TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TPHCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM  HƯỚNG DẪN BÁO CÁO THỰC TẬP MÔN VI SINH ĐẠI CƯƠNG GV: Lưu Huyền Trang TP.HỒ CHÍ MINH 12/2015 BÀI 1: THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHỊNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT I Trình bày yêu cầu việc bao gói dụng cụ ni cấy vi sinh vật? - Phần giấy bao bên phải chặt kín - Bao giấy dầu với dụng cụ hấp ướt - Bao giấy báo với dụng cụ sấy khô khử trùng ướt - Với cấc dụng cụ pipet, que trải phải dùng giấy bao kín tồn Có thể dùng hộp nhơm để đựng dụng cụ đẻ khử trùng II Công dụng cách sử dụng dụng cụ, thiết bị phịng thí nghiệm vi sinh vật? - Tủ sấy (vacuum oven): dùng dòng khơng khí nóng (đối lưu khơng) Có hai loại sấy: o Sấy khô: vật dụng thủy tinh, kim loại (105 oC), nhựa (60-80 oC) o Sấy khử trùng: 160 o C (2 giờ), 180 o C (30 phút) - Tủ ấm/ ủ (incubator): ủ, nuôi cấy vi sinh vật nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng phát triển chúng - Bể ổn nhiệt (water bath): chứa nước cài đặt nhiệt độ định để ổn định nhiệt độ cho thí nghiệm - Máy lắc (trộn đều): lắc ngang ho ặc lắc vòng, để tăng lượng oxy hòa tan tăng khả vi sinh vật tiếp xúc với chất - Máy đo pH: đo pH dung dịch, môi trường nuôi cấy vi sinh vật (đo trước cho agar vào) - Cân: vệ sinh cân trước sau dùng, cân ý đơn vị đo - Máy ly tâm (centrifuge): thu sinh khối vi sinh vật Các ống ly tâm cần đặt đối xứng thiết có khối lượng - Tủ cấy vơ khuẩn có đèn cực tím (flux laminar): có khơng gian vơ trùng sử dụng để thao tác với sinh, bao gồm: o Đèn UV: khử trùng khí bề mặt trongb tủ o Bộ phận thổi khí vơ trùng o Lỗ lọc khí: đường kính 0,2-0,45µm - Nồi hấp ướt (autoclave): thiết bị cấp nhiệt nước áp suất cao, dùng để hấp khử trùng môi trường, số nguyên liệu dụng cụ thí nghiệm - Kính hiển vi: nghiên cứu, quan sát tế bào vi sinh vật đặc điểm hình thái, sinh lí nhờ vào khả phóng đại kính - Thiết bị khác: máy đếm vi sinh vật, máy quang phổ, sấy đong khơ, - Dụng cụ thí nghiệm: o Phiến kính (lame): dùng làm tiêu quan sát hình thái, sinh lí tế bào vi sinh vật o Lá kính (lamelle): dùng để đậy lên vết bôi tiêu cố định vi sinh vật trình nghiên cứu o Hộp lồng (đĩa petri): dùng để nghiên cứu đặc điểm hình thái , đ ặc điểm ni cấy phân lập tế bào vi sinh vật o Que gạt (que trải): dụng cụ để phân lập vi sinh vật theo phương pháp trải đĩa o Que cấy, co loại: que cấy đầu tròn (vi khuẩn, nấm men), que cấy nhọn (cấy sâu môi trường rắn), que cấy móc (khuẩn ty, đoạn tơ nấm) o Micro pipette: dùng cần hút lương xác mơi trường sử dụng định lượng vi sinh vật o Pipette Pasteur:dùng để lấy dung dịch môi trường nuôi cấy III Trình bày phương pháp tiêt trùng dụng cụ môi trường nuôi cấy vi sinh vật? Phương pháp lí học: - Nhiệt khơ:  Đối với dụng cụ ikm loại, thủy tinh, phương pháp thường dùng đốt: đốt trực tiếp lửa nhúng cồn đốt  Đối với dụng cụ thủy tinh gói giấy sấy 160 o C 1-2 h oặc 180 oC 30 phút Dụng cụ đưa vào sấy phải chịu nhiệt độ cao không buộc dây nhựa thun - Nhiệt ẩm:  Phương pháp luộc: cho vật khử trùng vào nước sôi, nhiệt thấm nhanh vào mẫu vật làm cho protein đông kết, dẫn đến giết chết vi sinh vật Tuy nhiên, diệt tế bào sinh dưỡng, bào tử  Phương pháp Pasteur:chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh (kí sinh), khơng diệt bào tử vi khuẩn hoại sinh Phương phấp không diệt hoàn toàn mầm bệnh mà chọn vài vi sinh vật đối kháng mạnh Vì vậy, phải biết nhiệt độ thời gian diệt trùng cho loại vi sinh vật Phương pháp thường dùng nhiệt độ 70-75 oC thời gian 10-15 phút  Phương pháp Tyndalll: đun cách thủy nhiều lần nhiệt độ 70-80o C, lần 30-60 phút liên tiếp ngày liền  Phương pháp nước bão hòa áp suất cao: dùng autoclave Nhiệt độ thời gian hấp tùy thuộc vào loại nguyên liệu cần hấp Thường dùng nhiệt độ 121 oC thời gian 15-30 phút - Diệt trùng xạ:  Tia tử ngoại hay UV: sát trùng bề mặt, không xuyên sâu vào mẫu vật  Tia âm cực:dùng diệt trùng dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm Vật khử trùng phải bao gói kín  Sóng ngắn tác động với cường độ thời gian thích hợp phá vỡ tế bào sinh vật, làm chết tế bào sồng - Diệt trùng cách lọc:  Dụng cụ lọc thường lọc sứ, aminate, celluose, có kích thước lỗ lọc từ 0,2-0,45µm, thường dùng để lọc vật phẩm lỏng không khử trùng nhiệt  Đối với khử trùng không khí thiết bị khử trùng máy locjkhis có trang bị lọc hay hấp phụ vi khuẩn Phương pháp hóa học: - Chất sát khuẩn ngồi da: xà phòng, cồn, iode, phẩm màu (phần lớn phẩm màu có tác dụng sát khuẩn xanh methylenne) - Chất diệt khuẩn chất tẩy uế: phenol, formol, hợp chất clor, BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NI CẤY VI SINH VẬT I Khái niệm mơi trường phân loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật Khái niệm Các chất dinh dưỡng hợp chất tham gia vào trình trao đổi chất nội bào Môi trường dinh dưỡng hỗn hợp gồm chất dinh dưỡng chất có nhiệm vụ trì oxy hóa - khử, áp suất thẩm thấu tế bào ổn định pH môi trường Phân loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật:  Phân loại theo nguồn gốc: -Môi trường tự nhiên: dịch nước thịt, máu động vật, nước chiết khoai tây, -Môi trường nhân tạo: Czapeck, Hansen, EMB, -Môi trường bán tự nhiên: PGA, giá đậu đường, - Môi trường bán tổng hợp: BPA,  Phân loại theo trạng thái vật lý: -Mơi trường lỏng: dạng lỏng, khơng có agar hay chất làm giá thể khác thành phần môi trường -Mơi trường bán lỏng: có 0.5% agar hay chất làm giá thể -Mơi trường rắn: có chứa 1.5 - 2% agar hay chất làm giá thể -Môi trường bán rắn: cơm nguội, đậu,  Phân loại theo công dụng -Môi trường tiền tăng sinh -Môi trường tăng sinh -Môi trường phân lập -Môi trường Chromogenic  Phân loại theo chủng loại -Môi trường nuôi cấy nấm men -Môi trường nuôi cấy nấm môc -Môi trường nuôi cấy vi khuẩn -Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn -Môi trường nuôi cấy virus II Quy trình pha chế mơi trường ni cấy vi sinh vật Bước 1:Chuẩn bị dụng cụ -Chuẩn bị đầy đủ -Dụng cụ rửa sạch, tráng nước cất sau sấy khơ trước sử dụng Bước 2: Cân đong hóa chất pha chế mơi trường Bước 3:Phối chế tạo môi trường nuôi cấy -Các thành phần hòa tan riêng rẽ nuocs cất trước phối trộn -Phối trộn theo trình tự -Lọc mơi trường -Đối với môi trường rắn: sau phối trộn cần nấu sơi để hịa tan hồn tồn agar Bước 4Điều chỉnh độ pH môi trường Bước 5Phân phối vào dụng cụ chứa -Trình tự phân phối: + Đun cho lỏng hóa chất đổ qua phễu vào dụng cụ +Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường, tay phải kẹp nút bơng kéo +Nhanh tay rót dụng cụ vào môi trường đậy nút lại -Viết nhãn môi trường lên dụng cụ chứa Bước :Khử trùng môi trường Bước :Làm thạch nghiêng, thạch đứng, đổ thạch vào đia petri Bước 8:kiểm tra độ vô trùng bảo quản III Yêu cầu môi trường đĩa petri, ống nghiệm thạch nghiêng thạch đứng  Đĩa petri: môi trường phân phối vào đĩa sau hấp tiệt trùng Thể tích mơi trường khoảng 12 - 15ml đĩa lớp môi trường thạch dày khoảng 2mm  Ống nghiệm thạch nghiêng: lượng mơi trường phân phối vào chiếm 1/4 thể tích ống nghiệm Sau phân phối môi trường vào ống nghiệm, ống nghiệm phải đặt nghiêng cố định giá đỡ Phần đỉnh nghiêng phải cách nút đậy - 5cm Phần đáy phải có phần thạch đứng 0,5-1cm  Ống nghiệm thạch đứng: lượng môi trường phân phối vào chiếm 1/3 - 1/2 thể tích ống nghiệm Sau để yên giá mơi trường nguội đơng đặc IV Giải thích không phân phối môi trường vào đĩa petri trước khử trùng? - Không phân phối môi trường vào đĩa petri trước khử trùng vì: + Chiều cao đĩa thấp, ta cho môi trường vào tiến hành hấp khử trùng làm cho môi trường đĩa bị trào ngồi, dẫn đến mơi trường bị đục khó quan sát vi sinh vật + Mơi trường bị trào ngồi hấp ảnh hưởng đến chất lượng mơi trường Bên cạnh đó, môi trường dễ bị nhiễm vi sinh vật không mong muốn, lượng môi trường đĩa giảm ảnh hưởng đến q trình ni cấy việc quan sát V Đĩa petri chứa môi trường trước cấy vi sinh vật nên đặt úp hay ng ửa? Tại sao? Đĩa petri chứa môi trường trước nuôi cấy vi sinh vật nên để ngửa để làm kín khu vực nuôi cấy, tránh bị vi sinh vật lạ rớt ngồi khơng khí vào tránh bốc nước bám vào bè mặt mơi trường, lúc nước ngưng nắp BÀI 3: PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT I Phương pháp cấy truyền vi khuẩn, nấm men, nấm mốc Cấy truyền ống nghiệm thạch nghiêng  Cấy truyền vi khuẩn, nấm men : - Dán nhãn ghi: tên loại vi sinh vật, ngày cấy, tên sinh viên thực vào thành ống nghiệm - Sử dụng que cấy đầu tròn thực thao tác cấy - Tay trái cầm hai ống nghiệm: ống giống; ống môi trường - Tay phải cầm que cấy khử trùng lửa đèn cồn nóng đỏ dây cấy - Dùng ngón út ngón áp út đ ậy ống nghiệm vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút đậy - Hơ nóng để khử trùng khơng khí miệng hai ống nghiệm - Đợi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với vi sinh vật ống giống - Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm đưa vào ống môi trường để thực thao tác cấy: + Hình chữ chi + Hình vịng xoắn + Hình vạch ngang song song - Khử trùng lại phần khơng khí nơi miệng hai ống nghiệm đậy nút - Khử trùng lại que cấy sau sử dụng xong  Cấy truyền nấm mốc - Thực thao tác tương tự giống cấy truyền vi khuẩn, nấm men khác nấm mốc, cấy ống nghiệm thạch nghiêng, dùng que móc vơ trùng l bào tử từ ống giống Cấy truyền bào tử từ ống nghiệm môi trường theo hai cách: + Cấy điểm: Cắm ngập đầu que cấy thành ba điểm cách bề mặt thạch + Cấy gõ: Đưa que que cấy có mang bào tử vào ống nghiệm môi trường, gõ nhẹ lưng que cấy vào thành ống nghiệp đối diện với mặt thạch để rãi bao tử xuống Cấy truyền thạch đĩa -Dùng que cấy đầu tròn , que trải thủy tinh -Dùng que cấy tròn lấy vi sinh vật tay phải theo quy cách -Tay trái cầm hộp petri khẽ hơ nhẹ lửa đèn cồn Sau để cách đền cồn chừng 1-2 cm, khẽ mở nghiêng bên hộp(phần hơ lửa), cho vừa đủ que cấy vào - Nhẹ nhàng, nhanh chóng lướt que cấy bề mặt thạch theo kiểu sau: + Theo hình zích zắc tồn mặt thạch + Theo đường song song + Theo hình zích zắc góc - Khi dùng que trải, hút sẵn lượng khoảng 0,1 dịch vi sinh vật nhỏ lên bề mặt thạch đĩa Khử trùng que trải thủy tinh cách nhúng vào cồn đốt lửa Làm nguội que trải trải giọt dung dịch vi sinh vật lên khắp bề mặt môi trường thạch đĩa II Các điều kiện nuôi ủ nấm men vi khuẩn sau gieo cấy - Nhiệt độ: phụ thuộc vào loại vi sinh vật Duy trì ổn định nhiệt độ bẳng tủ ủ vi sinh vật - Độ ẩm: để trì độ ẩm, q trình ni cần đảm bảo đủ lượng nước làm môi trường Trong điều kiện cần thiết phun nước vơ khuẩn vào phịng ni ho ặc để nước bốc tủ ấm - Oxy: vi sinh vật hiếu khí, cung cấp thường xuyên đ ầy đủ oxy Lớp mơi trường ni cấy có độ dày vừa phải Các bình chứa mơi trường lắc thường xun q trình ni để cung cấp thêm oxy cho vi sinh vật Nếu ni cấy mơi trường có khối lượng phải tiến hành sục khí thường xuyên hay định kì Đối với vi sinh vật kị khí: hạn chế tiếp xúc với oxy cách đổ lên bề mặt mơi trường parafin, dầu vaselin cấy trích sâu vào mơi trường đặc, ni cấy bình hút chân khơng, ni cấy bình hút đặc biệt, sau rút hết khơng khí hàn kín lại, đun sôi môi trường thời gian để lọai hết oxy Để nguội 45 độ C Dùng pipette cấy vi sinh vật vào đáy ống nghiệm Làm nguội nhanh đổ vaselin lên bề mặt để hạn chế tiếp xúc với oxy III Đĩa petri sau cấy vi sinh vật nên đặt úp số lí sau: - Hạn chế việc nước đọng nắp rơi xuống làm hỏng khuẩn lạc nuôi cấy, làm nhiễm , hư môi trường - Hạn chế phần tạp nhiễm thời gian ni cấy phần đáy nặng có xu hướng úp từ xuống nên đậy kín đĩa thạch - Dễ dàng cầm nắm, vận chuyển đĩa thạch mà không bị rơi nắp bất ngờ làm môi trường bị nhiễm - Riêng nấm mốc nên để ngửa, tránh bào tử rơi khỏi môi trường(khi để úp có khả bào tử rơi xuống mộc lum tum, bị nhiễm) IV Khi cấy truyền vi sinh vật ống thạch nghiêng, ta phải ria que cấy ngược từ đáy ống nghiệm lên phía - Ria từ lên, que cấy theo chiều từ lên khỏi ống nghiệm mà không cần di chuyển qua đường cấy.(trường hợp cấy từ xuống lúc kéo que c dễ rớt vi sinh vật vào lúc vi sinh vật mọc không đường cấ khó xác định bị nhiễm vi sinh vật lạ hay vi sinh vật muốn cấy rớt vào ) - Mơi trường từ đáy lên phía dần, nên cấy từ lên đảm bảo lượng vi sinh vật phân bố hợp lí vào mơi trường theo hướng dần 10 - Nếu ria từ xuống khó thao tác làm rách thạch - Khi môi trường chuẩn bị xong có giọt nước đáy ống nghiệm, thao tác thường dùng que c hòa vào giọt nước bắt đầu ria, vi sinh vật mọc đường cấy BÀI 4: PHƯƠNG PHÁP QUANG SÁT VI SINH VẬT BẰNG KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC I Trình bày cấu tạo nguyên tắc hoạt động kính hiển vi 1.1 Cấu tạo Hệ thống giá đỡ gồm:Bệ, thân, Revonve mang vật kính, bàn để tiêu bản, kẹp tiêu Hệ thống phóng đại gồm: Thị kính: phận kính hiển vi mà người ta để mắt để soi kính, có - loại ống đơi ống đơn (Bản chất thấu kính hội tụ có tiêu cự ngắn, dùng để tạo ảnh thật vật cần quan sát) Vật kính: phận kính hiển vi quay phía có vật mà người ta muốn - quan sát, có độ phóng đại vật kính:x4, x10, x40, x100 (Bản chất thấu kính hội tụ có tiêu cự ngắn, đóng vai trị kính lúp để quan sát ảnh thật) Hệ thống chiếu sáng gồm: - Nguồn sáng (gương đèn) - Màn chắn, đặt vào tụ quang dùng để điều chỉnh lượng ánh sáng qua tụ quang - Tụ quang, dùng để tập trung tia ánh sáng hướng luồng ánh sáng vào tiêu cần quan sát Vị trí tụ quang nằm gương bàn để tiêu Di chuyển tụ quang lên xuống để điều chỉnh độ chiếu sáng Hệ thống điều chỉnh: - núm chỉnh tinh (thứ cấp) 11 - núm chỉnh thô(thứ cấp) - Ốc điều chỉnh tụ quang lên xuống - Ốc điều chỉnh độ tập trung ánh sáng tụ quang - Núm điều chỉnh chắn - núm di chuyển bàn sa trượt 1.2 Nguyên tắc hoạt động - Vật kính hệ thống quang hợp phức tạp gồm số thấu kính, trực tiếp phóng đại mẫu vật Các thấu ính xếp theo thứ tự, thấu kính nhỏ ngồi hướng vào tiêu có độ phóng đại lớn Độ phóng đại tùy thuộc vào tiêu cự, tức bán kính cong thấu kính Thấu kính cong, tiêu cự ngắn khả phóng đại lớn - Thị kính: gồm thấu kính, hướng người xem, hướng vất kính Thị kính phóng đại lần ảnh vật thu vào, làm ảnh to lên, xem rõ 12 - Năng suất phân li kính quan trọng độ phóng đại, tiêu chuẩn để chọn kính hiển vi Năng suất phân li kính hiển vi đại lượng cho biết khả phân biệt hai điểm vật nằm sát Nếu khoảng cách hai điểm nằm sát suất phân ly kính cao - Chiết suất ánh sáng khơng khí nhỏ thủy tinh, nên tia sáng qua tiêu bảng thủy tinh bị khúc xạ phần Phần phía ngồi tia sáng bị khúc xạ nên khơng thể vào vật kính Vật kính có độ phóng đại lớn đường kính thấu kính nhỏ, lượng tia sáng vào ít, nên khơng thể nhìn rõ vật Để hạn chế nhược điểm này, người ta dùng dầu soi chiết suất ánh sáng gần với chiết suất thủy tinh,ánh sáng đị qua không bi khúc xạ nên tập trung đầy đủ vào vật kính, giúp xem rõ ảnh II Hình vẽ tiêu quan sát: BÀI 5: PHƯƠNG PHÁP NHỒM MÀU VI SINH VẬT 13 I Sau nhuộm, vi khuẩn Gram dương có màu xanh đen hay tím, Gram âm có màu đỏ vàng hay đỏ tía Giải thích nguyên nhân? - Ở vi khuẩn Gram dương(G+) sau nhuộm màu soi kính hiển vi chúng bắt màu tím-xanh,cịn Gram âm(G-) bắt màu hồng - Giải thích nguyên nhân + Đầu tiên người ta nhỏ thuốc tím tinh thể (Crystal Violet) hai bắt màu tím + Sau rửa dd cồn màu tím G- lớp Peptidoglican mỏng lớp cịn G+ ngược lại + Nhỏ dd Fuchhin safranin vi khuẩn G+ bắt màu kết hợp với màu tím bang đầu nên màu đỏ Fucshin bị mất, nên G+ có màu tím, cịn G- bị màu tím nên bắt màu thuốc nhuộm bổ sung kết bắt màu đỏ hồng II Nếu không bổ sung thuốc nhuộm safranin fuchsin, vi khuẩn G- có màu gì? Tại sao? - Nếu khơng bổ sung thuốc nhuộm safranin fucshin vi khuẩn G- khơng có màu - Vì trước bổ sung thuốc nhuộm safranin fucshin màu tím Crystal Violet tạo bị rửa trôi dung dịch tẩy màu thành tê bào G- mỏng lớp nên màu III Hình vẽ vi sinh vật nhuộm cố định khơng cố đình: 14 BÀI 6: PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT 15 I Các nguyên tắc phương pháp phân lập vi khuẩn khiết: Nguyên tắc: Tách rời tế bào vi sinh vật; Nuôi cấy tế bào môi trường dinh dưỡng đặc trưng khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt Phương pháp:  Cấy vi sinh vật từ khuẩn lạc mọc tách rời đĩa petri vào ống môi trường thạch nghiên  Nuôi cấy vi sinh vật nhiệt độ thời gian thích hợp  Loại bỏ ống nhiễm, chọn ống có chủng khiết II Ngun tắc việc ni tích lũy Trong trường hợp mẫu vi sinh vật phải ni tích lũy cách ủ giống, bổ sung số chất dinh dưỡng điều kiện lí hóa hợp lí bổ sung chất ứa chế vi sinh vật khác III Chuẩn vi khuẩn khiết(chủng sạch): Chủng vi khuẩn khiết hiểu hệ con, cháu, dịng có nguồn gốc từ tế bào riêng lẻ Các chủng vi sinh vật thu nhận từ khuẩn lạc phân lập chưa khuẩn lạc hình thành nhiều tế bào, bào tử, phải làm nhiều lần để thu chủng vi sinh vật khiết 16 ... làm cho protein đông kết, dẫn đến giết chết vi sinh vật Tuy nhiên, diệt tế bào sinh dưỡng, bào tử  Phương pháp Pasteur:chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh (kí sinh) , không diệt bào tử vi khuẩn hoại sinh. .. truyền vi khuẩn, nấm men : - Dán nhãn ghi: tên loại vi sinh vật, ngày cấy, tên sinh viên thực vào thành ống nghiệm - Sử dụng que cấy đầu tròn thực thao tác cấy - Tay trái cầm hai ống nghiệm: ống... vi sinh vật vào lúc vi sinh vật mọc không đường cấ khó xác định bị nhiễm vi sinh vật lạ hay vi sinh vật muốn cấy rớt vào ) - Môi trường từ đáy lên phía dần, nên cấy từ lên đảm bảo lượng vi sinh