BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH ĐẶC TRƯNG PHÂN TỬ VÀ CHỨC NĂNG CÁC GENE ỨNG VIÊN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG BỆNH GHẺ CỦ DO VI KHUẨN STREPTOMYCES SCABIES Ở KHOAI TÂY BẰNG TIN SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ MIRNA Nguyễn Thị Thùy Linh, Nguyễn Thị Phương Thảo*, Nguyễn Thị Thủy Đại học Nông Nghiệp Hà Nội *Liên hệ: Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật, Khoa CNSH, ĐH NNHN; Email: ntpthao@hua.edu.vn TÓM TẮT Gene TXR1 Arabidopsis thaliana mã hóa cho protein có vai trò điều hòa vận chuyển thaxtomin A - tác nhân gây bệnh ghẻ củ khoai tây vào tế bào Protein TXR1 có trình tự tương đồng cao loài thực vật khác nhau, chí động vật người T rình tự bảo tồn TXR1 (từ vị trí 204 đến vị trí 554 mRNA TXR1) nhân dòng xác định trình tự giống khoai tây Atlantic, đồng thời xác định trình tự có intron exon Bên cạnh đó, trình tự khác có khả liên quan đến chế kháng/nhiễm bệnh ghẻ củ khoai tây CV470003.1 nhân dòng AmiRNA công cụ hiệu cho việc làm câm gene, ứng dụng nghiên cứu chức thực vật Dựa vào khung athmiR319a precursor, cấu trúc vector mang trình tự amiRNA-1 đặc hiệu cho gene mục tiêu CV470003.1 thiết kế Cấu trúc sau chuyển vào khoai tây để đánh giá tác động amiRNA-1 đến biểu gen mục tiêu Từ khóa: amiRNA, common scab, miRNA, thaxtomin A, TXR1 gene ĐẶT VẤN ĐỀ Trong số nhiều bệnh gây hại khoai tây, bệnh ghẻ gây hại vi khuẩn Streptomyces scabies bệnh nghiêm trọng, phân bố rộng xảy hầu hết vùng trồng khoai tây giới (Lambert Loria, 1989) Bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến suất phẩm chất củ Theo điều tra Đặng Thị Dung cộng (2003), hầu hết vùng trồng khoai tây Việt Nam bị ảnh hưởng bệnh Thaxtomin A cho nguyên nhân gây bệnh ghẻ củ khoai tây (Delserone cộng sự, 1991; Acuna cộng sự, 2001) Năm 2003, Scheible cộng công bố phát họ đột biến kháng với thaxtomin A Arabidopsis, gọi txr1 Ông tìm gen tương ứng với đột biến TXR1, gen mã hoá cho protein có trình tự bảo thủ tương đồng với tất các sinh vật nhân thật Protein mã hóa gene TXR1 giả thuyết có vai trò điều hòa tham gia vào trình vận chuyển thaxtomins vào tế bào Dựa vào thông tin công bố, nghiên cứu tiến hành nhằm xác định khoai tây có gene TXR1 hay không gene có vai trò chế kháng hay nhiễm bệnh ghẻ củ khoai tây? Công nghệ miRNA phát triển gần tỏ công cụ hiệu để điều hoà ức chế gen đơn nhóm gen khác sở trình tự đặc hiệu Việc sử dụng thành công miRNA nhân tạo để điều hoà ức chế gen công bố hai mầm Arabidopsis, cà chua thuốc mầm lúa (Parizotto cộng sự, 2004; Alvarez cộng sự, 2006; Schwab cộng sự, 2006; Warthmann cộng sự, 2008) Trong đề tài này, sử dụng công cụ tin sinh học, nhân dòng miRNA nhằm bước đầu tìm hiểu trình tự chức gen ứng viên cho TXR1 Các phát gene TXR1 khoai tây góp phần cung cấp thông tin sở di truyền tính kháng, làm sáng tỏ chế hoạt động thaxtomins khoai tây mức phân tử từ góp phần phát triển chiến lược phòng chống bệnh khoai tây trồng khác VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu: DNA chiết tách từ mô giống atlantic Các vector Vector khung- pRS300 chứa ath-miR319a precursor (cung cấp Detlef Weigel, Department of Molecular Biology, Max Planck Institute for Developmental Biology, Germany) Vector nhân dòng pZET1.2/blunt (Fermentas) Vector biểu pPS1 (cung cấp Walter de Jong, Cornell University, USA) Tìm kiếm, phân tích trình tự tương đồng Sử dụng công cụ BLAST NCBI với sở liệu khác (EST, HTGS) công cụ ORF Finder để phân tích đặc trưng trình tự Nhân dòng gene đọc trình tự Sử dụng vector pZET1.2/blunt (Fermentas) Xác định trình tự nhân dòng theo kit Bigdye terminator v3.1 kết giải trình tự xử lý phần mềm DNAstar (Lasergene v7.1) Thiết kế vector biểu thực vật mang amiRNA (miRNA nhân tạo) Sử dụng WMD3 để thiết kế amiRNA đặc thù cho trình tự mRNA mục tiêu Nhân dòng amiRNA sử dụng vector RS300 theo quy trình Rebecca Schwab cộng (2006) Sản phẩm nhân dòng tái tổ hợp vào vector pPSI để tạo nên vector biểu thực vật KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tìm kiếm, phân tích trình tự tương đồng Kết tìm kiếm trình tự gene ứng viên TXR1 khoai tây cho thấy có tính đồng cao CX161514.1, DN849236.1, CK852098.1 với trình tự gene TXR1 (NM_115790) Arabidopsis (lần lượt 72%, 72%, 71%) với trình tự gene ứng viên TXR1 cà chua (AI781901.1) (lần lượt 96%, 96%, 95%) Kết trình tự mức độ nucleotide amino acid cho thấy: vùng bảo thủ nằm vị trí 138-482 CX161514.1, vị trí 114-458 DN849236.1 112-156 CK852098; tương ứng với vị trí 204-554 trình tự mRNA gene TXR1 (NM_115790.2) Arabidopsis vị trí 158-502 trình tự gene ứng viên TXR1 cà chua (AI781901.1) Kết tìm kiếm trình tự gene ứng viên TXR1 khoai tây cho thấy, trình tự CV470003.1 có tính đồng cao với trình tự TXR1 (NM_115790.2) Arabidopsis (71%) với trình tự gene ứng viên TXR1 cà chua (95%) Đây trình tự cDNA thu củ khoai tây bị nhiễm bệnh ghẻ Bởi trình tự có liên quan đến cảm ứng kháng/nhiễm bệnh ghẻ khoai tây.Từ trình tự tương đồng trên, nhóm trình tự lựa chọn sau: - Nhóm 1: gồm trình tự CX161514.1, DN849236.1, CK852098.1 - Nhóm 2: gồm trình tự CV470003.1 Trên Arabidopsis thaliana, dựa vào so sánh trình tự cDNA (NM_115790.2) với trình tự genome (At3g59280, mã số genbank: AI112727.1) chứng tỏ gene TXR1 bao gồm exon (Scheible cộng sự, 2003) Kết phân tích trình tự gene ứng viên TXR1 khoai tây cho thấy trình tự mang intron exon Nhân dòng gene ứng viên Hình : Sản phẩm PCR với cặp mồi F7-R7 giống Atlantic 11 cặp mồi khác thiết kế cho nhóm trình tự thứ để thực nhân dòng PCR, cặp mồi F7-R7 thiết kế cho vị trí vùng bảo thủ, cặp mồi lại thiết kế nhằm nhân toàn chiều dài gene Kết PCR cho thấy, có cặp mồi F1-R5, F1-R6 F7-R7 cho sản phẩm, có sản phẩm nhân cặp mồi F7-R7 cho sản phẩm có kích thước dự đoán (900-950 bp) (Hình 1) Với kích thước trình tự nhân có chứa intron (intron số 2, 3) exon (số 2, 3, 4) Để kiểm chứng dự đoán cấu trúc trình tự vừa nêu, sản phẩm xác định trình tự Kết cho thấy, có sản phẩm nhân lên cặp mồi F7-R7 (gọi At-F7R7) liên quan đến trình tự mục tiêu Sản phẩm có kích thước 917 nts, dự đoán kích thước sản phẩm Kết BLAST cho thấy trình tự có tính đồng cao với trình tự ứng viên TXR1 khoai tây 100% Phân tích trình tự cho thấy trình tự đồng với trình tự EST gene ứng viên TXR1 khoai tây vùng, chứng tỏ trình tự có chứa exon (exon 2, 3, 4) intron (intron 2, 3) Như , kết luận đoạn At-F7R7 nhân môt phần gene TXR1 mục tiêu Trình tự At-F7R7 thiết kế nằm vùng bảo thủ đặt tên TXR1-potato-1 Kết BLAST kết trình tự nucleotide amino acid dự đoán, với thông tin dự đoán cấu trúc polypeptide TXR1-potato-1 cho thấy, đoạn TXR1-potato-1 có chứa intron (intron 3) có kích thước 412, 104 nts exon (exon 2, 3, 4) có kích thước 91, 131, 119 nts Chúng đưa mô hình cấu trúc đoạn TXR1-potato-1 hình Mục tiêu thiết kế amiRNA dựa vào thông tin xác trình tự vùng bảo thủ gene có để nghiên cứu chức gene TXR1 tính kháng/nhiễm Hình 2: Mô hình cấu trúc đoạn TXR1-potato-1 nhân dòng từ Atlantic bệnh ghẻ khoai tây 3’ UTR: trình tự 3’ không mã hóa E2, E3, E4: exon 2, exon 3, exon I2, I3: intron 2, intron Các vị trí đánh số theo trình tự TXR1-potato-1 Tương tự trình tự CV470003.1, thiết kế cặp mồi nhân dòng F3-R3 Kết PCR (hình 3) cho thấy, kích thước sản phẩm phù hợp với dự đoán đoạn nhân dòng mang intron mang intron (intron 2+3) Thiết kế vector biểu mang amiRNA đặc hiệu cho trình tự CV470003.1 Phần mêm WMD3 đưa 28 amiRNA tiềm cho trình CV470003.1 Trong amiRNA1 có trình tự UAUCAUUCGUGCAGUUUGCAU lựa chọn để thực nghiên cứu tự Hình 3: Kết nhân PCR trình tự CV470003.1 giống Atlantic cặp mồi F3, R3 Sử dụng công cụ blast WMD3, phát amiRNA-1 có khả “làm câm” trình tự mục tiêu khác DN589430.1 cDNA tạo từ khoai tây bị nhiễm bệnh mốc sương Mức đồng trình tự CV470003.1 DN589430.1 91% (BLAST) Do vậy, trình tự liên quan đến chế kháng/nhiễm trước tác nhân gây bệnh amiRNA-1 nhân dòng thiết kế thành công vector biểu thực vật pPS1 có mang amiRNA-1 Vector sau chuyển vào khoai tây để đánh giá tác động đến biểu gen TXT1 KẾT LUẬN Sử dụng công cụ tin sinh, mô cấu trúc gene ứng cử viên TXR1 khoai tây có chứa exon với độ lớn 61, 91, 131, 119 nts intron với kích thước tương ứng 3053, 412, 104 nts Bằng thực nghiệm, nhân dòng xác định trình tự thành công trình tự bảo tồn TXR1 (từ vị trí 204 đến vị trí 554 mRNA TXR1) giống khoai tây Atlantic; đoạn nhân có kích thước 917 bp, mã hóa cho 114 aa, dự đoán mang intron (kích thước tương ứng 412, 104 nts) exon (kích thước tương ứng 91, 131, 119 nts) Đã nhân dòng thành công PCR trình tự CV470003.1 từ khoai tây giống Atlantic với kích thước khoảng 4255 bp dự đoán gene quy định trình tự có exon intron Thiết kế thành công vector nhân dòng mang trình tự amiRNA-1 đặc hiệu với mục tiêu CV470003.1 TÀI LIỆU THAM KHẢO Acuna, I.A., Strobel, G.A., Jacobsen, B.L., and Corsini, D.L (2001) Glucosylation as a mechanism of resistance to thaxtomin A in potatoes Plant Sci 161:77–88 Alvarez, J.P., Pekker, I., Goldshmidt, A., Blum, E., Amsellem, Z and Eshed, Y (2006) Endogenous and synthetic microRNAs stimulate simultaneous, efficient, and localized regulation of multiple targets in diverse species Plant Cel 18:1134–1151 Delserone, L.M., Loria, R., and Arias, I (1991) Correlation between susceptibility of potato cultivars to Streptomyces scabies and sensitivity to thaxtomin A Phytopathol 81:1193–1200 Dung, D.T., Yoshida H., and Suyama, K (2003) Susceptibility of different potato varieties against potato common scab in vietnam J ISAAS 9(2):40-46 Lambert, D.H., and Loria, R (1989) Streptomyces scabies sp nov., nom rev Intern J Syst Bacteriol 39:387-392 Parizotto, E.A., Dunoyer, P., Rahm, N., Himber, C., and Voinnet, O (2004) In vivo investigation of the transcription, processing, endonucleolytic activity, and functional relevance of the spatial distribution of a plant miRNA Genes Dev 18:2237–2242 Scheible, W.R., Barbara, F., Kochevenko, A., Schindelasch, D., Zimmerli, L., Somerville, S., Loria, R., and Somerville, C.R (2003) An Arabidopsis Mutant Resistant to Thaxtomin A, a Cellulose Synthesis Inhibitor from Streptomyces Species Plant Cel 15(8):1781–1794 Schwab, R., Ossowski, S., Riester, M., Warthmann, N., and Weigel, D (2006) Highly specific gene silencing by artificial microRNAs in Arabidopsis Plant Cel 18:1121–1133 Warthmann, N., Chen, H., Ossowski, S., Weigel, D., and Herve, P (2008) Highly Specific Gene Silencing by Artificial miRNAs in Rice PLoS ONE 3(3):e1829 INITIALLY DETERMINE MOLECULAR CHARACTERISTICS AND FUNCTION OF CANDIDATE GENES RELATED TO RESISTANCE OF POTATOES TO COMMON SCAB CAUSED BY STREPTOMYCES SCABIES VIA BIOINFORMATICS AND MIRNA TECHNOLOGY Nguyen Thi Thuy Linh, Nguyen Thi Phuong Thao*, Nguyen Thi Thuy Hanoi university of Agriculture *For correspondence: Department of Plant Biotechnology, Faculty of Biotechnology, HUA; email: ntpthao@hua.edu.vn Summary TXR1 gene of Arabidopsis thaliana encodes a novel protein with homologs in all fully sequenced eukaryotes and this protein regulates the transport of thaxtomin A – the major toxin which causes common scab into plant cells The conserved sequence of TXR1 gene (nucleotides 204 to 554 on mRNA of TXR1 gene) of the potato variety Atlantic was cloned and sequenced successfully This sequence contains three introns and four exons Additionally, another sequence potentially related to the genetic mechanism of resistance/susceptibility to common scab, CV470003.1 was amplified by PCR successfully AmiRNAs have been proved to be an effective tool for specific gene silencing in plants and amiRNA technology has become a powerful tool for functional genomics research An amiRNA vector that contains amiRNA-1 which is specific for CV470003.1 was generated based on the structure of ath-miR319a This vector was used to transform to potato in order to determine the affect of designed amiRNA-1 contruct on the target TXR1 gene Keywords: amiRNA, common scab, miRNA, thaxtomin A, TXR1 gene  ... Arabidopsis (71%) với trình tự gene ứng vi n TXR1 cà chua (95%) Đây trình tự cDNA thu củ khoai tây b nhiễm b nh ghẻ B i trình tự có liên quan đến cảm ứng kháng/ nhiễm b nh ghẻ khoai tây. Từ trình tự tương... tự gene ứng vi n TXR1 khoai tây cho thấy có tính đồng cao CX161514.1, DN849236.1, CK852098.1 với trình tự gene TXR1 (NM_115790) Arabidopsis (lần lượt 72%, 72%, 71%) với trình tự gene ứng vi n TXR1... amiRNA dựa vào thông tin xác trình tự vùng b o thủ gene có để nghiên cứu chức gene TXR1 tính kháng/ nhiễm Hình 2: Mô hình cấu trúc đoạn TXR1-potato-1 nhân dòng từ Atlantic b nh ghẻ khoai tây 3’ UTR: