Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Trong tự nhiên có số vi khuẩn (Acetobacter, Achromobacter, Aerobacter, Agarobacterium, alcaligen…) có khả sản sinh màng cellulose Khi nuôi cấy vi khuẩn môi trường chứa glucose, glyserol, họăc số nguồn cacbon hữu khác chúng có khả hình thành bề mặt lớp màng cellulose sinh học khiết gọi màng sinh học Bacterial Cellulose (BC) Cho đến nay, Acetobacter xylinum đánh giá loài vi khuẩn có khả sinh màng BC hiệu tự nhiên Màng BC tạo thành từ vi khuẩn Acetobacter xylinum có cấu trúc đặc tính học giống cellulose thực vật có thêm số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền học, khả thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, độ thông thoáng tốt, có khả ngăn cản vi khuẩn qua nên ứng dụng nhiều lĩnh vực công nghệ khác sản xuất da nhân tạo sử dụng để ghép da, thay da trị bỏng, sản xuất mặt lạ dưỡng da Ngoài chúng sử dụng rộng rãi công nghiệp thực phẩm, điển hình sản xuất thạch dừa, sản xuất giấy chất lượng cao, tơ nhân tạo [11] Ở Việt Nam nghiên cứu sản xuất sử dụng màng BC điều trị bỏng đối tượng động vật, hy vọng tương lai không xa thử nghiệm ứng dụng người Để làm việc khử khuẩn màng khâu quan trọng Từ lý tiến hành đề tài nghiên cứu: “Lựa chọn phương pháp tối ưu để diệt vi khuẩn Acetobacter xylinum có màng BC” GVHD: Phương Phú Công SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN Mục tiêu đề tài Nghiên cứu phương pháp tối ưu diệt vi khuẩn Acetobacter xylinum có màng BC sau lên men giữ số tính chất lý hóa đặc biệt màng Ý nghĩa lý luận thực tiễn đề tài - Tìm phương pháp tối ưu diệt vi khuẩn Acetobacter xylinum màng BC sau lên men - Nghiên cứu góp phần tạo màng trị bỏng phục vụ đời sống, nhu cầu xã hội Nội dung cần tiến hành - Hoạt hoá chủng A xylinum cung cấp từ phòng thí nghiệm - Nhân giống chủng A xylinum, lên men thu màng BC - Nghiên cứu số tích chất vật lý màng BC tạo từ chủng A xylinum - Nghiên cứu khả diệt khuẩn A xylinum lại màng lựa chọn phương pháp tốt - Nghiên cứu khả vô trùng màng điều kiện bảo quản phòng thí nghiệm GVHD: Phương Phú Công SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN NỘI DUNG CHƯƠNG : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Vai trò Acetobacter xylinum màng BC 1.1.1.Vai trò vi khuẩn Acetobacter xylinum Trong lịch sử, người biết cách làm giấm kinh nghiệm thực tiễn xong chưa hiểu rõ sở khoa học trình tạo giấm, giải thích rượu loãng lại chuyển thành giấm Ngày nay, khẳng định tác nhân trình tạo giấm vi khuẩn Acetobacter hay vi khuẩn giấm, vi khuẩn acetic Vi khuẩn A.xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm hiếu khí bắt buộc, hoá dưỡng thuộc chi Acetobacter, họ Acetobacteraceae Vi khuẩn A.xylinum tìm thấy giấm, dịch rượu, nước ép hoa Khi nuôi cấy vi khuẩn môi trường dịch lỏng, chúng hình thành bề mặt lớp màng cellulose sinh học khiết gọi màng sinh học Bacterial Cellulose, tập hợp tế bào vi khuẩn liên kết với phân tử cellulose 1.1.2.Vai trò màng BC Trên giới màng Bacterial cellulose ứng dụng nhiều lĩnh vực công nghệ khác sản xuất da nhân tạo sử dụng để ghép da, thay da trị bỏng, sản xuất mặt lạ dưỡng da, dùng làm màng phân tách cho trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho pin lượng cho tế bào, dùng làm chất biến đổi độ nhớt sản xuất sợi truyền quang, làm môi trường chất sinh học, thực phẩm hay thay thực phẩm, dùng màng BC để sản xuất giấy điện tử, làm chất cố định protein hay cho sắc kí Đặc biệt Brown dùng BC làm vải đặc biệt [11] Tuy nhiên, ứng dụng thường thấy màng BC dùng ngành dược phẩm mỹ phẩm sản xuất màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ GVHD: Phương Phú Công SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN Hình 1.1: Cấu tạo màng BC 1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả tạo màng Các yếu tố thành phần môi trường, nhiệt độ chế độ thông khí, thay đổi điều kiện nuôi cấy nhân tố quan trọng trình lên men tạo màng 1.2.1 Ảnh hưởng độ thông khí Vi khuẩn Acetobacter xylinum vi khuẩn hiếu khí bắt buộc Điều kiện tiên lên men tạo sinh khối điều kiện thông khí Trong chế trình lên men, lượng oxy cần cung cấp tương đối lớn Trong thực tế độ thông khí định suất BC Vì hình thức sục khí cung cấp oxy sử dụng cánh khuấy lên men động phù hợp cho sản lượng BC cao lên men chìm Lên men tĩnh cần sử dụng dụng cụ có bề mặt rộng, thoáng lớp môi trường mỏng [12] Wanatabe Yamanaka (1995) phát áp suất oxy ảnh hưởng đến khả hình thành cellulose vi khuẩn Cellulose hình thành áp suất oxy thấp có phân nhánh nhiều so với điều kiện áp suất GVHD: Phương Phú Công SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN oxy cao Do ảnh hưởng trực tiếp đến hình dạng độ chịu lực lớp màng BC [18] 1.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ Nhiệt độ thích hợp với vi khuẩn Acetobacter xylinum từ 25-35 C Ở nhiệt độ thấp trình lên men xảy chậm Ở nhiệt độ cao ức chế hoạt động đến mức đình sinh sản tế bào hiệu suất lên men giảm [13] 1.2.3 Ảnh hưởng nguồn C, N, P nguyên tố vi lượng Để trình oxi hóa xẩy nhanh dịch lên men cần cung cấp nguồn chất như: axit acetic, rượu etylic, dung dịch lên men cần bổ sung thêm chất khoáng như: (NH4)2SO4; KH2PO4; MgSO4.7H2O; CaHPO4… Ngoài ra, môi trường dinh dưỡng cần bổ sung thêm vitamin pepton, cao nấm men, cao thịt, nước chiết cà chua… 1.2.4 Độ pH Vi khuẩn Acetobacter xylinum phát triển thuận lợi môi trường có pH thấp Do môi trường nuôi cấy cần bổ sung thêm acid acetic nhằm acid hoá môi trường Đồng thời acid acetic có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn phát triển vi sinh vật có hại [14] 1.3.Các phương pháp khử khuẩn [22] Các phương pháp khử khuẩn gồm hai phương pháp là: khử khuẩn phương pháp vật lý khử khuẩn phương pháp hóa học 1.3.1 Các phương pháp vật lý * Khử khuẩn nóng (nhiệt ẩm) Nguyên lý: Nhiệt ẩm dạng nóng bão hòa áp lực tác nhân vật lý để tiêu diệt tất dạng sống vi sinh vật kể loài có nha bào Nhiệt tạo nóng phá hủy vi sinh vật trình nhờ cộng thêm ẩm có nóng tự không đủ để tiêu diệt vi khuẩn GVHD: Phương Phú Công SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN Hơi nóng nhiệt ẩm có nhờ gia tăng nhiệt độ nước Người ta tạo áp lực lớn áp lực khí để gia tăng nhiệt độ nước nhằm tạo nhiệt nóng cao để phá hủy sức sống vi sinh vật, đồng thời với nóng, độ ẩm làm biến dạng chất protein bên tế bào Với phương pháp hầu hết vi sinh vật bình thường bị giết vài phút nhiệt độ 540C - 5500C Một số loài vi sinh vật có nha bào chịu đựng nhiệt độ 1150C 34h Tuy nhiên loài vi sinh vật sống sót nhiệt độ 1210C 15 phút tiếp xúc * Khử khuẩn nhiệt nóng (sấy khô) Nguồn lượng đốt than hay điện, nhiệt độ buồng sấy tăng dần đạt 1800C Thời gian hấp từ 15 – 45 phút, nhiệt độ phân tử hữu bị phân hủy thành cacbon vô khuẩn tuyệt đối * Khử khuẩn phương pháp đun sôi: Các loại nấm, vi khuẩn chịu nhiệt Đặc biệt loài virut nha bào vi khuẩn sống nước sôi 1000C vài Do không nên khử khuẩn phương pháp đun sôi áp suất khí * Khử khuẩn tia cực tím Tia phóng từ loại đèn thủy ngân có bước sóng dài để hấp thu chất hữu với dụng cụ suốt * Khử khuẩn siêu âm Siêu âm tác dụng với tần số cao dịch, khí không khí gần Trong môi trường lỏng, siêu âm tạo nên gốc hóa học tự H+ gốc có tác dụng oxi hóa khử mạnh, OH- gốc có tác dụng oxi hóa trùng hợp tạo nên oxi già * Khử khuẩn phóng xạ Dùng tia phóng xạ (tia X) tác dụng tia phóng xạ tách electron, biến vật thể thành ion âm dương Áp dụng phương pháp cho GVHD: Phương Phú Công SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN thấy: loài vi khuẩn nhạy cảm tia khác Trên môi trường tia phóng xạ lại tác dụng khác Độ nhạy cảm với tia khác tùy theo loài vi khuẩn, nấm hay virut 1.3.2 Các phương pháp hóa học * Khí ethylene oxide (EO) EO có khả diết chết tất loài vi sinh vật kể nha bào tiếp xúc trực tiếp thời gian định Cơ chế ức chế chuyển hóa bình thường protein trình tái sinh protein Muốn có tác dụng diệt khuẩn, vật liệu phải tác dụng trực tiếp với khí EO Trong thực hành khí EO đơn gây cháy nổ người ta trung hòa với khí khác hydrocacbone hay CO2 Khử khuẩn khí tùy thuộc vào nồng độ, nhiệt độ, độ ẩm thời gian tiếp xúc với khí Khí chứa bình kim loại hỗn hợp gồm 10 – 12% EO Nồng độ EO khử khuẩn là: Cứ 1l buồng khử khuẩn chứa khoảng 450 – 800 mg khí EO EO gây bỏng, khí đắt tiền, trang thiết bị đặc biệt khí dễ nhiễm độc * Khử khuẩn hoạt chất glutaraldehyd Ngoài khí EO người ta dùng hoạt chất glutaraldehyd để khử khuẩn, diệt khuẩn vật liệu, dụng cụ nhạy cảm với nhiệt độ Cách thức áp dụng tương tự khử khuẩn khí EO Thuận lợi: Dễ thấm, dễ xâm nhập, an toàn không gây kích ứng da, không gây hư hỏng dụng cụ, diệt khuẩn nhiệt độ bình thường Khó khăn: Phương pháp phải hoạt hóa cách pha trộn vào dung dịch đệm Có mùi đặc biệt có độc tính nên ảnh hưởng đến người sử dụng * Khử khuẩn loại cồn - Etylic: Sau vài giây tiếp xúc có tác dụng diệt loài vi khuẩn nha bào, ức chế hoạt động virut - Cồn propylic: Diệt khuẩn mạnh nhược điểm kích thích mạnh GVHD: Phương Phú Công SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN * Diệt khuẩn formol Formol chất khử khuẩn độc Trioxymethylene thường khử khuẩn dụng cụ không hấp số máy móc phẫu thuật, đồ nhựa, ống nội khí quản * Các chất khử khuẩn khác - Hypochlorite muối natri có nồng độ khác - Dung dịch cồn : dung dịch 5% sát khuẩn mạnh gây kích ứng da - Nước oxy già 3%: có tác dụng sát khuẩn, làm vết thương bẩn - Acid pesacetic dung dịch 2% - Các aminonium hóa trị 3, phenol dẫn chất - Các kim loại nặng thủy ngân 1.4 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum giới Việt Nam 1.4.1 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylinum giới Hiện nay, vi khuẩn Acetobacter xylinum ứng dụng quan tâm nhiều nhà khoa học giới tập chung theo hai hướng bản: * Hướng : chủ yếu phân lập tuyển chọn, nghiên cứu đặc tính sinh học Acetobacter xylinum từ xác định vị trí phân loại chúng sinh giới * Hướng : nghiên cứu trình sinh tổng hợp, đặc điểm ứng dụng vi khuẩn Acetobacter xylinum Đó nghiên cứu khả sinh tổng hợp cellulose chủng Acetobacter xylinum; ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy đến trình sinh tổng hợp cellulose Mở đầu nghiên cứu R.M.Brown [10]và cs, K.Zaa [20] Gần chế sinh tổng hợp cellulose, hệ enzyme tham gia vào đường GVHD: Phương Phú Công SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN chuyển hóa cacbon vi khuẩn Acetobacter xylinum dần sang tỏ [9], [16], [17] Từ sau nửa kỉ XIX đến có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng màng BC lĩnh vực khác Đặc biệt làm màng trị bỏng, sử dụng màng BC đắp lên vết thương hở, vết bỏng thu kết tốt Wan Millon đăng kí quyền làm màng BC từ Acetobacter xylinum dùng trị bỏng [19] Về sau có nhiều tác giả nghiên cứu hướng 1.4.2 Tình hình nghiên cứu Acetobacter xylium Việt Nam Tại Việt Nam tình hình điều trị bỏng nước ngày cải tiến Có số nghiên cứu, công bố liên quan đến Acetobacter xylinum, hình thành BC ứng dụng màng BC Các công trình bước đầu nghiên cứu trình tạo màng, đặc tính cấu trúc màng làm sở chế tạo màng trị bỏng [7]; sản xuất thạch dừa [5] Gần nghiên cứu ứng dụng màng BC làm chất giá đỡ để cố định tế bào vi khuẩn Nguyễn Thúy Hương Phạm Thành Hổ Năm 2006, PGS.TS Nguyễn Văn Thanh – Trưởng môn Vi Sinh – Ký Sinh Đại học Y Dược học Tp.HCM chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học dầu mù u phương pháp lên men Nó có khả thấm nước cao, kết dính chặt trơ mặt hóa học nên có vai trò màng sinh học , thay da tạm thời Với hoạt chất tái sinh mô chất sát khuẩn có nguồn gốc thiên nhiên không gây đau rát không chứa yếu tố gây kích ứng da Mới đây, nhóm nghiên cứu PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung bước đầu ứng dụng màng BC điều trị bỏng thỏ [8] GVHD: Phương Phú Công SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN Công tác điều trị bỏng bao gồm việc cấy ghép, phẫu thuật, tạo số màng trị bỏng màng ối, trung bị da lợn, da ếch, màng chitossan, sử dụng chất có nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng … Không Việt Nam mà hầu hết quốc gia giới, việc điều trị bỏng thuốc trị bỏng có nguồn gốc từ tự nhiên áp dụng lâu phổ biến Các thuốc có sẵn thiển nhiên có nhiều đặc tính tốt cho điều trị bỏng chữa vết thương, côn trùng đốt… GVHD: Phương Phú Công 10 SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng [1] [21] vi khuẩn Acetobacter xylinum có bao nhầy cấu tạo cellulose Thành phần cấu tạo chủ yếu bao nhầy poysaccarit (chủ yếu glucose), có polypeptit, protein Bao nhầy có tác dụng bảo vệ, cung cấp dinh dưỡng, giúp vi khuẩn bám vào giá thể Theo tác giả Sokolnicki cs [15] độ dai màng cellulose vi khuẩn sinh có liên quan đến hình dạng tế bào vi khuẩn Nếu độ dài (chiều dài tế bào) cao tính bền vững màng cellulose vi khuẩn tổng hợp lớn Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả Nguyễn Thúy Hương (2006) nghiên cứu mối liên hệ hình dáng kích thước tế bào vi khuẩn độ chịu lực màng BC cho dòng có tế bào dài màng BC mà chúng tạo có khả giữ nước tốt có độ dai hơn, dòng Acetobacter xylinum có hình dạng tròn dài màng BC chúng khả chịu lực thấp [6] Như vậy, từ kết quan sát hình thái, kích thước tế bào chủng Acetobacter xylinum BHN2 sinh tổng hợp màng BC phù hợp với mục đích nghiên cứu đề tài 3.2 Lên men tạo màng môi trường lỏng Vi khuẩn Acetobacter xylinum nuôi cấy môi trường lỏng (MT3) hình thành lớp màng bề mặt nuôi cấy Vi khuẩn Acetobacter xylinum loài hiếu khí, sống môi trường lỏng thực trình trao đổi chất cách hấp thụ đường glucose, kết hợp đường với acid béo để tạo thành tiền chất nằm màng tế bào Tiền chất tiết nhờ hệ thống lỗ nằm màng tế bào với enzyme polyme hoá glucose thành cellulose môi trường dịch thể chúng phát triển thành lớp màng độ dày, mỏng GVHD: Phương Phú Công 17 SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN khác tuỳ thuộc vào loài Màng BC tập hợp tế bào vi khuẩn liên kết với cellulose Hình 3.2 : Màng BC hình thành môi trường lỏng Kết quan sát cho thấy màng BC từ chủng Acetobacter xylinum BHN2 có màu trắng sáng, bề mặt màng nhẵn, có độ dai cao cho màng BC chủng Acetobacter xylinum BHN2 đáp ứng yêu cầu tạo màng BC ứng dụng trị bỏng 3.3 Các phương pháp khử khuẩn màng BC 3.3.1 Phương pháp 1: Hấp màng 1210C 20 phút 1100C phút Màng BC đặt hộp nhựa chịu nhiệt đem hấp nồi hấp Tommy để khử khuẩn màng Sau xử lý màng thu kết sau: GVHD: Phương Phú Công 18 SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN Bảng 3.1: Màng BC sau xử lý phương pháp Phương pháp xử lý Kết Số khuẩn lạc mọc Đặc điểm màng petri Hấp màng 1210C 20 phút Màu trắng đục Mùi dễ chịu Kém dai pH = 4-5 Hấp màng 1100C phút Màu trắng đục Mùi dễ chịu Kém dai pH = 4-5 Màng sau hấp 1210C 20 phút 1100C phút vô khuẩn vi khuẩn Acetobacter xylinum vi khuẩn ưa ấm (nhiệt độ tối thích 25 – 350C), hấp màng nhiệt độ cao, áp suất lớn vi khuẩn màng bị tiêu diệt Qua kết thực nghiệm bảng 1, màng giữ độ dai, màng trắng, thầm hút tốt, nhiên màng mỏng, pH màng axit Hình 3.3 : Màng sau khử khuẩn hấp 1210C 20 phút 1100C phút GVHD: Phương Phú Công 19 SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN 3.3.2 Phuơng pháp 2: Sấy màng 600C vòng 10, 20, 40, 60, 70 phút Tôi tiến hành khử khuẩn khô màng 600C vòng 10, 20, 40, 60, 70 phút cho kết sau: Bảng 3.2 : Màng sau xử lý theo phương pháp Sấy 10 phút 23 Màu trắng đục Mùi dễ chịu Dai pH= 3-4 Sấy 20 phút 20 Màu trắng đục Mùi dễ chịu Dai pH= 3-4 Sấy 40 phút Màu trắng đục Mùi dễ chịu Dai pH= 3-4 Sấy 60 phút Màu trắng đục Mùi dễ chịu Dai pH= 3-4 Sấy 70 phút Màu trắng đục Mùi dễ chịu Kém dai pH= 3-4 GVHD: Phương Phú Công 20 SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN Vi khuẩn Acetobacyter xylinum sinh trưởng phát triển nhiệt độ 25 – 350C Khi sấy màng 600C , nhiệt độ cao làm biến đổi protein nguyên sinh chất, phá hủy màng tế bào, hoạt động sống vi sinh vật bị ức chế Ở thời gian 10 phút 20 phút vi khuẩn màng sống, sấy 40, 60 phút vi khuẩn màng bị khử, màng vô khuẩn, màng dai, thầm hút tốt, màng trắng, mùi dễ chịu, 70 phút màng bị khô, mỏng Phương pháp đơn giản, xử lý nhiều màng lúc, pH màng axit Như màng sấy 600C tốt nhất, màng dai, vô khuẩn, độ ẩm thích hợp thuận lợi cho việc đóng gói bảo quản Hình 3.4: Màng sau xử lý sấy 600C 60 phút 40 phút 3.3.3 Phương pháp 3: Chiếu tia cực tím thời gian 10,15, 20, 25, 30 phút khoảng cách từ màng đèn cực tím 40 cm Qua thực nghiệm thu kết sau: Bảng 3.3: Màng sau xử lý với thí nghiệm Phương pháp xử lý Kết Số khuẩn lạc mọc Đặc tính màng petri Chiếu đèn tím 15 phút GVHD: Phương Phú Công Máu trắng đục Mùi dễ chịu 21 SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN Dai pH=3-4 Chiếu đèn tím 20 Máu trắng đục phút Mùi dễ chịu Dai pH=3-4 Chiếu đèn tím 25 Máu trắng đục phút Mùi dễ chịu Dai pH=3-4 Theo bảng 4, chiếu đền cực tím lên màng thời gian 10, 15, 20, 25, 30 phút khối lượng, độ dai, độ dày, màu sắc màng không thay đổi, vi khuẩn màng bị khử tia uv gây trình quang oxy hóa nguyên sinh chất tế bào, đặc biệt tác động lên axit nucleic Dưới tác động xạ phản ứng hóa học tế bào bị phá vỡ, vi khuẩn Acetobacter xylinum bị tiêu diệt, màng vô khuẩn Xử lý vi khuẩn màng theo phương pháp đơn giản, thời gian ngắn, không xử lý nhiều màng lúc, màng axit a GVHD: Phương Phú Công b 22 SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN c d Hình 3.5 : Màng sau khử khuẩn đèn tím a màng sau khử khuẩn đèn tím 10 phút b màng sau khử khuẩn đèn tím 15 phút c màng sau khử khuẩn đèn tím 20 phút d màng sau khử khuẩn đèn tím 25 phút 3.3.4 Phương pháp 4: Ngâm cồn 960 vòng 6, 12, 24, 48 Tôi tiến hành ngâm màng cồn 960 thời gian 6, 12, 24, 48giờ Kết dẫn bảng sau: Bảng 3.4: Màng sau xử lý theo phương pháp Phương pháp xử lý Ngâm cồn 48h Kết Màu trắng đục Mùi hắc Dai pH = 3-4 Qua bảng nhận thấy, màng sau ngâm cồn 960 khoảng thời gian khác khối lượng màng, độ dai màu sắc màng trước sau xử lý thay đổi không đáng kể, giữ đặc tính màng Màng BC ngâm cồn 960 sau 6h, 12h, 24h đem kiểm tra vi khuẩn Acetobacter xylinum màng, thấy hộp lồng xuất khuẩn lạc vi khuẩn chứng tỏ vi khuẩn màng chưa chết, màng chưa vô khuẩn Màng ngâm cồn 960 sau 48h, quan sát sát hộp lồng không thấy xuất khuẩn lạc vi khuẩn, màng vô khuẩn Như vậy, màng ngâm cồn GVHD: Phương Phú Công 23 SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN sau 48h hiệu Phương pháp tốn kém, thời gian khử khuẩn dài, pH màng axit Hình 3.6: Màng sau khử khuẩn cồn 960 24h, 48h 3.3.5 Phương pháp 5: Sấy màng 600C 60 phút sau chiếu đèn tím 10 phút Màng sau sấy 600C 60 phút (thí nghiệm 2) màng dai, sau ngày màng vô khuẩn Tuy nhiên, để đảm bảo màng vô khuẩn thời gian dài trình bảo quản màng tiến hành chiếu đèn tím lên màng 10 phút (thí nghiệm 3) thu kết sau: Bảng 3.5: Màng sau xử lý theo phương pháp Đặc tính màng GVHD: Phương Phú Công 24 SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp GVHD: Phương Phú Công K33C Khoa sinh - KTNN 25 SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp GVHD: Phương Phú Công K33C Khoa sinh - KTNN 26 SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN Màng sau xử lý vô khuẩn, giữ đặc tính cần thiết màng phù hợp điều trị bỏng Tuy nhiên màng axit Từ kết thu phương pháp trên, nhận thấy phương pháp phương pháp tối ưu nhất, màng dai, độ ẩm thích hợp, màng vô khuẩn Hình 3.7 : Màng sau sấy 600C 60 phút sau chiếu đèn tím 10 phút GVHD: Phương Phú Công 27 SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ A Kết luận - Tìm phương pháp diệt khuẩn Acetobacter xylinum màng BC mà giữ tính chất vật lý màng: Sấy màng 600C 60 phút, sau chiếu đèn tím 10 phút khoảng cách 40 cm Màng sau xử lý vô khuẩn, màu sắc phù hợp, màng có khả thấm hút tốt, dễ sử lý, thuận lợi đóng gói bảo quản màng B Đề nghị Trên kết nghiên cứu bước đầu việc nghiên cứu phương pháp diệt vi khuẩn Acetobacter xylinum có màng BC Để có sản phẩm ứng dụng vào thực tiễn cần phải giải tiếp vấn đề trung hòa axit có màng GVHD: Phương Phú Công 28 SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Dương Đức Tiến (1980), Vi sinh vật học, tập 1-2, Nhà xuất Khoa học Kỹ Thuật Hà Nội Nguyễn Thành Đạt (1999), Cơ sở vi sinh vật học Tập 1, Nxb Đại học Sư phạm Hà Nội Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào (1990), Thực hành vi sinh vật, Nxb Giáo dục Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập vi sinh vật, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội, tr.1-50 Trương Thị Ngọc Hoa, Trương Nguyễn Quỳnh Hương (2005), “Đa dạng hóa môi trường sản xuất Natadecoco từ vi khuẩn Acetobacter xylinum” Số 2, Tạp chí khoa học kỹ thuật Nông Lâm nghiệp Nguyễn Thúy Hương (2006), Chọn lọc chủng Acetobacter xylinum thích hợp cho loại môi trường dung sản xuất cellulose vi khuẩn với quy mô lớn… Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh (2006), “Nghiên cứu đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng”, Tạp chí dược học, số 361, tr 18 – 20 Đinh Thị Kim Nhung, Trần Như Quỳnh, Nguyễn Thị Thùy Vân (2009), “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng bacterial cellulose ứng dụng điều trị bỏng”, Báo khoa học Alina Krystynowicz, Marianna Turkiewicz, Stanislaw Bielecki, Emillia Klemenska, Aleksander Masny, Andrzej Plucienniczak (2005), Molecular basis of cellulose biosynthesis disappearance in GVHD: Phương Phú Công 29 SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN submerged culture of Acetobacter xylinum, Acta biocimica, Vol 52, pp 691 – 698 10.Brown M.R (1999), Cellulose structure and biosynthesis Vol.71, NO 5, pure appe Chem.p 767 -775 11.Brown Jr.R.M (1989), Microbial cellulose as a building bock resource for specialty products and processes there fore, PCT Int Appl Wo 8912107 Al 12.Cheng H.P., Wang P.M., Chen J.W., Wu W.T (2002), Cultivation of Acetobacter xylinum for bacterial cellulose production in a modified airliftreactor, Biotechnol Appl Biochem 35, p 125-132 13.Dieter Klemm, Dieter Schumann ,Ulrike Udhardt, Silvia Marsch Bacterial synthesized cellulose-artificial blood vessels for microsurgery Vol 26, Inssue 9, Progress in polymer science, 2001, p 1561-1603 14.Embuscado M.E., Marks J.S., BeMiller J.N (1994), Bacterial cellulose I.Factors affecting the production of cellulose Acetobacterxylinum, Food Hydrocolloids (5), p 407-418 15 Sokolnicki Hirai A., Tsuji M., Horii F (1997), Culture conditions producing structureentities composed of cellulose I and II in bacterial cellulose, Cellulose 4, pp 239-245 16.Stanislw Bielecki, Alina Krystynowicz, Marianna Turkiewicz, halina Kalinowska 17.Tomonori N., Naoto I., Yukiko K., Takayasu T., Fumihiro Y., Fukumi S., Takahisa H (1999), Enhancement of cellulose production by expression of sucrose synthase in Acetobacter xylium Applied Biological sciences Vol 96, pp 14-18 GVHD: Phương Phú Công 30 SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN 18 Walker K T, Toidi.J The ' Catalase test', with special reference to Acetobacter species Vol 37, The College of Technology, The University of Manchester, 1942, p 10-12 19.Wan, WK & Millon E (2005) Poly (vinyl alcohol) – bacterial cellulose nanocomposite V S Pat Appl US 2005037082 Al, 16 20 Zaak, (1979), Visualization of pores (export sites) correlated with cellulose production in the envelope of the gram – negative bacterium Acetobacter xylinum J Cell Biology, Vol.80, pp 773 – 777 TL62 21.www.http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phuongp hapthucnghiemdinhten.htm 22.www.http://dieuduongviet.net/cácbiệnphápkhửkhuẩn/showtheread.p h GVHD: Phương Phú Công 31 SV: Phí Thị Nụ [...]... thấy màng BC từ chủng Acetobacter xylinum BHN2 có màu trắng sáng, bề mặt màng nhẵn, có độ dai cao và chúng tôi cho rằng màng BC do chủng Acetobacter xylinum BHN2 đáp ứng yêu cầu tạo màng BC ứng dụng trong trị bỏng 3.3 Các phương pháp khử khuẩn trên màng BC 3.3.1 Phương pháp 1: Hấp màng ở 1210C trong 20 phút và 1100C trong 8 phút Màng BC đặt trong hộp nhựa chịu nhiệt đem hấp trong nồi hấp Tommy để khử khuẩn. .. lỏng (MT3), sau khi thu màng chọn màng BC ổn định, mỏng 0,5 – 1mm, kích thước 10 × 15 cm, dai để tiến hành khử khuẩn vi khuẩn Acetobacter xylinum có trên màng BC theo 5 phương pháp sau: + Phương pháp 1: hấp màng ở 1210C trong vòng 20 phút, ở 1100C trong vòng 8 phút +Phương pháp 2: Sấy màng trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C trong vòng 10, 20 phút, 30 phút, 40 phút, 60 phút + Phương pháp 3: Chiếu tia cực tím... ở khoảng cách từ màng cho đến đèn cực tím là 40 cm + Phương pháp 4: Ngâm cồn 960 trong vòng 6, 12, 24, 48 giờ + Phương pháp 5: Sấy màng 600C trong 60 phút, sau đó chgieeus đèn tím trong 10 phút Phương pháp đánh giá kết quả: - Sau khi khử khuẩn trên màng theo 5 phương pháp trên, kiểm tra vi khuẩn còn lại trên màng bằng cách: + Dùng kéo vô trùng cắt màng đã xử lý bằng 5 phương pháp ở trên với diện tích... nhưng khối lượng màng, độ dai màu sắc của màng trước và sau khi xử lý thay đổi hầu như không đáng kể, vẫn giữ được đặc tính của màng Màng BC ngâm cồn 960 sau 6h, 12h, 24h đem kiểm tra vi khuẩn Acetobacter xylinum trên màng, thấy trên hộp lồng vẫn xuất hiện khuẩn lạc của vi khuẩn chứng tỏ rằng vi khuẩn trên màng vẫn chưa chết, màng chưa vô khuẩn Màng ngâm cồn 960 sau 48h, quan sát sát trên hộp lồng không... = 4-5 Màng sau khi hấp 1210C trong 20 phút và 1100C trong 8 phút đều vô khuẩn do vi khuẩn Acetobacter xylinum là vi khuẩn ưa ấm (nhiệt độ tối thích là 25 – 350C), khi hấp màng ở nhiệt độ cao, áp suất lớn vi khuẩn trên màng đều bị tiêu diệt Qua kết quả thực nghiệm ở bảng 1, màng vẫn giữ được độ dai, màng trắng, thầm hút tốt, tuy nhiên màng hơi mỏng, pH màng vẫn còn axit Hình 3.3 : Màng sau khử khuẩn. .. có khả năng thấm hút tốt, dễ sử lý, thuận lợi trong đóng gói và bảo quản màng B Đề nghị Trên đây là những kết quả nghiên cứu bước đầu trong vi c nghiên cứu phương pháp diệt vi khuẩn Acetobacter xylinum có trên màng BC Để có được sản phẩm và ứng dụng vào thực tiễn cần phải giải quyết tiếp vấn đề trung hòa axit có trên màng GVHD: Phương Phú Công 28 SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh -... nghiệp GVHD: Phương Phú Công K33C Khoa sinh - KTNN 26 SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN Màng sau xử lý vô khuẩn, vẫn giữ được đặc tính cần thiết của màng phù hợp trong điều trị bỏng Tuy nhiên màng vẫn còn axit Từ kết quả thu được trong 5 phương pháp trên, tôi nhận thấy phương pháp 5 là phương pháp tối ưu nhất, màng dai, độ ẩm thích hợp, màng vô khuẩn Hình 3.7 : Màng sau khi... khuẩn trên màng đã bị khử, màng vô khuẩn, màng dai, thầm hút tốt, màng trắng, mùi dễ chịu, ở 70 phút màng bị khô, mỏng Phương pháp này đơn giản, xử lý được nhiều màng cùng lúc, nhưng pH màng còn axit Như vậy màng sấy ở 600C là tốt nhất, màng dai, vô khuẩn, độ ẩm thích hợp thuận lợi cho vi c đóng gói và bảo quản Hình 3.4: Màng sau xử lý khi sấy 600C trong 60 phút và 40 phút 3.3.3 Phương pháp 3: Chiếu... hiện khuẩn lạc vi khuẩn, màng đã vô khuẩn Như vậy, màng ngâm cồn GVHD: Phương Phú Công 23 SV: Phí Thị Nụ Khóa luận tốt nghiệp K33C Khoa sinh - KTNN sau 48h là hiệu quả nhất Phương pháp này cũng khá tốn kém, thời gian khử khuẩn dài, pH màng vẫn còn axit Hình 3.6: Màng sau khi khử khuẩn bằng cồn 960 trong 24h, 48h 3.3.5 Phương pháp 5: Sấy màng ở 600C trong 60 phút sau đó chiếu đèn tím trong 10 phút Màng. .. kích thước tế bào vi khuẩn và độ chịu lực của màng BC cũng cho rằng những dòng có tế bào dài thì màng BC mà chúng tạo ra có khả năng giữ nước tốt hơn và có độ dai chắc hơn, còn những dòng Acetobacter xylinum có hình dạng tròn dài thì màng BC của chúng khả năng chịu lực thấp hơn [6] Như vậy, từ kết quả quan sát hình thái, kích thước tế bào chủng Acetobacter xylinum BHN2 sinh tổng hợp màng BC phù hợp với ... cứu phương pháp tối ưu diệt vi khuẩn Acetobacter xylinum có màng BC sau lên men giữ số tính chất lý hóa đặc biệt màng Ý nghĩa lý luận thực tiễn đề tài - Tìm phương pháp tối ưu diệt vi khuẩn Acetobacter. .. sau thu màng chọn màng BC ổn định, mỏng 0,5 – 1mm, kích thước 10 × 15 cm, dai để tiến hành khử khuẩn vi khuẩn Acetobacter xylinum có màng BC theo phương pháp sau: + Phương pháp 1: hấp màng 1210C... acid acetic có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn phát triển vi sinh vật có hại [14] 1.3.Các phương pháp khử khuẩn [22] Các phương pháp khử khuẩn gồm hai phương pháp là: khử khuẩn phương pháp vật