BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Đỗ Thị Thu Nga KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành Phố Hồ Chí Minh - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH _ Đỗ Thị Thu Nga KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS TRẦN THANH THỦY Thành Phố Hồ Chí Minh - 2012 i LỜI CẢM ƠN  Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Thanh Thủy, người tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ động viên suốt trình tiến hành đề tài  Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh hết lòng dạy dỗ  Tôi xin cảm ơn em Nguyễn Thị Quỳnh Thương, em Lê Thị Thùy, bạn Mỹ Nhung, Bích Phương, Tố Nga, Thoại Anh, Thùy Trang giúp đỡ động viên  Tôi xin cảm ơn người thân gia đình, bạn bè, đồng nghiệp bên cạnh, ủng hộ ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình Các tài liệu tham khảo trích dẫn có nguồn gốc xác thực Tác giả luận văn Đỗ Thị Thu Nga iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii DANH MỤC CÁC BẢNG ix DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Sơ lược enzyme 1.1.1 Khái niệm enzyme 1.1.2 Cấu trúc phân tử enzyme 1.1.3 Cơ chế tác dụng enzyme 1.2 Protein enzyme protease .5 1.2.1 Protein .5 1.2.1.1 Khái niệm 1.2.1.2 Cấu trúc protein 1.2.1.3 Sự biến tính protein 1.2.2 Protease 1.2.2.1 Khái niệm 1.2.2.2 Phân loại 1.2.2.3 Cơ chế tác dụng protease 10 1.2.2.4 Nguồn thu protease 10 1.2.2.5 Ứng dụng protease 13 1.3 Vi khuẩn Bacillus 16 1.3.1 Đặc điểm sinh học Bacillus .16 1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp protease Bacillus .18 iv 1.3.2.1 Ảnh hưởng thành phần môi trường dinh dưỡng 18 1.3.2.2 Ảnh hưởng yếu tố MT lên khả sinh tổng hợp protease 21 1.3.2.3 Ảnh hưởng phương pháp nuôi cấy 22 1.3.3 Thu nhận tinh enzyme từ môi trường nuôi cấy 24 1.3.3.1 Thu dịch enzyme 24 1.3.3.2 Thu chế phẩm kỹ thuật 25 1.3.3.3 Thu chế phẩm enzyme tinh khiết .25 1.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng enzyme protease Bacillus nước 26 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29 2.1 Vật liệu 29 2.1.1 Đối tượng 29 2.1.2 Thiết bị dụng cụ 29 2.1.3 Hóa chất 29 2.2 Môi trường nghiên cứu 29 2.3 Các phương pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Phương pháp phân lập 30 2.3.2 Phương pháp cấy truyền giữ giống 31 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học vi khuẩn 31 2.3.3.1 Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc 31 2.3.3.2 Phương pháp nhuộm Gram 32 2.3.3.3 Phương pháp nhuộm bào tử 32 2.3.3.4 Phương pháp xác định khả sinh catalase 33 2.3.4 Xác định mật độ tế bào phương pháp đếm khuẩn lạc 33 2.3.5 Xác định mật độ tế bào phương pháp mật độ quang .34 2.3.6 Nuôi cấy bề sâu (nuôi cấy chìm) 35 2.3.7 Thu dịch enzyme thô 35 2.3.8 Phương pháp xác định hoạt tính protease đo đường kính thủy phân 36 v 2.3.9 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến 37 2.3.10 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry .39 2.3.11 Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện MT nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp protease chủng VK .40 2.3.11.1 Ảnh hưởng MT nuôi cấy 40 2.3.11.2 Ảnh hưởng chất cảm ứng 41 2.3.11.3 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng 41 2.3.11.4 Ảnh hưởng pH môi trường 41 2.3.11.5 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 41 2.3.11.6 Ảnh hưởng tốc độ lắc .41 2.3.11.7 Nghiên cứu động học trình lên men 42 2.3.12 Tách thu nhận chế phẩm protease [20], [28] 42 2.3.13 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố lý hóa lên hoạt tính CPE protease .43 2.3.13.1 Ảnh hưởng pH lên hoạt độ CPE protease 43 2.3.13.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt độ CPE protease 43 2.3.14 Phương pháp xác định đạm tổng số phương pháp Kjeldahl 43 2.3.15 Phương pháp xác định đạm formol phương pháp Sorensen 44 2.3.16 Phương pháp khảo sát thủy phân chất protein khác CPE protease 46 2.3.17 Định danh vi khuẩn phương pháp sinh học phân tử 46 2.3.18 Phương pháp xử lí số liệu .47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 48 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính protease cao 48 3.2 Xác định hoạt độ protease số chủng VK chọn .50 3.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học hai chủng CT3 CT7 51 3.3.1 Đặc điểm hình thái 51 3.3.2 Xác định khả sinh enzyme catalase .53 3.3.3 Sơ định danh 53 vi 3.4 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện MT lên khả sinh tổng hợp protease hai chủng Bacillus 53 3.4.1 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy 54 3.4.2 Ảnh hưởng loại chất cảm ứng .55 3.4.2.1 Xác định hàm lượng nitơ tổng số chất cảm ứng 55 3.4.2.2 Ảnh hưởng loại chất cảm ứng .55 3.4.3 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng 57 3.4.4 Ảnh hưởng pH ban đầu 58 3.4.5 Ảnh hưởng nhiệt độ 60 3.4.6 Ảnh hưởng tốc độ lắc .62 3.4.7 Động học trình lên men 63 3.5 Định danh chủng CT3 đến loài sinh học phân tử 67 3.6 Thu nhận CPE protease thô từ dịch nuôi cấy 68 3.6.1 Tách CPE protease từ dịch nuôi cấy tác nhân tủa khác 68 3.6.2 Hoạt độ protease thu nhận tác nhân tủa CPE 69 3.7 Ảnh hưởng số yếu tố lý hóa lên hoạt tính CPE protease thô 70 3.7.1 Ảnh hưởng pH 70 3.7.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 71 3.8 Khảo sát thủy phân chất protein khác chế phẩm protease 73 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78 4.1 Kết luận 78 4.2 Kiến nghị 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 vii DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN CPE Chế phẩm enzyme CPE B Chế phẩm enzyme chủng B amyloliquefaciens CT3 DNS Acid 3,5 - dinitrosalicylic EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid IUBMB International Union of Biochemistry and Molecular Biology KL Khuẩn lạc KHV Kính hiển vi MT Môi trường NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth NF Nitơ formol NS Nấm sợi NT Nitơ tổng OD Mật độ quang PMSF Phenylmetysulfonyfuoride TB Trung bình VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc chung acid amin Hình 1.2 Cơ chế xúc tác enzyme protease Hình 3.1 Vòng phân giải casein chủng VK có hoạt tính protease cao 49 Hình 3.2 Hình thái KL chủng CT3 chủng CT7 52 Hình 3.3 Hình thái tế bào chủng CT3 chủng CT7 52 Hình 3.4 Bào tử chủng CT3 chủng CT7 52 89 PHỤ LỤC 90 Phụ lục Đường chuẩn Tyrosin Tyrosine (µmol/ml) OD (660nm) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0,000 0,257 0,449 0,709 0,905 1,158 Đồ thị đường chuẩn Tyrosin Phụ lục Đường chuẩn Albumin Nồng độ protein (µg/ml) 50 100 150 200 250  OD (750nm) 0,231 0,398 0,651 0,801 1,090 Đồ thị đường chuẩn Albumin 91 Phụ lục Đồ thị tương quan tuyến tính OD 620 mật độ tế bào Đồ thị tương quan tuyến tính OD 620 mật độ tế bào OD (620nm) 0,000 0,109 0,212 0,306 0,400 0,498 Mật độ tế bào (CPU/ml) x 107 0,000 2,305 4,460 6,375 8,725 11,200 Phụ lục Kết hàm lượng Nitơ tổng số nguyên liệu khảo sát Trọng Thí VTKtb VTTtb Nguyên liệu HSHC lượng nghiệm (ml) (ml) (g) 0,1 11,1 6,1 0,95 Bột cá Bột đậu nành Casein Peptone N tổng (g/100g NL) 6,65 0,1 0,1 11,2 11,1 6,3 6,1 0,95 0,95 6,52 6,65 0,1 11,3 6,9 1,05 6,47 0,1 11,3 7,0 1,05 6,32 0,1 11,2 6,9 1,05 6,32 0,1 11,2 1,2 0,995 13,93 0,1 11,3 1,2 0,995 14,07 0,1 11,0 1,1 0,995 13,79 0,1 0,1 0.1 11,1 11,2 11,2 1,3 1,3 1,2 1,05 1,05 1,05 14,41 14,55 14,70 TB Sai số 6,61 0,08 6,37 0,09 13,93 0,14 14,55 0,15 92 Phụ lục Hoạt độ protease chủng VK tuyển chọn Thời gian (giờ) 24 48 72 96 Kí hiệu chủng CT1 CT3 CT4 CT7 CT18 CT19 CT25 CT32 CT42 CT1 CT3 CT4 CT7 CT18 CT19 CT25 CT32 CT42 CT1 CT3 CT4 CT7 CT18 CT19 CT25 CT32 CT42 CT1 CT3 CT4 CT7 CT18 CT19 CT25 CT32 CT42 Pha loãng (lần) 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 Lần 0,135 0,137 0,087 0,127 0,110 0,107 0,122 0,099 0,128 1,232 0,288 0,241 0,275 0,246 0,251 0,247 0,246 0,264 0,257 0,234 0,175 0,184 0,184 0,190 0,242 0,237 0,178 0,140 0,157 0,103 0,130 0,05 0,069 0,123 0,108 0,075 ∆ OD Lần 0,138 0,138 0,086 0,127 0,108 0,108 0,124 0,097 0,129 0,233 0,287 0,245 0,272 0,240 0,250 0,245 0,251 0,261 0,258 0,232 0,177 0,187 0,187 0,187 0,242 0,236 0,179 0,144 0,148 0,102 0,129 0,051 0,070 0,122 0,107 0,074 Lần 0,14 0,138 0,085 0,124 0,110 0,107 0,126 0,097 0,13 0,233 0,289 0,241 0,269 0,244 0,249 0,246 0,257 0,265 0,256 0,233 0,177 0,185 0,185 0,189 0,245 0,235 0,179 0,141 0,146 0,101 0,129 0,053 0,071 0,125 0,109 0,077 Hoạt độ protease (UI/ml) Lần Lần Lần TB Sai số 0,859 0,878 0,890 0,876 0,016 0,871 0,878 0,878 0,876 0,004 0,553 0,547 0,541 0,547 0,006 0,808 0,789 0,776 0,791 0,016 0,700 0,687 0,700 0,695 0,007 0,681 0,687 0,681 0,693 0,004 0,776 0,789 0,801 0,789 0,013 0,630 0,617 0,617 0,621 0,007 0,814 0,820 0,827 0,820 0,006 1,476 1,482 1,482 1,480 0,004 1,832 1,825 1,838 1,832 0,006 1,533 1,558 1,533 1,541 0,015 1,749 1,730 1,711 1,730 0,019 1,565 1,526 1,552 1,584 0,019 1,596 1,590 1,584 1,590 0,006 1,571 1,558 1,565 1,565 0,006 1,596 1,596 1,635 1,609 0,022 1,679 1,685 1,685 1,683 0,004 1,635 1,641 1,628 1,635 0,006 1,488 1,476 1,432 1,482 0,006 1,113 1,126 1,126 1,112 0,007 1,170 1,189 1,177 1,179 0,01 0,852 0,846 0,840 0,846 0,006 1,208 1,189 1,202 1,200 0,01 1,539 1,558 1,507 1,546 0,011 1,507 1,501 1,495 1,501 0,006 1,132 1,138 1,138 1,136 0,004 0,890 0,916 0,897 0,901 0,013 0,999 0,941 0,929 0,956 0,037 0,655 0,649 0,642 0,649 0,006 0,827 0,820 0,820 0,823 0,004 0,318 0,324 0,337 0,336 0,01 0,439 0,445 0,452 0,445 0,006 0,782 0,776 0,795 0,784 0,01 0,687 0,681 0,693 0,687 0,006 0,490 0,471 0,477 0,479 0,01 93 Phụ lục Ảnh hưởng MT nuôi cấy đến hoạt độ protease chủng Bacillus Môi trường MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 Kí Pha hiệu loãng chủng (lần) CT3 20 ∆ OD Hoạt độ protease (UI/ml) Lần Lần Lần Lần Lần Lần TB Sai số 0,260 0,258 0,261 1,654 1,641 1,660 1,652 0,010 CT7 CT3 CT7 CT3 20 20 20 20 0,245 0,222 0,230 0,300 0,243 0,218 0,226 0,304 0,240 0,218 0,224 0,299 1,558 1,412 1,463 1,908 1,546 1,387 1,437 1,934 1,526 1,387 1,425 1,902 1,543 1,395 1,442 1,914 0,016 0,015 0,019 0,017 CT7 CT3 CT7 20 20 20 0,281 0,288 0,273 0,282 0,289 0,271 0,281 0,288 0,272 1,787 1,832 1,736 1,794 1,838 1,724 1,787 1,832 1,730 1,789 1,834 1,730 0,004 0,004 0,006 CT3 20 0,220 0,233 0,227 1,399 1,482 1,444 1,442 0,041 CT7 20 0,211 0,210 0,207 1,342 1,336 1,317 1,331 0,013 Phụ lục Ảnh hưởng loại cất cảm ứng đến hoạt độ protease chủng Bacillus ∆ OD Hoạt độ protease (UI/ml) Cơ chất Kí hiệu chủng Pha loãng (lần) Đối chứng CT3 20 0,119 0,125 0,122 0,757 0,795 CT7 20 0,137 0,136 0,136 0,871 Bột đậu nành CT3 20 0,316 0,315 0,319 CT7 20 0,279 0,280 CT3 20 0,231 CT7 20 CT3 CT7 Lần Lần Lần Lần Lần Lần TB Sai số 0,776 0,776 0,019 0,865 0,865 0,867 0,004 2,010 2,003 2,029 2,014 0,013 0,281 1,775 1,781 1,787 1,781 0,006 0,229 0,226 1,469 1,456 1,437 1,454 0,016 0,222 0,220 0,223 1,412 1,399 1,418 1,410 0,010 20 0,307 0,309 0,307 1,953 1,965 1,953 1,957 0,007 20 0,281 0,281 0,283 1,787 1,787 1,800 1,791 0,007 Pepton Casein 94 Phụ lục Ảnh hưởng hảm lượng bột đậu nành đến hoạt độ protease chủng Bacillus Nồng độ bột đậu nành (%) Pha Kí hiệu loãng chủng (lần) CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 CT7 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 Lần 0,276 0,223 0,310 0,246 0,340 0,256 0,318 0,272 0,259 0,302 0,202 0,240 ∆ OD Lần 0,274 0,220 0,315 0,248 0,342 0,262 0,312 0,270 0,264 0,302 0,206 0,236 Lần 0,274 0,223 0,311 0,242 0,344 0,257 0,318 0,270 0,268 0,301 0,203 0,239 Hoạt độ protease (UI/ml) Lần Lần Lần Sai TB số 1,755 1,743 1,743 1,747 0,007 1,418 1,399 1,418 1,412 0,011 1,972 2,003 1,978 1,984 0,017 1,565 1,577 1,539 1,560 0,019 2,162 2,175 2,188 2,175 0,013 1,628 1,660 1,635 1,643 0,202 2,023 1,984 2,023 2,010 0,022 1,730 1,717 1,717 1,721 0,007 1,647 1,679 1,705 1,677 0,209 1,921 1,921 1,914 1,919 0,004 1,285 1,310 1,291 1,295 0,013 1,526 1,501 1,520 1,516 0,013 Phụ lục Ảnh hưởng pH ban đầu đến hoạt độ protease chủng Bacillus pH 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 Pha loãng (lần) 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 CT7 20 Kí hiệu chủng Lần 0,196 0,223 0,258 0,273 0,340 0,306 0,382 0,287 0,373 0,294 0,315 0,246 0,308 ∆ OD Lần 0,199 0,218 0,262 0,274 0,338 0,305 0,380 0,290 0,369 0,291 0,319 0,247 0,311 Lần 0,199 0,223 0,254 0,268 0,337 0,305 0,378 0,287 0,368 0,291 0,322 0,246 0,310 Hoạt độ protease (UI/ml) Lần Lần Lần Sai TB số 1,247 1,266 1,266 1,259 0,011 1,418 1,387 1,418 1,408 0,018 1,641 1,666 1,615 1,641 0,025 1,736 1,743 1,705 1,728 0,020 2,162 2,150 2,143 2,152 0,010 1,946 1,940 1,940 1,942 0,004 2,430 2,417 2,404 2,417 0,013 1,825 1,844 1,825 1,832 0,011 2,372 2,347 2,341 2,353 0,017 1,870 1,851 1,851 1,857 0,011 2,003 2,029 2,048 2,027 0,022 1,565 1,571 1,565 1,567 0,004 1,959 1,978 1,972 1,970 0,010 0,124 0,124 0,130 0,789 0,789 0,827 0,801 0,022 95 Phụ lục 10 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease chủng Bacillus Nhiệt độ (0C) Kí Pha ∆ OD Hoạt độ protease (UI/ml) hiệu loãng Sai số chủng (lần) Lần Lần Lần Lần Lần Lần TB CT3 20 0,279 0,281 0,281 1,775 1,787 1,787 1,783 0,007 CT7 20 0,223 0,228 0,223 1,418 1,450 1,418 1,429 0,018 CT3 20 0,384 0,382 0,383 2,442 2,430 2,436 2,436 0,006 CT7 20 0,306 0,303 0,309 1,946 1,927 1,965 1,946 0,019 CT3 20 0,351 0,351 0,348 2,232 2,232 2,213 2,226 0,011 CT7 20 0,316 0,321 0,317 2,137 2,169 2,143 2,023 0,017 CT3 20 0,339 0,334 0,339 2,156 2,124 2,156 2,146 0,018 CT7 20 0,287 0,288 0,287 1,825 1,832 1,825 1,828 0,004 CT3 20 0,291 0,291 0,287 1,851 1,851 1,825 1,842 0,015 CT7 20 0,268 0,263 0,262 1,705 1,673 1,666 1,681 0,020 25 30 35 40 45 Phụ lục 11 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến hoạt độ protease chủng Bacillus Tốc độ lắc (vòng/phút) Kí hiệu chủng Pha ∆ OD Hoạt độ protease (UI/ml) loãng (lần) Lần Lần Lần Lần Lần Lần TB Sai số CT3 20 0,315 0,316 0,307 2,003 2,010 1,953 1,989 0,031 CT7 20 0,269 0,267 0,261 1,711 1,689 1,660 1,690 0,026 CT3 20 0,343 0,343 0,338 2,182 2,182 2,150 2,171 0,018 CT7 20 0,286 0,284 0,285 1,819 1,806 1,813 1,813 0,006 CT3 20 0,377 0,384 0,381 2,398 2,442 2,423 2,421 0,022 CT7 20 0,319 0,318 0,319 2,093 2,086 2,093 2,040 0,024 CT3 20 0,345 0,349 0,346 2,194 2,220 2,201 2,205 0,013 CT7 20 0,317 0,320 0,323 2,016 2,035 2,054 2,035 0,019 CT3 20 0,331 0,333 0,332 2,105 2,118 2,112 2,112 0,006 CT7 20 0,288 0,293 0,288 1,832 1,864 1,832 1,842 0,018 110 130 150 180 200 96 Phụ lục 12 Động học trình lên men Phụ lục 12.1 Hoạt độ chủng Bacillus theo thời gian Thời gian (giờ) 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 Kí hiệu chủng Pha loãng (lần) CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 CT7 CT3 CT7 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 Lần 0,023 0,027 0,033 0,035 0,095 0,062 0,152 0,138 0,294 0,207 0,362 o,258 0,391 0,292 0,383 0,317 0,377 0,314 0,372 0,316 0,362 0,223 0,329 0,212 0,284 0,189 0,241 0,202 0,208 0,182 ∆ OD Lần 0,029 0,030 0,040 0,041 0,090 0,070 0,149 0,141 0,296 0,205 0,364 0,262 0,387 0,290 0,381 0,320 0,378 0,312 0,376 0,309 0,357 0,223 0,331 0,210 0,284 0,190 0,246 0,204 0,204 0,180 Lần 0,031 0,031 0,035 0,029 0,094 0,061 0,154 0,136 0,300 0,209 0,363 0,259 0,395 0,291 0,382 0,323 0,379 0,316 0,374 0,314 0,356 0,222 0,335 0,211 0,280 0,192 0,240 0,203 0,207 0,181 Lần 0,147 0,172 0,213 0,223 0,601 0,394 0,967 0,878 1,870 1,317 2,302 1,641 2,487 1,857 2,436 2,016 2,398 1,997 2,366 2,010 2,302 1,418 2,093 1,348 1,806 1,202 1,533 1,285 1,323 1,158 Hoạt độ protease (UI/ml) Lần Lần TB Sai số 0,183 0,198 0,176 0,026 0,191 0,197 0,187 0,013 0,257 0,220 0,230 0,024 0,261 0,184 0,223 0,038 0,572 0,601 0,591 0,017 0,445 0,388 0,409 0,031 0,948 0,979 0,965 0,016 0,897 0,865 0,880 0,016 1,883 1,908 1,887 0,019 1,304 1,329 1,317 0,013 2,315 2,309 2,309 0,006 1,666 1,647 1,652 0,013 2,461 2,512 2,487 0,025 1,844 1,851 1,851 0,006 2,423 2,340 2,340 0,006 2,035 2,054 2,035 0,019 2,404 2,411 2,404 0,006 1,984 2,010 1,997 0,013 2,391 2,379 2,379 0,013 1,965 1,997 1,991 0,023 2,271 2,264 2,279 0,020 1,418 1,412 1,416 0,004 2,105 2,131 2,109 0,019 1,336 1,342 1,342 0,006 1,806 1,781 1,798 0,015 1,208 1,221 1,221 0,010 1,565 1,526 1,541 0,020 1,297 1,291 1,291 0,006 1,297 1,317 1,321 0,013 1,145 1,151 1,151 0,006 97 Phụ lục 12.2 Sinh trưởng chủng Bacillus theo thời gian Kí hiệu chủng CT3 CT7 Thời gian 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 Lần 0,667 0,921 1,669 1,876 1,981 1,976 1,802 1,766 1,685 1,578 1,516 1,483 1,353 1,233 1,289 0,712 1,283 1,812 2,158 2,146 2,028 1,930 1,843 1,838 1,785 1,621 1,639 1,597 1,582 1,559 OD Lần 0,668 0,920 1,665 1,871 1,982 1,971 1,807 1,767 1,688 1,579 1,513 1,488 1,351 1,238 1,285 0,715 1,285 1,815 2,156 2,145 2,024 1,934 1,841 1,837 1,787 1,617 1,635 1,598 1,583 1,551 Lần 0,667 0,918 1,666 1,873 1,985 1,973 1,805 1,777 1,688 1,574 1,505 1,485 1,354 1,238 1,286 0,716 1,286 1,816 2,159 2,142 2,029 1,938 1,846 1,831 1,783 1,626 1,635 1,598 1,582 1,558 TB Sai số 0,667 0,920 1,667 1,873 1,983 1,973 1,805 1,770 1,687 1,577 1,511 1,485 1,353 1,236 1,287 0,714 1,285 1,814 2,158 2,144 2,027 1,934 1,843 1,835 1,785 1,621 1,636 1,598 1,582 1,556 0,001 0,002 0,002 0,003 0,002 0,003 0,003 0,006 0,002 0,003 0,006 0,003 0,002 0,003 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,003 0,004 0,003 0,004 0,002 0,005 0,002 0,001 0,001 0,004 98 Phụ lục 12.3 pH môi trường nuôi cấy chủng Bacillus theo thời gian Chủng CT3 CT7 Thời gian 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 pH Lần Lần Lần TB Sai số 7,03 7,20 7,44 7,94 8,25 8,45 8,65 8,67 8,68 8,63 8,53 8,39 8,37 8,35 8,29 6,57 6,76 7,17 7,28 7,54 7,85 8,09 8,34 8,31 8,22 8,20 8,18 8,07 8,03 7,90 7,04 7,23 7,45 7,92 8,28 8,46 8,62 8,66 8,68 8,67 8,53 8,39 8,38 8,35 8,28 6,58 6,78 7,15 7,30 7,55 7,86 8,08 8,35 8,31 8,22 8,21 8,17 8,07 8,01 7,96 7,06 7,28 7,44 7,92 8,27 8,46 8,62 8,66 8,68 8,65 8,52 8,42 8,38 8,34 8,28 6,58 6,75 7,14 7,30 7,56 7,87 8,10 8,35 8,32 8,21 8,22 8,16 8,10 8,00 7,94 7,04 7,24 7,44 7,93 8,27 8,46 8,63 8,66 8,68 8,65 8,53 8,40 8,38 8,35 8,28 6,58 6,76 7,15 7,29 7,55 7,86 8,09 8,35 8,31 8,22 8,21 8,17 8,08 8,01 7,93 0,02 0,04 0,01 0,01 0,02 0,01 0,02 0,01 0,00 0,02 0,01 0,02 0,01 0,01 0,01 0,01 0,02 0,02 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,02 0,02 0,03 99 Phụ lục 13 Hoạt độ protease CPE protease với tác nhân tủa khác Pha loãng (lần) Tác nhân tủa ∆ OD Hoạt độ protease (UI/100ml) Lần Lần Lần Lần Lần Lần Sai số TB Etanol 1000 0,402 0,400 0,404 127,97 127,23 128,33 127,84 0,56 Acetone Sulphat amon 1000 0,384 0,381 0,379 122,10 121,00 128,33 121,24 0,76 1000 0,394 0,395 0,397 125,40 125,77 126,13 125,77 0,37 Phụ lục 14 Hoạt độ protease CPE protease với tác nhân tủa khác Tác nhân tủa ∆ OD Hoạt độ protease (UI/g) Pha loãng (lần) Lần Lần Lần Lần Lần Lần TB Sai số Acetone 400 0,552 0,558 0,555 59,40 60,87 59,84 60,04 0,75 Etanol 400 0,595 0,589 0,588 66,00 64,97 64,68 65,22 0,69 Sulphat amon 400 0,588 0,583 0,590 63,07 62,92 63,65 63,21 0,39 Phụ lục 15 Hàm lượng protein CPE protease với tác nhân tủa khác ∆ OD Hàm lượng protein (mg protein/g CPE) Tác nhân tủa Pha loãng (lần) Lần Lần Lần Lần Acetone 400 0,389 0,387 0,384 186,00 184,00 182,00 184,00 2,00 Etanol 400 0,368 0,375 0,372 176,00 178,00 178,00 177,33 1,15 Sulphat amon 400 0,374 0,384 0,381 178,00 182,00 182,00 180,67 2,31 Lần Lần TB Sai số Phụ lục 16 Ảnh hưởng pH lên hoạt tính CPE B pH Pha loãng (lần) 10 11 400 400 400 400 400 400 400 ∆ OD Lần Lần Lần Hoạt độ protease (UI/g) Lần Lần Lần TB Sai số 0,273 0,459 0,505 0,586 0,526 0,454 0,380 34,76 58,37 64,24 74,51 66,88 57,79 48,40 0,271 0,456 0,498 0,580 0,529 0,454 0,379 0,269 0,460 0,506 0,579 0,535 0,458 0,381 34,47 57,93 63,36 73,77 67,32 57,97 48,25 34,17 58,93 64,39 73,63 68,05 58,23 48,40 34,47 58,27 64,00 73,97 67,42 57,94 48,35 0,30 0,31 0,56 0,47 0,59 0,25 0,09 100 Phụ lục 16 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính CPE B Nhiệt độ (0C) Pha loãng (lần) 35 40 45 50 55 60 65 70 400 400 400 400 400 400 400 400 Lần 0,559 0,662 0,702 0,613 0,386 0,207 0,075 0,010 ∆ OD Lần 0,554 0,667 0,697 0,618 0,381 0,210 0,077 0,010 Lần 0,560 0,666 0,701 0,617 0,382 0,199 0,069 0,020 Lần 71,13 84,19 89,32 78,03 49,13 26,40 9,53 1,32 Hoạt độ protease (UI/g) Lần Lần TB Sai số 70,40 71,28 70,94 0,47 84,77 84,77 84,58 0,33 88,73 89,17 89,07 0,31 78,61 78,47 78,37 0,30 48,40 48,55 48,69 0,39 26,69 25,37 26,15 0,69 9,83 8,80 9,39 0,53 1,32 2,49 1,71 0,68 Phụ lục 17 Hàm lượng Nitơ formol tạo thành chất bột cá (g/l) VNaOH (ml) Cơ chất Thời gian (giờ) Lần Bột cá 10 11 12 13 14 5,9 6,3 7,2 8,3 9,2 9,8 10,2 11,1 11,3 11,7 12,4 12,4 12,4 12,5 12,6 Lần Lần 5,6 6,2 7,4 8,4 9,4 9,7 10,3 10,8 11,5 11,7 12,4 12,4 12,5 12,4 12,5 5,7 6,3 7,0 8,1 9,1 9,7 10,3 11,0 11,4 11,8 12,3 12,4 12,4 12,4 12,3 Hệ số hiệu chỉnh 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 Lần Lần Lần TB Nitơ formol tạo thành (g/l) 0,164 0,176 0,201 0,231 0,256 0,273 0,284 0,309 0,315 0,326 0,345 0,345 0,345 0,348 0,351 0,156 0,173 0,206 0,234 0,262 0,270 0,287 0,301 0,320 0,326 0,345 0,345 0,348 0,345 0,348 0,159 0,176 0,195 0,226 0,254 0,270 0,287 0,306 0,318 0,329 0,343 0,345 0,345 0,345 0,343 0,160 0,175 0,201 0,230 0,257 0,271 0,286 0,305 0,318 0,327 0,344 0,345 0,346 0,346 0,347 0,000 0,015 0,041 0,070 0,097 0,111 0,126 0,145 0,158 0,167 0,184 0,185 0,186 0,186 0,187 Nitơ formol (g/l) 101 Phụ lục 18 Hàm lượng Nitơ formol tạo thành chất casein (g/l) Cơ chất Thời gian (giờ) Casein 10 11 12 13 14 VNaOH (ml) Lần Lần Lần 4,7 6,4 6,8 7,5 8,2 9,4 10,6 12,1 14,4 14,4 14,5 14,7 14,6 14,5 14,5 4,8 6,5 6,8 7,6 8,3 9,6 10,8 12,0 14,4 14,4 14,4 14,3 14,5 14,5 14,6 4,6 6,5 6,7 7,7 8,3 9,4 10,8 12,2 14,5 14,4 14,4 14,4 14,3 14,5 14,5 Hệ số hiệu chỉnh 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 Nitơ formol (g/l) Lần Lần Lần TB 0,131 0,178 0,189 0,209 0,228 0,262 0,295 0,337 0,401 0,401 0,404 0,410 0,407 0,404 0,404 0,128 0,181 0,187 0,215 0,231 0,262 0,301 0,340 0,404 0,401 0,401 0,401 0,398 0,404 0,404 0,131 0,180 0,188 0,212 0,230 0,264 0,299 0,337 0,402 0,401 0,402 0,403 0,403 0,404 0,405 0,134 0,181 0,189 0,212 0,231 0,267 0,301 0,334 0,401 0,401 0,401 0,398 0,404 0,404 0,407 Nitơ formol tạo thành (g/l) 0,000 0,049 0,057 0,081 0,099 0,133 0,168 0,206 0,271 0,270 0,271 0,272 0,272 0,273 0,274 Phụ lục 19 Hàm lượng Nitơ formol tạo thành chất bột đậu nành (g/l) Cơ chất Đậu nành Thời gian (giờ) 10 11 12 13 14 VNaOH (ml) Lần 5,3 5,8 6,2 6,7 7,5 8,0 8,8 8,9 9,7 10,6 11,0 11,2 11,2 11,3 11,4 Lần 5,2 5,7 6,2 6,8 7,6 7,9 8,7 9,0 9,5 10,5 11,2 11,0 11,3 11,1 11,3 Lần 5,2 5,8 6,2 6,8 7,7 8,2 8,7 9,0 9,5 10,5 11,2 11,3 11,2 11,2 11,2 Hệ số hiệu chỉnh 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 0,95 Nitơ formol tạo thành (g/l) Nitơ formol (g/l) Lần 0,148 0,162 0,173 0,187 0,209 0,223 0,245 0,248 0,270 0,295 0,306 0,312 0,312 0,315 0,318 Lần 0,145 0,159 0,173 0,189 0,212 0,220 0,242 0,251 0,265 0,293 0,312 0,306 0,315 0,309 0,315 Lần 0,145 0,162 0,173 0,189 0,215 0,228 0,242 0,251 0,265 0,293 0,312 0,315 0,312 0,312 0,312 TB 0,146 0,161 0,173 0,188 0,212 0,224 0,243 0,250 0,267 0,294 0,310 0,311 0,313 0,312 0,315 0,000 0,015 0,027 0,042 0,066 0,078 0,097 0,104 0,121 0,148 0,164 0,165 0,167 0,166 0,169 102 103 [...]... các nhóm protease 12 Bảng 3.1 Đường kính vòng phân giải casein của các chủng VK phân lập 48 Bảng 3.2 Hoạt độ protease của các chủng VK 50 Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái của hai chủng CT3 và CT7 51 Bảng 3.4 Tóm tắt một số đặc điểm sinh học của chủng CT3 và chủng CT7 53 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của MT nuôi cấy đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus 54 Bảng 3.6 Hàm lượng nitơ tổng số của các... chọn các chủng Bacillus có khả năng sinh tổng hợp protease cao  Đối tượng nghiên cứu: Các chủng Bacillus phân lập từ các mẫu đất vườn khác nhau ở phường Hiệp Bình Chánh, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh  Nhiệm vụ của đề tài - Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus sinh protease có hoạt độ cao từ các mẫu đất vườn - Nghiên cứu đặc điểm hình thái và một số đặc tính sinh học của các chủng đã chọn... keo của tế bào chất Trong đó, phospho và lưu huỳnh có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình sinh tổng hợp protease Các photphase vô cơ có ảnh hưởng không tốt đến sự sinh tổng hợp protease Tuy nhiên, KH 2 PO 4 thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp do tính chất đệm của nó Lưu huỳnh có ảnh hưởng khác nhau lên quá trình sinh tổng hợp protease, nó có vai trò điều hòa quá trình tổng hợp protease của. .. có thể lựa chọn bổ sung các cơ chất thích hợp nhằm thu lượng lớn protease cần thiết một cách nhanh chóng và khoa học [7] 21 1.3.2.2 Ảnh hưởng của yếu tố MT lên khả năng sinh tổng hợp protease  Nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzyme của VSV cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp Tùy từng chủng VSV mà nhiệt độ thích hợp khác nhau NS thường phát triển ở khoảng... đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus 56 Bảng 3.8 Ảnh hưởng nồng độ bột đậu nành đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus 57 Bảng 3.9 Ảnh hưởng pH ban đầu đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus 59 Bảng 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus 61 Bảng 3.11 Ảnh hưởng chế độ lắc đến hoạt độ protease 62 của 2 chủng Bacillus ... đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus 58 Đồ thị 3.2 Ảnh hưởng pH ban đầu đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus 59 Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus 61 Đồ thị 3.4 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến hoạt độ protease của 2 chủng Bacillus 63 Đồ thị 3.5 Động học quá trình lên men của chủng CT3 65 Đồ thị 3.6 Động học quá trình lên men của chủng CT7 ... cứu một số đặc tính của enzyme, tuy nhiên vẫn còn hạn chế do giá thành chế phẩm enzyme còn cao 2 Cần tiếp tục nghiên cứu làm hạ giá thành chế phẩm enzyme và đưa ra giải pháp ứng dụng phù hợp điều kiện sản xuất thực tế ở Việt Nam Chính vì những lí do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của một số chủng Bacillus. ”  Mục tiêu của đề tài: Tuyển chọn các chủng. .. ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của Bacillus 1.3.2.1 Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng Số loại và tỷ lệ các thành phần dinh dưỡng của MT có ý nghĩa quyết định đến khả năng sinh tổng hợp protease ở VSV nói chung, VK Bacillus nói riêng Để tăng lượng protease trong MT cần lựa chọn nguồn carbon, nguồn nitrogen, muối khoáng thích hợp, chọn tỷ lệ thích hợp các thành phần này và... định thì sự phát triển của VSV cũng tăng theo Đối với nhiều VSV, thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiềm phát và nâng cao sinh khối Lượng oxy thích hợp cho quá trình tổng hợp protease của các VSV khác nhau Trong một số trường hợp thiếu oxy tuy có kìm hãm sự phát triển của VSV nhưng lại tăng quá trình tổng hợp protease Sự hiếu khí mạnh làm kìm hãm sự tổng hợp protease [16] Ở MT bề... ta còn thấy sự có mặt của nhiều yếu tố khoáng như: magiê, natri, sắt, Các VSV có thể lấy các chất khoáng này từ MT hay được bổ sung vào MT nuôi cấy một số dạng muối khoáng hoặc có sẵn trong nguyên liệu pha MT [28]  Cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp protease Trong số các enzyme do VSV tổng hợp, một số enzyme trong điều kiện thường được tổng hợp với một lượng rất ít, nhưng hàm lượng của chúng có thể tăng ... cứu đề tài Khảo sát khả sinh tổng hợp protease số chủng Bacillus. ”  Mục tiêu đề tài: Tuyển chọn chủng Bacillus có khả sinh tổng hợp protease cao  Đối tượng nghiên cứu: Các chủng Bacillus phân... MINH _ Đỗ Thị Thu Nga KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC... 51 3.3.2 Xác định khả sinh enzyme catalase .53 3.3.3 Sơ định danh 53 vi 3.4 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện MT lên khả sinh tổng hợp protease hai chủng Bacillus 53 3.4.1