƠnh công v i l ng t bƠo s ng sót giá th BC sau m c th i gian b o qu n v n m c 10^9 t bƠo/ml SVTH: Lê Th B n – L p 09HTP án t ng h p GVHD: ThS Ngô Th Minh Ph - 46- ng K T LU N VÀ KI N NGH K T KU N Sau m t th i gian ti n hƠnh nghiên c u em đư rút đ Phơn l p đ c k t lu n nh sau: c hai ch ng vi khu n ST LB t vinamilk đ ng th i ki m tra s canh tr ng s a chua thu n t c a gi ng vƠ ti n hƠnh c y chuy n sang ng nghi m đ ph c v cho trình nghiên c u S n xu t thƠnh công cellulose t vi khu n AX đ ph c v cho trình nghiên c u, v i thông s lên men l a ch n là:  Th i gian: 15 ngƠy  Nhi t đ : 300C  pH = Bx = 11,5 ậ 120  B ng ph ng pháp b y ậ h p ph k t h p s d ng cánh khu y 30 phút em đư c đ nh thƠnh công hai ch ng vi khu n ST LB ch t mang BC v il ng t bƠo s ng sót giá th BC lƠ 7,89*10^9 t bƠo/ml (ST) vƠ 7,63*10^9 t bƠo/ml (LB), t 370C, th i gian ng ng v i u ki n c đ nh t i u: nhi t đ lƠ 54 gi Sau ti n hƠnh s y m u 380C th i gian 48 gi đ ti n l i cho trình b o qu n vƠ l u thông c ng nh l y m u lên men sau B o qu n thƠnh công ch ph m vi khu n lactic ch t mang BC k t h p v i ph ng pháp b o qu n l nh 40C, v i l ng t bƠo vi khu n s ng sót ch t mang BC sau m c th i gian b o qu n 1- 2,5 tháng v n đ t m c 10^9 t bƠo/ml vƠ ho t l c c a vi khu n ST vƠ LB đ c đánh giá thông qua n ng l c lên men s a chua, đ t hi u qu r t cao so sánh v i m u ban đ u: Ho t l c lên men h u nh không thay đ i nhi u so v i m u ban đ u KI N NGH Ti p t c hoƠn thi n ph ng pháp b o qu n gi ng vi khu n ST LB ch t mang BC nh ti n hƠnh kh o sát h n hay b sung thêm ch t b o v l kho ng th i gian b o qu n dƠi u th h n trình b o qu n đ ng t bƠo s ng sót đ t m t đ cao nh t SVTH: Lê Th B n – L p 09HTP án t ng h p - 47- GVHD: ThS Ngô Th Minh Ph ng T k t qu c đ nh thƠnh công hai ch ng vi khu n lactic ch t mang BC góp ph n th m dò thêm ý t ng s d ng ch ph m vi khu n lactic c đ nh ch t mang BC nƠy ng d ng trình chín phô mai, lên men kefir vƠ nhi u l nh v c khác c n đ n ch ph m vi khu n lactic SVTH: Lê Th B n – L p 09HTP án t ng h p GVHD: ThS Ngô Th Minh Ph - 48- ng TÀI LI U THAM KH O [1] V ng Tr ng HƠo, T ng Th M , “Nghiên c u trình lên men s a chua canxi”, T p chí khoa h c s (2002) [2] Nguy n Thúy H ng, Nghiên c u v th ch d a, Lu n v n th c s sinh h c [3] Nguy n Thúy H ng, “ nh h su t vƠ ch t l ng c a ngu n c ch t vƠ ki u lên men đ n n ng ng cellulose vi khu n”, T p chí khoa h c HQGHN, Khoa h c T nhiên Công ngh 24, (2008), tr 205 ậ 210 [4] Nguy n Thúy H ph ng ậ Tr n Th T ng An, “Thu nh n Bacteriocin b ng ng pháp lên men b i t bƠo Lactococus lactic c đ nh ch t mang BC vƠ ng d ng b o qu n th t t i s ch t i thi u”, Science Technology Development, Vol 11, No.09, (2008), tr.100 ậ 109 [5] Nguy n Thúy H ng ậ Bùi Th Thanh H ng, “Nghiên c u u ki n c đ nh n m men Saccharomyces cerevisae N28 b ng ch t mang BC vƠ b lên men r c đ u ng d ng u vang”, T p chí công ngh sinh h c 6(3), (2008), tr.383 ậ 389 [6] Nguy n Thúy H ng ậ Thái Tr nh Th ng Trí, “C đ nh vi khu n Oenococcus oeni b ng ph c ch t mang aliganate ậ bacterial cellulose đ ng d ng lên men malolctic”, T p chí công ngh sinh h c 6(3), (2008), tr 383 ậ 389 [7] Nguy n Trung Kiên, Ơo Th Bích Uyên, “Nghiên c u s d ng dơu tơy vƠ nha đam đ nơng cao ch t l ng s n ph m s a chua”, Tuy n t p Báo cáo H i ngh sinh viên Nghiên c u Khoa h c l n th i h c N ng (2010) [8] Lê V n Vi t M n, (2004), Công ngh s n xu t s n ph m t s a th c u ng t p 1, xu t b n i h c qu c gia TP H Chí Minh, Tr ng i h c Bách Khoa, NhƠ i h c Qu c gia thƠnh ph H Chí Minh [9] Lê Xuơn Ph Tr ng ng, Giáo trình thí nghi m Vi sinh v t h c, i h c Ơ N ng, i H c Bách Khoa [10] Lê Xuơn Ph ng, Vi sinh v t công nghi p, ih c Ơ N ng, Tr ng ih c K thu t, NhƠ xu t b n xơy d ng [11] TS inh V n Thu n nh ng ng i tham gia, HƠ N i ậ 2003, “Nghiên c u thi t k , ch t o thi t b s n xu t s a chua 600l/h”, Báo cáo t ng k t đ tài Nghiên c u khoa h c, Trung tâm nghiên c u ng d ng – Vi n KH & CN Nhi t L nh SVTH: Lê Th B n – L p 09HTP án t ng h p - 49- GVHD: ThS Ngô Th Minh Ph ng [12] Goh, W.N.,Rosma, A., Kaur, B., Fazilah, A., Karim, A.A and * Rajeev Bhat, “Microstructure and physical properties of microbial cellulose produced during fermentation of black tea broth”, International Food Research Journal 19(1), tr.153 – 158 (2012) [13] http://www.biocouture.co.uk/hanger.html (ngày 11/04/2012; 10:00) [14] http://www.dostậbentre.gov.vn/tinậtucậsuậkien/khoaậhocậcongậnghe/1107ậ kậthutậsnậxutậthchậda.html (ngày 11/04/2012; 09:00) [15] http://en.wikipedia.org/wiki/Bacterial_cellulose (ngƠy truy c p 12 ậ01 ậ2012; 07:20) [16] https://www.google.com.vn/ (ngày 22/02/2012; 10:00) [16] http://tapchithucpham.com/?p=1030 (ngƠy truy c p 13 ậ01 ậ2012; 07:00) [17] http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/cautructebaovk.htm (ngày 27/02/2012; 09:00) [18] http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/kythuatbaoquanvisinhvat.htm (ngày 27/02/2012; 9:57) [19] http://ykhoa.net/yhocphothong/dalieu/03_0074.htm (ngày 11/04/2012; 09:20) SVTH: Lê Th B n – L p 09HTP PH L C PH L C B ng 1.1 Thành ph n môi tr ThƠnh ph n ng ho t hóa vi khu n lactic HƠm l Th ch agar N N 20g c nho ép 5ml Pepton 5g Lactose 5g N ng cc t 11ml c chi t th t 15ml pH B ng 1.2 Nguyên li u s n xu t BC Nguyên li u STT ThƠnh ph n ng saccharose ½ kg Trà túi l c lipton gói Gi ng vi khu n AX 10% so v i nguyên li u PH L C B ng 2.1 S li u đo s sinh tr ng phát tri n c a vi khu n LB ST b ng thi t b đo m t đ quang máy qung ph UV– vis Th i gian M t đ ch s OD ST LB Th i gian M t đ ch s OD ST LB 0,194 0,2 39 0,419 0,491 0,202 0,206 42 0,44 0,493 0,202 0,219 45 0,441 0,499 0,204 0,23 48 0,446 0,52 12 0,208 0,25 51 0,455 0,59 15 0,21 0,271 54 0,466 0,669 18 0,217 0,354 57 0,399 0,665 21 0,23 0,402 60 0,39 0,445 24 0,265 0,45 63 0,38 0,351 27 0,36 0,465 66 0,366 0,334 30 0,39 0,467 69 0,22 0,318 33 0,395 0,483 72 0,15 0,208 36 0,398 0,48 B ng 2.2 Kh i l ng BC t o thành Th i gian (ngƠy) Kh i l m c th i gian lên men ng BC t o thƠnh (g) 40 55 10 92 11 144 12 180 13 240 14 290 15 380 16 381 17 382 B ng 2.3 L ng t bào vi khu n ST LB s ng sót sau s y ph thu c vào m c nhi t đ Nhi t đ ST(*10^9 t bƠo/ml) LB(*10^9 t bƠo/ml) 26 7,11 6,98 32 7,32 34 7,39 7,2 36 7,5 7,45 37 7,78 7,63 38 7,6 7,48 39 7,49 7,33 40 7,4 7,21 B ng 2.4 Hàm l ng acid lactic sinh theo th i gian c a ch ph m vi khu n lactic so v i m u b o qu n ng th ch nghiêng Th i gian (h) th h th nh t Th tích NaOH tiêu t n (ml) M u1 M u2 5.2 4,7 7,1 6,7 9,6 9,3 10,7 10 B ng 2.5 S l ng t bào vi khu n ST LB ch t mang BC sau m c th i gian b o qu n Th i gian ST (*10^9 t bƠo/ml) LB (*10^9 t bƠo/ml) Ban đ u 7,78 7,63 tháng 7,71 7,58 2,5 tháng 7,56 7,5 B ng 2.6 Hàm l ng acid lactic sinh theo th i gian c a ch ph m vi khu n lactic sau m c th i gian b o qu n Th i gian (h) Th tích NaOH tiêu t n (ml) Ban đ u tháng 2,5 tháng 4,7 4,5 4,1 6,7 6,4 6 9,3 8,9 8,7 10 9,6 9,2 [...]... 09HTP ng ậ án t ng h p NG 2: CH 2.1 it GVHD: ThS Ngô Th Minh Ph - 20- IT NG VÀ PH ng NG PHÁP NGHIÊN C U ng nghiên c u 2.1.1 Nguyên li u hóa ch t  Nguyên li u ậ Ch ng vi khu n lactic: Streptococcus thermophillus và Lactobaccillus bulgaricus đ ậ c phơn l p t canh tr ng s a chua vinamilk Ch t mang BC s n xu t t vi khu n Acetobacter xylinum ậ Môi tr ng tuy n ch n đ ho t hóa hai ch ng vi khu n lactic trên trong... phù h p đ vi sinh v t bám trên h th ng s i nƠy, BC có kh n ng hút m vƠ tr môi tr ng t t nên r t thu n ti n đ lƠm giá th cho vi khu n c đ nh trên ch t mang nƠy [4] 1.4 Tình hình nghiên c u vƠ c đ nh vi khu n trên ch t mang BC trong vƠ ngoƠi n c Tình hình nghiên c u c đ nh vi sinh v t trên ch t mang BC t i Vi t Nam ngƠy cƠng nhơn r ng trên nhi u đ i t ng vi sinh v t, hi n t i đư có nhi u đ tƠi nghiên c... i thi u v vi khu n ST và LB 1.2.1 c đi m hình thái c a vi khu n Streptococcus thermophillus và Lactobacillus bulgaricus 1.2.1.1 Streptococcus thermophillus (ST) LƠ vi khu n có t bƠo gram (+), có kh n ng b t mƠu thu c nhu m, hình c u đ n ho c đôi ho c x p đuôi nhau t o thƠnh chu i, không di đ ng SVTH: Lê Th B n – L p 09HTP án t ng h p - 14- GVHD: ThS Ngô Th Minh Ph ng Hình 1.8 Streptococcus thermophillus. .. Minh Ph - 21- ng ng pháp nghiên c u 2.2.1 Ph ng pháp c đ nh vi khu n ST và LT trên ch t mang BC b ng ph ng pháp b y – h p ph Trên ch t mang BC (kích th c 2cm*2cm*1cm) ậ sau khi s y, t bƠo vi khu n: Streptococcus thermophillus và Lactobaccillus bulgaricus đ vào ch t mang b ng ph c h p ph ng pháp b y ậ h p ph (g m 2 giai đo n: H p ph vi kh n lactic trên b m t BC vƠ b y t ng sinh trên vƠ trong ch t mang... ThS Ngô Th Minh Ph ng Hình 1.8 Streptococcus thermophillus 1.2.1.2 Lactobacillus bulgaricus (LB) LƠ vi khu n có t bƠo gram (+), có kh n ng b t mƠu thu c nhu m, hình que, không di đ ng Hình 1.9 Lactobacillus bulgaricus 1.2.2 c đi m sinh lý, sinh hóa c a Streptococcus thermophillus và Lactobacillus bulgaricus Hai ch ng vi khu n trên đ u lƠ vi khu n hi u khí, lên men đ ng hình vƠ ch u đ c n ng đ acid th... p 09HTP án t ng h p GVHD: ThS Ngô Th Minh Ph - 30- CH ng NG 3: K T QU VÀ TH O LU N 3.1 K t qu phơn l p ST và LT t s a chua vinamilk Phơn l p vi sinh v t lƠ quá trình tách riêng các loƠi vi sinh v t t qu n th ban đ u vƠ đ a v d ng thu n khi t [9,37] Vi sinh v t d ng thu n khi t lƠ gi ng vi sinh v t đ c t o ra t m t t bƠo ban đ u [9,37] S a chua vinamilk lƠ m t th ng hi u n i ti ng vƠ uy tín trên th... 09HTP án t ng h p GVHD: ThS Ngô Th Minh Ph - 27-  Tham kh o các nghiên c u tr c đơy vƠ các ph ng ng pháp b o qu n vi sinh v t, em s ti n hƠnh b o qu n ch ph m vi khu n lactic nhi t đ 40C  Sau kho ng th i gian b o qu n lƠ 1 tháng vƠ các kho ng th i gian dƠi h n, em s ti n hƠnh ho t hóa l i m u đ ki m tra kh n ng s ng sót c a vi khu n lactic trên ch t mang trên ch t mang BC  T đó em s rút ra đánh giá... c y chuy n và b o qu n l nh H u h t các c s s n xu t vƠ nghiên c u r t nhi u ph ng pháp nƠy trong gi gi ng vi sinh v t Nguyên t c nƠy lƠ d a trên s trao đ i ch t theo m t kho ng th i gian nh t đ nh Sau m t kho ng th i gian l p l i công vi c trên Cách nƠy t ra hi u qu đ i v i nhi u vi sinh v t [18] Tr c khi đem b o qu n, ng i ta th ng c y truy n gi ng vi sinh v t vƠo 3 ậ 5 ng nghi m th ch nghiêng, nuôi... – L p 09HTP án t ng h p 1.3.4 Ph ng ng pháp c đ nh trên ch t mang Các t bƠo vi sinh v t đ pháp, sau đó m u đ ch t l GVHD: ThS Ngô Th Minh Ph - 17- c bám dính trên ch t mang b ng nhi u ph c mang đi s y khô ng vi sinh v t đư đ ng nhi t đ thích h p sao cho không lƠm c c đ nh trên ch t mang Sau đơy lƠ m t s ví d c th : Trên đ t, cát và silicagel: Các nghiên c u cho th y lƠ bƠo t n m có th s ng 4 ậ 5 n... l p Gi ng vi khu n ST Gi ng vi khu n LB C y gi ng lên đ a có môi tr dinh d ng thích h p Nuôi trong t m ng 370C Ki m tra s thu n khi t c a gi ng C y chuy n sang ng nghi m Hình 2.1 S đ phân l p vi khu n ST và LB  Ki m tra hình d ng t bào b ng cách soi trên kính hi n vi Cách lƠm tiêu b n t m th i có nhu m mƠu Nguyên t c: Ph đ ng pháp nƠy s d ng thu c nhu m không ho c ít đ c v i vi sinh v t và c pha loưng ... saccharose 1.2 Gi i thi u v vi khu n ST LB 1.2.1 c m hình thái c a vi khu n Streptococcus thermophillus Lactobacillus bulgaricus 1.2.1.1 Streptococcus thermophillus (ST) LƠ vi khu n có t bƠo gram... que, không di đ ng Hình 1.9 Lactobacillus bulgaricus 1.2.2 c m sinh lý, sinh hóa c a Streptococcus thermophillus Lactobacillus bulgaricus Hai ch ng vi khu n đ u lƠ vi khu n hi u khí, lên men đ... LU N VÀ KI N NGH 46 TÀI LI U THAM KH O 48 PH L C DANH M C CH VI T T T STT Ký hi u Tên đ y d BC Bacterial cellulose ST Streptococcus thermophillus LB Lactobacillus bulgaricus