TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN  PHẠM VĂN HOẠT NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN TẠO MÀNG BC CỦA CHỦNG VI KHUẨN ACETOBACTER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : Vi sinh vật học HÀ NỘI, 2011 Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung thầy cô phòng Vi Sinh khoa Sinh - KTNN tận tình giúp đỡ em thời gian qua Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo, cô giáo khoa Sinh – KTNN tạo điều kiện cho em thực đề tài Cảm ơn tất bạn sinh viên giúp đỡ để hoàn thành khóa luận cách tốt đẹp Hà Nội, ngày tháng năm 2011 Sinh viên Phạm Văn Hoạt Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh ii ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài : “Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường tới trình lên men tạo màng BC chủng vi khuẩn Acetobacter ” thực hiện, trùng lặp với tác giả khác Nếu sai xin hoàn toàn chịu trách nhiệm Hà Nội, ngày tháng năm 2011 Sinh viên Phạm Văn Hoạt Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh iii ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC MỤC LỤC Lời cảm ơn Bản cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt, bảng, hình vẽ TÓM TẮT CÔNG TRÌNH MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Mục tiêu đề tài Nội dung đề tài Ý nghĩa đề tài NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lược sử nghiên cứu 1.2 Phân loại Acetobacter 1.2.1 Các tiêu chuẩn phân loại Acetobacter 1.2.2 Phân loại vi khuẩn Acetobacter 1.3 Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter 1.3.1 Đặc điểm hình thái 1.3.2 Đặc điểm khuẩn lạc 1.3.3 Đặc điểm màng vi khuẩn Acetobacter môi trường lỏng 1.3.4 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn Acetobacte 1.3.5 Con đường chuyển hoá cacbon 1.4 Vị trí phân loại đặc điểm Acetobacter xylinum 10 1.4.1 Vị trí phân loại Acetobacter xylinum 10 Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh iv ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC 1.4.2 Đặc điểm Acetobacter xylinum 10 1.4.3 Màng BC vi khuẩn Acetobacter xylinum 11 1.4.4 Cơ chế tổng hợp màng BC vi khuẩn Acetobacter xylinum 12 1.5 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum 13 1.5.1 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum giới 13 1.5.2 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum Việt Nam 14 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu thiết bị 16 2.1.1 Vi sinh vật 16 2.1.2 Hoá chất thiết bị 16 2.1.2.1 Hoá chất 16 2.1.2.2 Thiết bị …………… 16 2.1.3 Môi trường 17 2.1.3.1 Môi trường phân lập giống (MT1) 17 2.1.3.2 Môi trường nhân giống (MT2) 17 2.1.3.3 Môi trường nghiên cứu khả tạo màng 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Phương pháp vi sinh 18 2.2.1.1 Phân lập chủng Acetobacter theo phương pháp truyền thống (Phương pháp Vinogradski Beijerinck 18 2.2.1.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái cách xếp tế bào tiêu nhuộm kép 19 2.2.1.3 Tuyển chọn chủng Acetobacter cho màng theo phương pháp Graxinop 19 2.2.1.4 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng mỏng 20 2.2.1.5 Phương pháp bảo quản chủng giống môi trường Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh v ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC thạch nghiêng 20 2.2.1.6 Phương pháp nuôi cấy môi trường lỏng 21 2.2.3 Các phương pháp hoá sinh 21 2.2.3.1 Phát hoạt tính catalase 21 2.2.3.2 Phát khả oxy hoá acid acetic 21 2.2.3.3 Phương pháp phát khả tổng hợp cellulose 21 2.2.3.4 Phương pháp xác định khả tổng hợp acid acetic chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1% làm thị màu 22 2.2.4 Phương pháp thống kê xử lý kết 22 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng Acetobacter 24 3.1.1 Hình thái tế bào học chủng vi khuẩn Acetobacter 24 3.1.2 Sinh trưởng môi trường thạch đĩa 25 3.1.3 Sinh trưởng môi trường lỏng 25 3.1.4 Đặc tính sinh hóa vi khuẩn Acetobacter 26 3.1.4.1 Hoạt tính catalase 26 3.1.4.2 Khả chuyển hóa glucose thành acid gluconic 26 3.1.4.3 Kiểm tra khả tổng hợp cellulose 27 3.2 Sự thay đổi màng BC qua thời gian nuôi cấy 28 3.3 Ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC 29 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC 31 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHỤ LỤC 37 Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh vi ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT, BẢNG VÀ HÌNH VẼ Danh mục chữ viết tắt BC : Bacterial cellulose PC : Plant cellulose CFU : Colony Forming Unit CS : Cộng Nxb : Nhà xuất A.xylinum : Acetobacter xylinum MT : Môi trường CNSH : Công nghệ sinh học Danh mục bảng Bảng 1.1 Phân loại nhóm vi khuẩn acetic theo Frateur (1950) Bảng 3.2 Ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC Danh mục hình Hình 1.1 Tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum Hình 1.2 Con đường chuyển hoá cacbon Acetobacter xylinum Hình 2.3 Acetobacter môi trường thạch nghiêng Hình 3.4 Kết nhuộm Gram Actobacter Hình 3.5 Acetobacter môi trường thạch đĩa Hình 3.6 Acetobacter môi trường lỏng Hình 3.7 Hoạt tính catalase chủng Acetobacter Hình 3.8 Khả oxy hóa acetat vi khuẩn Acetobacter Hình 3.9 Kết nhuộm màng BC Hình 3.10 Màng BC sau ngày nuôi cấy Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn thay đổi khối lượng màng BC qua thời gian nuôi cấy Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh vii ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC Hình 3.12 Ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC Hình 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC Hình 3.16a Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC (môi trường nước máy) Hình 3.16b Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC (môi trường nước máy) Hình 3.16c Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC (môi trường nước máy) Hình 3.17 Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC (môi trường nước dừa) Hình 3.18a Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC môi trường nước máy Hình 3.18b Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC môi trường nước máy Hình 3.19 Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC môi trường nước dừa Hình 20 Màng BC chủng Acetobacter xylinum tạo pH =5 t0C = 300C Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh viii ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC TÓM TẮT CÔNG TRÌNH Vi khuẩn Acetobacter chủng có khả tạo màng BC môi trường dịch thể điều kiện nuôi cấy tĩnh Màng BC cấu tạo chuỗi polymer 1,4 glucopyranose mạch thẳng, có cấu trúc hóa học đặc tính học giống với cellulose thực vật có thêm số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn, khả thấm hút nước nhanh, khả polymer hóa lớn Vì màng BC ứng dụng rộng rãi giới nhiều lĩnh vực công nghệ Trong công nghệ thực phẩm sử dụng vi khuẩn Acetobacter tạo màng BC dày để sản xuất thạch dừa, màng để bảo quản thực phẩm Trong công nghiệp giấy, màng BC dùng để sản xuất giấy chất lượng cao, dùng để làm màng lọc nước công nghệ môi trường, làm chất mang đặc biệt cho pin tế bào lượng Trong lĩnh vực mỹ phẩm màng BC dùng làm mặt nạ dưỡng da Trong lĩnh vực y học, màng BC bước đầu nghiên cứu làm màng trị bỏng, da nhân tạo thay da tạm thời, mạch máu nhân tạo Đặc biệt, nhu cầu màng trị bỏng cao phải nhập ngoại với giá thành lớn Công trình tập trung nghiên cứu: Ảnh hưởng điều kiện môi trường nuôi cấy (nhiệt độ, độ pH) đến khả tạo màng BC chủng vi khuẩn A.xylinum với mục đích tìm nhiệt độ, độ pH thích hợp cho tạo màng Nội dung gồm: Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng A.xylinum; nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ, độ pH ban đầu tới tạo màng BC chủng A.xylinum Công trình cho phép lựa chọn điều kiện môi trường nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn A.xylinum tạo màng BC có chất lượng tốt Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh ix ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Như biết kỷ XX kỷ ngành công nghệ thông tin kỷ XXI kỷ ngành công nghệ sinh học Ngày công nghệ sinh học dần trở thành ngành kĩ thuật chủ đạo chiếm giữ vị chí cao nhiều quốc gia giới Là phận ngành CNSH, công nghệ Vi sinh phát triển mạnh mẽ với thành tựu lớn có ý nghĩa đời sống, ngành: công nghiệp, nông nghiệp, y học Khó tìm lĩnh vực công nghệ sinh học mà lại không liên quan tới vi sinh vật Cho đến Acetobacter đánh giá loại vi khuẩn có khả sinh màng BC hiệu tự nhiên Vi khuẩn Acetobacter thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc, hoá dưỡng thuộc họ Acetobacteriaceae Vi khuẩn Acetobacter tìm thấy giấm, dịch rượu, nước ép hoa Khi nuôi cấy vi khuẩn môi trường dịch lỏng, chúng hình thành bề mặt lớp màng BC, tập hợp tế bào vi khuẩn liên kết với phân tử cellulose Màng BC cấu tạo chuỗi polymer-1,4 glucopyranose không phân nhánh tổng hợp từ số loài vi khuẩn nuôi cấy chúng môi trường dịch lỏng Màng BC Acetobacter tạo có cấu trúc hóa học đặc tính học giống với cellulose thực vật có thêm số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền học, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, tính đàn hồi lớn, khả thấm hút nước nhanh, khả polymer hóa lớn Vì màng BC ứng dụng rộng rãi giới nhiều lĩnh vực công nghệ Một ứng dụng quan tâm sản xuất màng BC điều trị bỏng tổn thương da [7] Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC glucose, kết hợp đường với acid béo để tạo thành tiền chất nằm màng tế bào Tiền chất tiết nhờ hệ thống lỗ nằm màng tế bào với enzym polymer hoá glucose thành cellulose môi trường dịch thể chúng phát triển thành lớp màng độ dày, mỏng khác tuỳ thuộc vào loài Màng tập hợp tế bào vi khuẩn liên kết với cellulose 3.1.4 Đặc tính sinh hóa vi khuẩn Acetobacter 3.1.4.1 Hoạt tính catalase Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc thấy có tượng sủi bọt khí (hình 3.7) Chứng tỏ oxy giải phóng ra, hay nói cách khác tác dụng enzym catalase phân giải H2O2 theo phương trình a ta lase H O  C   H 2O  O2 Hình 3.7 Hoạt tính catalase chủng Acetobacter Kết phù hợp với ý kiến đưa Walker cs (1942) chứng minh hoạt tính catalase vi khuẩn Acetobacter loài có hoạt tính catalase mạnh [17] 3.1.4.2 Khả chuyển hóa glucose thành acid gluconic Vòng sáng xuất xung quanh khuẩn lạc môi trường có chứa CaCO3 điều cho thấy acid gluconic tạo thành (Hình 3.8) Chúng tham gia phản ứng với CaCO3 để chuyển môi trường từ màu trắng sang không màu H+ + CaCO3 → Ca2+ + H2O + CO2 Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 26 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC Vòng phân giải CaCO3 Hình 3.8 Khả oxy hóa acetat vi khuẩn Acetobacter Kết phù hợp với nghiên cứu Hai-Peng Cheng cs (2002) xác định có mặt acid gluconic tổng hợp cellulose, sản phẩm oxy hoá glucose, tích luỹ pha lag chất quan trọng trình tổng hợp cellulose vi khuẩn Acetobacter [13] 3.1.4.3 Kiểm tra khả tổng hợp cellulose Nhỏ dung dịch Lugol H2SO4 60% lên mặt lớp màng BC xuất màu lam Hình 3.9 Kết nhuộm màng BC Qua hình 3.9 chứng tỏ Acetobacter có khả hình thành màng cellulose Dựa theo khoá phân loại Bergey (1992) [11], tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn acetic Frateur 1950, váo kết khảo sát đặc điểm sinh học loài Acetobacter mà nhận từ phòng thí nghiệm Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 27 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC Vi sinh khoa Sinh - KTNN trường ĐHSP Hà Nội loài Acetobacter xylinum có khả tạo màng sinh học BC sử dụng trị bỏng tổn thương da 3.2 Sự thay đổi màng BC qua thời gian nuôi cấy Khi nuôi cấy Acetobacter xylinum môi trường lỏng trùng 1210C vòng 20 phút, nhận thấy: Trong ngày đầu, vi khuẩn làm quen với môi trường, tích luỹ chất dinh dưỡng lượng cho giai đoạn sinh trưởng Lượng acid bắt đầu hình thành không nhiều làm cho pH môi trường giảm nhẹ Ngày thứ 2, màng BC bắt đầu hình thành bề mặt môi trường, tăng dần đạt khối lượng cực đại vào ngày thứ Sau màng chìm xuống dần khối lượng màng giảm dần bị phân hủy Ngày Hình 3.10 Màng BC sau ngày nuôi cấy Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 28 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp m(g) Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 m(g) 12 15 Ngày Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn thay đổi khối lượng màng BC qua thời gian nuôi cấy Qua thực nghiệm đến số nhận xét sau: Màng BC bắt đầu hình thành từ ngày thứ ổn định dần sau ngày nuôi cấy Môi trường giàu dinh dưỡng màng tiếp tục dày lên, môi trường nghèo dinh dưỡng chìm xuống bị phân huỷ dần Chình chọn sau ngày nuôi cấy thu màng (hình 3.11) 3.3 Ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC Giá trị pH đo nồng độ ion H+ OH  có môi trường, độ pH ban đầu môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng trực tiếp gián tiếp đến tính chất sinh lý tế bào nên ảnh hưởng đến khả hình thành màng BC vi khuẩn Acetobacter xylinum Để xác định khoảng pH thích hợp cho tế bào sinh trưởng tạo màng BC, tiến hành nuôi cấy vi khuẩn loại môi trường có giá trị pH khác 30oC ngày Qua nhiều lần thi nghiệm kết thu trình bày bảng 3.2 hình 3.12 Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 29 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC Bảng 3.2 Ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC STT pH Đặc điểm màng BC X m δ(%) Cv(%) Màng mỏng khoảng 1mm, 1,245 ± 0,01 0,02 1,61 3,218 ± 0,02 0,03 0,93 3,463± 0,02 0,03 0,87 3,203 ± 0,02 0,04 1,24 dai Màng mỏng – mm, dai, bề mặt nhẵn Màng mỏng – mm, dai, bề mặt nhẵn Màng mỏng – 4mm, dai, bề mặt nhẵn Màng không hình thành - - - Màng không hình thành - - - pH = Hình 3.12 Ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 30 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp m(g) Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC 4.5 3.5 2.5 m(g) 1.5 0.5 pH Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC Từ kết cho thấy: Vi khuẩn Actobacter xylinum sinh trưởng tốt pH = – đạt giá trị cao pH = Giá trị tương ứng với giá trị pH môi trường nước dừa Như để hạn chế tối đa thay đổi nồng độ ion môi trường nuôi cấy đồng thời tạo thành màng BC tốt chọn độ pH = để nuôi cấy chủng Acetobacter xylinum Kết phù hợp với nghiên cứu Hestrin Schramm(1954) xác định giá trị pH tối ưu Chúng tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ đến tạo màng BC chủng vi khuẩn A.xylinum với độ pH = 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC Điều kiện thời tiết khí hậu Miền Bắc nước ta bốn mùa với thay đổi nhiệt độ rõ rệt Nhiệt độ ảnh hưởng đến sinh trưởng mà định đến khả hình thành màng BC chủng A.xylinum Trong trình nuôi cấy, nhiệt độ thấp vi khuẩn sinh trưởng chậm, thời gian nuôi Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 31 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC cấy phải kéo dài làm giảm khả tổng hợp cellulose Nhiệt độ cao dẫn dến hô hấp mạnh ảnh hưởng đến trình tổng hợp cellulose Để xác định nhiệt độ tốt cho trình lên men đồng thời lợi dụng thuận lợi điều kiện khí hậu để sản xuất màng mang lại hiệu kinh tế cao tiến hành nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum pH = tủ ấm với loại môi trường, mức nhiệt độ khác nhau, thu hồi xác định trọng lượng thô màng BC sau ngày nuôi cấy Kết thể bảng 3.2 hình 3.15 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC STT Nhiệt Đặc điểm độ màng BC X m δ (%) Cv (%) - - - 2,634 ± 0.02 0,05 1,90 3,474 ± 0,02 0,04 1,15 3,235 ± 0,02 0,04 1,23 (toC) 20 Không hình thành màng, có sợi cellulose nhỏ, lơ lửng môi trường 25 Màng mỏng(1 – 2mm), dai, bề mặt nhẵn 30 Màng mỏng – 3mm, dai, bề mặt nhẵn 35 Màng mỏng – 3mm, dai, bề mặt nhẵn 40 Không hình thành màng - - - 45 Không hình thành màng - - - 300C Hình 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 32 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp m(g) Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 m(g) 20 25 30 35 40 T0C Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC Từ kết cho thấy chủng Acetobacter xylinum sinh trưởng tổng hợp cellulose thích hợp khoảng nhiệt độ 25 – 35oC Khả hình thành màng cellulose tốt 30oC Nhiệt độ 35oC ức chế hoạt động tổng hợp cellulose Như nhiệt độ nuôi cấy để tạo màng tôt thời gian phù hợp 30oC Màng BC thu từ trình lên men acetic với tham gia vi khuẩn Acetobacter xylinum dùng theo mục đích chế tạo màng sinh học trị bỏng phải đảm bảo yêu cầu sau: đủ mỏng, phải có độ dai, chắc, bề mặt trơn nhẵn, màu sắc sáng trong… Quá trình nuôi cấy thu nhận màng BC phụ thuộc vào nhiều yếu tố tác động, việc nghiên cứu ảnh hưởng đến sinh tổng hợp màng BC cho thời gian tạo màng phù hợp để áp dụng rộng rãi quy mô công nghiệp đem lại lợi ích kinh tế cao Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 33 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum chủng cho màng BC đáp ứng yêu cầu màng sinh học sử dụng trị bỏng 1.2 Sự hình thành màng BC chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum tốt điều kiện nuôi cấy có độ pH = 1.3 Nhiệt độ tốt cho tạo màng BC chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum 300C Đề nghị Do thời gian có hạn nên nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ độ pH tới trình hình thành màng BC chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum Để có màng BC có chất lượng tốt, mang lại hiệu kinh tế cao cần phải tiếp tục nghiên cứu: 2.1 Ảnh hưởng yếu tố môi trường : Pepton, (NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, … đến hình thành màng 2.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy như: tỷ lệ S/V,… 2.3 Các khâu trình xử lý màng BC 2.4 Cách xử lý bảo quản, đóng gói màng Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 34 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1.] Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Đình Quyết, Phạm Văn Ty, (1978) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học Nxb khoa học kĩ thuật [2.] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, (1998) Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục [3.] Nguyễn Thành Đạt, (1999) Cơ sở sinh học vi sinh vật Nxb Giáo dục, [4.] Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào, (1990) Thực hành vi sinh vật học Nxb Giáo dục [5.] Đặng Thị Hồng, (2007) Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn Acetobacter xylinum chế tạo màng sinh học (BC) Luận án thạc sĩ Sinh học ĐHSP Hà Nội [6.] Nguyễn Thuý Hương, (2006) Chọn lọc dùng Acetobacter xylinum thích hợp cho loại môi trường dùng sản xuất cellulose vi khuẩn với quy mô lớn [7.] Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh, (số 361/ 2006) Nghiên cứu đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng Tạp chí Dược học tr 18 – 20 [8.] Chu Văn Mẫn, (2003) Ứng dụng tin học sinh học Nxb ĐHQG Hà Nội [9.] Đinh Thị Kim Nhung, (1996) Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Acetobacter ứng dụng chúng lên men acetic theo phương pháp chìm Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học [10] Nguyễn Thị Nguyệt, (2008) Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng bacterial cellulose làm mặt nạ dưỡng da Luận án thạc sĩ sinh học ĐHSP Hà Nội Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 35 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC [11.] Bergey H, John G Holt, (1992) Bergey’s manual of dererminativa bacteriology Wolters Kluwer health, p.71-84 [12.] Brown E, (2007) Bacterial cellulose Themoplastic polymer nanocomposites Master of sience in chemical engineering, Washington state university [13.] Hai-Peng Cheng, Pei-Ming Wang, Jech-Wei Chen, Wen-Teng Wu, (2002) Cultivation of Acetobacter xylinum for bacterial cellulose production in a modified airlift reactor Vol 35, Biotechnol Appl Biochem, p 125-132 [14.] Jonas, R & Frarad L.F, (1998) Production and application of microbial cellulose Polymer Degradation and Stability 59, 101 – 106 [15.] Shah, J & Brown, R M Jr, (2005) Towards electionic paper displays made from microbial cellulose Applied Microbiology and Biotechnology, 66, 352 – 355 [16.] Wan, W.K & Millon, E, (2005) Poly (vinyl alcohol) – bacterial cellulose nanocomposite V S Pat Appl., Publ US 2005037082 A1, 16 [17.] Walker K T, Toidi.J, ( 1942) The ' Catalase test', with special reference to Acetobacter species Vol 37, The College of Technology, The University of Manchester, p 10-12 Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 36 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC PHỤ LỤC Hình 3.16 a Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC (môi trường nước máy) Hình 3.16b Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC (môi trường nước máy) Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 37 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp pH = pH = Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC pH = pH = pH = pH = Hình 3.16c Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC (môi trường nước máy) Hình 3.17 Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng pH đến hình thành màng BC (môi trường nước dừa) Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 38 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC Hình 3.18a Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC với môi trường nước máy 250C 200C 350C 300C 400C Hình 3.18b Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC với môi trường nước máy Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 39 ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC 300C Hình 3.19 Kết thí nghiệm lần ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành màng BC với môi trường nước dừa Hình 20 Màng BC chủng Acetobacter xylinum tạo thành pH =5 t0C = 300C Phạm Văn Hoạt - K33B Sinh 40 ĐHSP HÀ NỘI [...]... ngành : VI SINH VẬT HỌC Nhằm bổ sung hiểu biết về Acetobacter và màng BC tạo cơ sở cho sản xuất màng trị bỏng, chúng tôi quyết định chọn đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường tới quá trình lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn Acetobacter ” 2 Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC của chủng vi khuẩn A.xylinum 3 Nội dung của đề... tài 3.1 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn A xylinum 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự tạo màng BC của chủng A.xylinum 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH ban đầu tới sự tạo màng BC của chủng vi khuẩn A.xylinum 4 Ý nghĩa của đề tài Tìm ra một số đặc điểm của chủng vi khuẩn A.xylinum Từ đó chọn điều kiện môi trường (pH, nhiệt độ) nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn A.xylinum... sử dụng màng BC từ vi khuẩn A.xylinum ngày càng được quan tâm Có một số các nghiên cứu, công bố liên quan đến A.xylinum sự hình thành BC và ứng dụng màng BC Các công trình mới chỉ bước đầu nghiên cứu quá trình tạo màng, đặc tính cấu trúc màng làm cơ sở chế tạo màng trị bỏng [7], sản xuất thạch dừa Gần đây nhất là nghiên cứu ứng dụng màng BC làm chất nền và giá đỡ để cố định tế bào vi khuẩn của Nguyễn... cho vi khuẩn Acetobacter xylinum là 250C – 350C, pH tối ưu là 4,5 – 6,2 [11] Đặc điểm khuẩn lạc: Trên môi trường đặc, vi khuẩn Acetobacter xylinum hình thành khuẩn lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hoặc gợn sóng, màu trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên, dễ tách khỏi môi trường [5] 1.4.3 Màng BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện. .. các chủng cho màng tốt nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo 2.2.1.4 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter cho màng mỏng Quá trình tuyển chọn các chủng Acetobacter được tuyển chọn thông qua các chỉ tiêu: quan sát quá trình hình thành màng (thời gian tạo màng, đặc điểm của dịch nuôi cấy…), kích thước và hình dạng tế bào khi nhuộm Gram, kiểm tra các đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn Acetobacter. .. Quá trình sinh trưởng của vi khuẩn Acetobacter xylinum diễn ra đồng thời với quá trình hình thành màng trên bề mặt môi trường dịch Lớp màng này chính là hàng rào ngăn cản oxy và chỉ những tế bào tiếp xúc trực tiếp với oxy mới có khả năng tổng hợp cellulose 1.5 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum 1.5.1 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum trên thế giới Vi khuẩn Acetobacter xylinum và màng BC. .. trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường 3.1.3 Sinh trưởng trên môi trường lỏng Vi khuẩn Acetobacter nuôi cấy trong môi trường lỏng hình thành một lờp màng có màu trắng sáng, bề mặt màng nhẵn, có độ dai cao trên bề mặt nuôi cấy (hình 3.6) Acetobacter Acetobacter Hình 3.6 Acetobacter trên môi trường lỏng Vi khuẩn Acetobacter là những loài hiếu khí, khi sống trong môi trường lỏng... ĐHSP HÀ NỘI Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành : VI SINH VẬT HỌC 1.3.3 Đặc điểm màng của vi khuẩn Acetobacter trên môi trường lỏng Trên môi trường lỏng, vi khuẩn Acetobacter tạo thành các loại màng BC có độ dày mỏng, và đặc tính khác nhau Một số loài tạo thành màng dày như sứa, nhẵn, khi lắc chìm xuống đáy bình và hình thành lớp màng mới Một số loài tạo thành màng mỏng như tờ giấy cellofan, dai, nhẵn, khi... tên là “Vinegar”, bắt nguồn từ tiếng Pháp: “Vine” là rượu vang và “aigre” là chua Khi đó, người ta chưa biết vi khuẩn Acetobacter chính là tác nhân của quá trình lên men này Giấm mới chỉ bắt đầu được nghiên cứu từ những năm đầu của thế kỉ XIX Person là người đầu tiên nghiên cứu về giấm và vi khuẩn Acetobacter 1822, ông đã quan sát lớp màng mỏng phát triển trên bề mặt giấm và chứng minh sự có mặt của một... trợ giúp của kính hiển vi đã chứng minh nhận của Kiitzing và Pasteur là hoàn toàn đúng đắn Ông nghiên cứu lớp màng xuất hiện trên bia và rượu vang, ông kết luận: Màng đó được tạo thành do một loại trực khuẩn và ông cũng gọi nó là Mycoderma aceti Từ đó đến nay, nhiều nhà khoa học vẫn tiếp tục nghiên cứu về Acetobacter Các nghiên cứu chủ yếu nhằm mục đích cải tiến và hoàn thiện hơn quá trình lên men giấm, ... ngành : VI SINH VẬT HỌC Nhằm bổ sung hiểu biết Acetobacter màng BC tạo sở cho sản xuất màng trị bỏng, định chọn đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường tới trình lên men tạo màng BC chủng. .. đặc tính sinh học chủng vi khuẩn A xylinum 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ tới tạo màng BC chủng A.xylinum 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng độ pH ban đầu tới tạo màng BC chủng vi khuẩn A.xylinum Ý nghĩa... chủng vi khuẩn Acetobacter ” Mục tiêu đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường nuôi cấy đến khả tạo màng BC chủng vi khuẩn A.xylinum Nội dung đề tài 3.1 Nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng