Kết - Biện luận CHƢƠNG III KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN - 56 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận 3.1 Cấu trúc chủng E coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 3.1.1 Thu nhận gen fgf2 phản ứng PCR Gen fgf2 đƣợc thu nhận phƣơng pháp PCR với khuôn plasmid pIDT-fgf2 Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra cách điện di gel agarose 1% với thang chuẩn, kết đƣợc trình bày hình 3.1 Hình 3.1 Sản phẩm PCR thu nhận gen fgf2; giếng 1, thang DNA 1kb plus; giếng 2, sản phẩm PCR đoạn gene fgf2 với cặp mồi FGF2-F FGF2-R Trong hình 3.1, giếng xuất vạch DNA có kích thƣớc khoảng 450bp so sánh với thang chuẩn 1kb plus (giếng 1), với kích thƣớc dự đoán gen fgf2 Nhƣ vậy, khuếch đại đƣợc đoạn gen mục tiêu cần dùng Sau đó, đoạn gen fgf2 thu đƣợc từ phản ứng PCR đƣợc xử lý với cặp enzyme BamHI NdeI để chuẩn bị cho phản ứng nối với plasmid pET-His cắt mở vòng để tạo plasmid tái tổ hợp - 57 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận 3.1.2 Thu nhận xử lý plasmid pET-His enzyme BamHI NdeI Để chuẩn bị lƣợng lớn vector cho phản ứng nối, tiến hành cấy E.coli DH5α mang plasmid pET-His vào ống nghiệm chứa môi trƣờng LB lỏng, nuôi cấy lắc qua đêm 37oC, tách chiết xử lý plasmid thu nhận đƣợc hai enzyme cắt hạn chế BamHI NdeI nhằm chuẩn bị cho chiến lƣợc tạo dòng đầu dính Kết thu nhận plasmid đƣợc trình bày hình 3.2 Hình 3.2 Kết thu nhận cắt mở vòng plasmid pET-His; giếng 1, thang DNA 1kb; giếng 2, Plasmid pET-His; giếng 3, plasmid pET-His cắt enzyme BamHI NdeI Plasmid pET-His có kích thƣớc 4636bp, mang trình tự nhận biết hai enzyme BamHI (4122) NdeI (4088) Trƣớc xử lý, plasmid pET-His tách chiết cho vạch tƣơng ứng với hai trạng thái tự nhiên khác plasmid (giếng 2) Sau xử lý với hai enzyme BamHI (4122) NdeI (4088), plasmid trở dạng thẳng có kích thƣớc khoảng 4602bp (giếng 3) nằm hai vạch 4000bp 5000bp thang 1kb - 58 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận Nhƣ vậy, tách chiết đƣợc plasmid pET-His cắt mở vòng thành công plasmid 3.1.3 Biến nạp sản phẩm nối vào E coli DH5α Sau xử lý tinh plasmid pET-His enzyme BamHI NdeI, thực phản ứng nối trực tiếp plasmid với gen fgf2 Hỗn hợp sản phẩm nối đƣợc biến nạp vào tế bào khả nạp E coli DH5α Thực đối chứng âm tế bào DH5α không đƣợc biến nạp sản phẩm nối Kết đƣợc trình bày hình 3.3 Hình 3.3 Kết biến nạp sản phẩm nối vào E coli DH5α 1, Đĩa đối chứng;2, Đĩa biến nạp Ở đĩa đối chứng, tế bào E coli DH5α không đƣợc biến nạp sản phẩm nối pET-fgf2 nên không mang gen kháng kháng sinh Do đó, tế bào không tăng trƣởng đƣợc đĩa môi trƣờng LB-Amp100 Ở đĩa biến nạp, tế bào E coli DH5α đƣợc biến nạp với hỗn hợp sản phẩm nối chứa pET-fgf2 có mang gen kháng kháng sinh Do đó, tế bào tăng trƣởng đƣợc đĩa môi trƣờng LB Amp100 Các khuẩn lạc mọc đƣợc môi trƣờng LBAmp100 đƣợc tiếp tục kiểm tra để chọn lọc dòng mang vector tái tổ hợp - 59 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận 3.1.4 Sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 Để khẳng định thể biến nạp thu đƣợc chứa plasmid tái tổ hợp pET-fgf2, tiến hành sàng lọc PCR khuẩn lạc thể biến nạp cặp mồi đặc hiệu FGF2-F/FGF2-R cặp mồi T7 promoter/T7 terminator Kết đƣợc trình bày hình 3.4 Hình 3.4 Kết sàng lọc thể biến nạp E coli DH5α PCR khuẩn lạc giếng 1, thang DNA 1kb; giếng 2, PCR plasmid pET-His cặp mồi FGF2-F/FGF2-R; giếng 3, PCR plasmid pIDT-fgf2 cặp mồi FGF2F/FGF2-R; giếng 4, PCR khuẩn lạc cặp mồi FGF2-F/FGF2-R; giếng 5, PCR plasmid pET-His cặp mồi T7promoter/T7terminator; giếng 6,7, PCR khuẩn lạc cặp mồi T7promoter/T7terminator - 60 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận Cặp mồi FGF2-F/FGF2-R bắt cặp đặc hiệu với trình tự hai đầu gen nên đoạn khuếch đại có kích thƣớc 438bp Cặp mồi T7promoter/T7terminator bắt cặp đặc hiệu với vùng T7promoter T7terminator plasmid nên sản phẩm khuếch đại có kích thƣớc dự đoán 618bp bao gồm gen fgf2 đoạn DNA plasmid pET-His Kết điện di cho thấy giếng xuất vạch PCR có kích thƣớc nằm hai vạch thang 250bp 500bp, ngang với vạch PCR mẫu chứng dƣơng (giếng 3) Trong đó, với đối chứng âm plasmid pET-His không mang gen fgf-2 nên không xuất vạch (giếng 2, hình 3.4) Bên cạnh đó, giếng 6, sản phẩm PCR khuẩn lạc mồi T7promoter /T7terminator cho sản phẩm PCR vạch nằm khoảng vạch 500bp 750bp thang chuẩn, phù hợp với kích thƣớc đoạn mang gen hai mồi theo dự đoán 618bp Đây kích thƣớc gen fgf2 (438bp) phần trình tự hai mồi vector Trong đó, sản phẩm PCR plasmid pET-His làm khuôn cho vạch có kích thƣớc 180bp (giếng 5, hình 3.4) Nhƣ vậy, bƣớc đầu sàng lọc đƣợc khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 Những khuẩn lạc cho kết dƣơng tính đƣợc tách plasmid, tiếp tục kiểm tra diện gen fgf2 phƣơng pháp PCR plasmid enzyme cắt hạn chế 3.1.5 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET-His-fgf2 phƣơng pháp PCR enzyme cắt giới hạn Các thể biến nạp cho kết PCR khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc tiếp tục tách chiết thu nhận plasmid tái tổ hợp phƣơng pháp SDS-kiềm Sau đó, plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 đƣợc phân tích phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu FGF2F/FGF2-R, cặp mồi T7promoter/T7terminator enzyme cắt hạn chế Kết kiểm tra đƣợc trình bày hình 3.5 Ở giếng thứ (hình 3.5), xuất vạch có kích thƣớc nằm hai vạch thang 250bp 500bp, tƣơng ứng với kích thƣớc gen fgf-2 đƣợc khuếch đại mồi đặc hiệu (438bp) Bên cạnh đó, sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp cặp mồi - 61 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận T7promoter/T7terminator cho vạch có kích thƣớc nằm khoảng 500-700bp tƣơng ứng với tổng kích thƣớc gen fgf-2 (438bp) phần trình tự hai mồi plasmid (giếng 5) Hình 3.5 Kết kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET-His-fgf2 phương pháp PCR cắt hạn chế; giếng 1, Thang DNA 1kb; giếng 2, PCR plasmid pET-His với cặp mồi FGF2-F/FGF2-R; giếng 3, PCR plasmid pET-fgf2 mồi FGF2F/FGF2-R; giếng 4, PCR plasmid pET-His cặp mồi MCS T7promoter/T7terminator; giếng 5, PCR plasmid pET-fgf2 cặp mồi T7promoter/T7terminator; giếng 6, Plasmid tái tổ hợp pET-fgf2; giếng 7, Plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 cắt enzyme EcoRI; giếng 8, Plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 cắt hai enzyme BamHI NdeI Đồng thời, plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 đƣợc cắt EcoRI cho vạch có kích thƣớc ngang với vạch thang 5000bp thang chuẩn, chứng tỏ plasmid đƣợc chèn thêm đoạn gen Plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 đƣợc cắt BamHI - 62 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận NdeI cho hai vạch tƣơng ứng với kích thƣớc plasmid pET-His (4636bp) đoạn gen fgf2 (438bp) đƣợc nối vào (giếng 8) Các kết phân tích phƣơng pháp PCR enzyme cắt giới hạn cho phép kết luận nối thành công gen fgf2 vào plasmid pET-His 3.1.6 Kiểm tra giải trình tự gen fgf2 Nhằm khẳng định độ xác trình tự so với thiết kế ban đầu nhƣ đồng khung dịch mã, plasmid tái tổ hợp dự tuyển sau kiểm tra diện gen fgf2 đƣợc tách chiết gửi giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger cải tiến máy Big DyeTM terminator (Macrogen, Hàn Quốc) Kết giải trình tự gen fgf2 plasmid pET-fgf2 đƣợc so sánh với trình tự lý thuyết phần mềm Jellyfish Kết so sánh cho thấy gen đƣợc tạo dòng có độ tƣơng đồng 100%với trình tự thiết kế đồng khung dịch mã với ba khởi đầu vector Ngoài ra, so sánh với vector tái tổ hợp mang gen fgf2 trƣớc [2] cho thấy có thay cystein thành acid amin khác, với kết thiết kế ban đầu Tuy nhiên, kết luận văn đƣợc tiếp tục sử dụng cho nghiên cứu công bố nên thông tin cụ thể trình biến đổi không đƣợc trình bày khuôn khổ luận văn Nhƣ vậy, cấu trúc thành công plasmid pET-fgf2 3.2 Cấu trúc chủng E coli BL21(DE3) biểu protein fgf-2 3.2.1 Biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E coli BL21(DE3) Plasmid pET-fgf2 đƣợc tách chiết phƣơng pháp SDS-kiềm từ chủng E coli DH5α/pET-fgf2 đƣợc biến nạp vào chủng BL21(DE3) sàng lọc môi trƣờng LBAmp100 - 63 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận Hình 3.6 Kết biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E coli BL21(DE3) 1, Đĩa đối chứng; 2, Đĩa biến nạp Trên đĩa đối chứng (1), tiến hành trải tế bào không mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 Những tế bào khả kháng kháng sinh, nên không phát triển đƣợc môi trƣờng LB-Amp, không thấy xuất khuẩn lạc đĩa (1) Ngƣợc lại, đĩa biến nạp (2), thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp nên có khả kháng kháng sinh, phát triển tạo khuẩn lạc Sau đó, khuẩn lạc đƣợc kiểm tra PCR với cặp mồi đặc hiệu FGF2F/FGF2-R để sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp mong muốn 3.2.2 Sàng lọc thể biến nạp phƣơng pháp PCR khuẩn lạc Các khuẩn lạc mọc đƣợc môi trƣờng LB-Amp100 đƣợc chọn thực kiểm tra phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu FGF2-F/FGF2-R - 64 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận Hình 3.7 Kết PCR khuẩn lạc tế bào E coli BL21(DE3) cặp mồi FGF2F/FGF2-R; giếng 1, thang chuẩn 1kb; giếng 2, sản phẩm PCR plasmid pET-His; giếng 3, sản phẩm PCR plasmid pIDT-fgf2; giếng 4, sản phẩm PCR khuẩn lạc E coli BL21(DE3) Kết điện di cho thấy giếng không thấy xuất vạch khuếch đại khuôn mẫu sử dụng vector không mang gen fgf2, giếng xuất vạch DNA có kích thƣớc với kích thƣớc mẫu chứng dƣơng (giếng 3) Nhƣ vậy, biến nạp thành công pET-fgf2 vào chủng E coli BL21(DE3) Những khuẩn lạc cho kết dƣơng tính E coli BL21(DE3)/pET-fgf2 đƣợc sử dụng để kiểm tra khả biểu protein mục tiêu 3.3 Xác nhận biểu protein tái tổ hợp FGF-2 chủng BL21(DE3) /pET-fgf2 Các dòng E coli mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 đƣợc nuôi cấy cảm ứng IPTG để kiểm tra khả biểu protein FGF-2 Kết kiểm tra biểu protein FGF-2 đƣợc trình bày hình 3.8 - 65 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận Hình 3.8 Kết điện di SDS-PAGE (A) lai Western (B) xác nhận biểu FGF-2; 1, thang protein phân tử lượng thấp; 2, E coli BL21(DE3)/pET-fgf2, IPTG(-); 3, E coli BL21(DE3)/pET-fgf2, IPTG(+) protein tổng số; 4, E coli BL21(DE3)/pETfgf2, IPTG(+) thể vùi; 5, E coli BL21(DE3)/pET-fgf2, IPTG(+) thể tan Dựa vào kết điện di ta thấy giếng tƣơng ứng mẫu E coli BL21(DE3)/pET-fgf2 không đƣợc cảm ứng IPTG không xuất vạch protein mong muốn Giếng 3, 4, mẫu protein tƣơng ứng với protein tổng số, protein thể vùi protein hòa tan chủng E coli BL21(DE3)/pET-fgf2 đƣợc cảm ứng IPTG 0,3mM môi trƣờng LB-Amp Kết cho thấy giếng xuất vạch protein đƣợc biểu vƣợt mức nằm hai vạch kích thƣớc thang chuẩn 14,4kDa 20,1kDa tƣơng ứng với kích thƣớc dự đoán protein FGF-2 (18kDa) Kết phân tích dạng biểu cho thấy, protein chủ yếu biểu dạng thể tan (giếng 5) Đồng thời, kết lai Western cho thấy xuất vạch tín hiệu tƣơng ứng vị trí vạch protein FGF-2 điện di SDS-PAGE Điều cho phép khẳng định vạch protein kết điện di protein mục tiêu FGF-2 Nhƣ kết luận biểu thành công protein FGF-2 dạng tan từ dòng tế bào E coli BL21(DE3) - 66 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận 3.4 Bƣớc đầu lên men hệ thống lên men quy mô lít để thu nhận protein FGF-2 tái tổ hợp dạng tan 3.4.1 Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng Quá trình lên men cảm ứng biểu FGF-2 tái tổ hợp dạng tan chủng E coli BL21(DE3)/pET-FGF đƣợc tiến hành hệ thống lên men tự động vòng 24 với chất cảm ứng IPTG bổ sung thứ Sự tăng trƣởng chủng suốt trình lên men đƣợc theo dõi thông qua việc phân tích trọng lƣợng khô tế bào sau lên men Kết phân tích trọng lƣợng khô tế bào đƣợc trình bày hình 3.9 Hình 3.9 Kết phân tích trọng lượng khô tế bào trình lên men Hình đại diện cho ba lần thí nghiệm lặp lại Dựa vào đồ thị cho thấy trọng lƣợng khô tế bào tăng dần suốt trình lên men ổn định cuối Điều phù hợp với đặc trƣng tăng trƣởng chủng, chứng tỏ xuất vector tái tổ hợp không làm thay đổi đặc tính sinh lý chủng Theo kết phân tích trọng lƣợng khô tế bào, lƣợng tế bào khô thu nhận - 67 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận đƣợc 5,2 g/lít môi trƣờng lên men Tuy nhiên, kết bƣớc đầu lên men Do đó, cần có khảo sát phân tích sâu để mang lại hiệu lên men cao 3.4.2 Khảo sát biểu protein FGF-2 theo thời gian cảm ứng Trong trình lên men, tiến hành thu mẫu sau cảm ứng IPTG để theo dõi biểu protein FGF-2 chủng Sau đó, mẫu đƣợc xử lý điện di SDS-PAGE Kết điện di SDS-PAGE mẫu protein pha tan suốt trình lên men đƣợc trình bày hình 3.10 Hình 3.10 Hình điện di SDS-PAGE mẫu protein pha tan thời điểm lên men 1, Thang protein phân tử lượng thấp; 2-10: lượng protein pha tan tương ứng từ BL21(DE3)/pET-FGF sau 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 lên men Tại thời điểm lên men thứ 8, chất cảm ứng IPTG đƣợc bổ sung protein mục tiêu bắt đầu đƣợc tạo thành Do đó, nuôi cấy thứ (giếng 2) biểu protein mục tiêu Kết điện di SDS-PAGE cho thấy nuôi cấy thứ 10 (giếng 3) vạch protein mục tiêu xuất mức độ biểu protein tăng dần suốt trình lên men Để đánh giá xác biểu FGF-2 - 68 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận dạng tan chủng, tiến hành định lƣợng phần mềm Quantity One (Biorad) Kết định lƣợng đƣợc trình bày bảng 3.1 phụ lục Kết bảng 3.1 cho thấy phần trăm tỉ lệ protein FGF-2 pha tan tăng suốt trình lên men Tỉ lệ đạt cao thứ 24, lƣợng FGF-2 chiếm 10,9% lƣợng protein tổng Tuy nhiên, kết cho thấy chủng biểu không ổn định, lƣợng protein mục tiêu không tăng theo thời gian Do đó, cần phải có khảo sát mở rộng nhằm đánh giá thời điểm dừng lên men để mang lại sản lƣợng cao chi phí sản xuất thấp Bảng 3.1 Kết định lượng phần mềm Quantity One tỉ lệ FGF-2 pha tan (%) sau lên men Thời gian lên Thời gian sau cảm Tỉ lệ FGF-2 men (giờ) ứng (giờ) pha tan (%) 10 5,8 12 7,5 14 9,9 16 8,8 18 10 10,4 20 12 9,6 22 14 9,6 24 16 10,9 3.4.3 Khảo sát chu kì phá tế bào áp suất cao Sau 24 lên men, toàn dịch lên men đƣợc ly tâm thu nhận sinh khối E coli Sinh khối đƣợc phá tế bào phƣơng pháp đồng hóa dựa vào áp suất cao Nhằm đảm bảo lƣợng FGF-2 dạng tan thu nhận đƣợc sau trình phá tế bào cao nhất, tiến hành khảo sát số chu kỳ phá mẫu Mẫu protein thể vùi thể tan - 69 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận sau chu kì phá mẫu đƣợc tiến hành điện di SDS-PAGE nhằm xác định lƣợng FGF2 thu đƣợc sau chu kỳ Kết điện di đƣợc trình bày hình 3.3 Kết điện di gel SDS-PAGE mẫu phá tế bào theo chu kì cho thấy dịch sinh khối tế bào phần lớn đƣợc phá chu kì protein mục tiêu nằm phân đoạn dịch tan tế bào Để xác đinh chu kì phá tế bào tối ƣu, sử dụng phần mềm Quantitive One để xác định phần trăm lƣợng protein mục tiêu thu đƣợc dịch tan sau chu kì phá tế bào Từ số liệu có đƣợc, xác định đƣợc chu kì phá mẫu tối ƣu để thu nhận lƣợng protein mục tiêu cao Hình 3.11 Kết điện di SDS-PAGE mẫu protein sau chu kì phá tế bào phương pháp đồng hóa dựa vào áp suất cao 1, Thang protein phân tử lượng thấp; 2, dịch protein tổng; 3, 4, Dịch lên men sau chu kì phá tế bào thể vùi (3) thể tan (4); 5, 6, Dịch lên men sau chu kì phá tế bào thể vùi (5) thể tan (6); 7, 8, Dịch lên men sau chu kì phá tế bào thể vùi (7) thể tan (8) - 70 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận Kết điện di SDS-PAGE cho thấy sinh khối tế bào đƣợc phá hoàn toàn Đồng thời dựa vào kết Quantity One (phụ lục 3) chu kì phá tế bào thứ hai, lƣợng protein mục tiêu thu đƣợc pha tan nhiều (bảng 3.2) Do đó, dịch sinh khối nên đƣợc phá dƣới áp suất cao hai chu kì để tế bào đƣợc phá hoàn toàn đạt hiệu suất cao Bảng 3.2 Kết định lượng phần mềm Quantity One tỉ lệ FGF-2 pha tan (%) sau chu kì phá tế bào Số chu kì % FGF-2 pha tan 12,6 13,2 12,6 Dịch thu nhận sau ly tâm đƣợc định lƣợng Bradford nhằm đánh giá hiệu trình lên men Kết sau xử lý đƣợc trình bày bảng Bảng 3.3 Hiệu thu nhận FGF-2 chủng E coli BL21(DE3)/pET-FGF sau trình lên men Sinh khối khô (g/l) (X) 5,20 ± 0,53 Lƣợng protein tổng thu đƣợc lít dịch lên men (g) (Y) % FGF-2 pha tan (Z) 2,11 ± 0,29 10,9 Lƣợng FGF-2 (g/l) (T) 0,23 ± 0,03 Hiệu thu nhận FGF-2 (E%) 4,42 ± 0,97 Kết ghi nhận đƣợc bảng 3.3 cho thấy trình lên men chủng BL21(DE3)/pET-FGF thu đƣợc 0,23 ± 0,03 g protein FGF-2 dạng tan lít dịch lên men với tỉ lệ FGF-2 pha tan 10,9%, đạt hiệu thu nhận FGF-2 4,42% - 71 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận 3.5 Tinh chế FGF-2 3.5.1 Tinh chế sắc ký trao đổi cation Nhiều nghiên cứu cho thấy FGF-2 bền pH trung tính, tiến hành tinh chế FGF-2 pH Mặt khác, FGF-2 có điểm đẳng điện pI=9,6 nên bƣớc tinh chế đầu tiên, sử dụng sắc ký trao đổi cation nhằm thu nhận FGF-2 Ở bƣớc tinh chế sắc ký trao đổi cation, thực với hai mẫu dịch protein xử lý khác Mẫu thứ tiến hành chỉnh pH mẫu thứ hai chỉnh pH đồng thời bổ sung thêm MgCl đạt nồng độ cuối 1mM Ở hai mẫu tinh chế, protein mục tiêu dung ly phân đoạn 20% dung dịch B kết chạy SDS-PAGE cho thấy mẫu chỉnh pH (phụ lục 7), protein thu đƣợc sau dung ly có nhiều vạch protein tạp mẫu có bổ sung thêm MgCl (hình 3.12) Do nồng độ muối cao, protein không bền Nên bƣớc tiếp theo, tiến hành giảm nồng độ dung ly protein xuống 10% Kết SDS-PAGE (phụ lục 8) cho thấy lƣợng nhỏ protein mục tiêu phân ly phân đoạn này, phần lớn protein nằm phân đoạn dung ly 20% dung dịch B Vì vậy, chọn dung ly protein mục tiêu với nồng độ 20% dung dịch B Hình 3.12 Hình điện di SDS-PAGE (A) Western Blot (B) với kháng thể kháng FGF-2 sản phẩm tinh chế sắc ký trao đổi cation 1, thang protein phân tử lượng - 72 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận thấp; 2, mẫu protein trước qua cột; 3, phân đoạn protein không gắn lên cột; 4-8 phân đoạn 20%, 40%, 60%, 80%, 100% dung dịch dung ly B Kết điện di SDS-PAGE đƣợc trình bày hình 3.12 cho thấy phân đoạn 20% dung dịch B xuất vạch protein nằm vạch có kích thƣớc 14,4kDa 20,1kDa thang chuẩn, phù hợp với khối lƣợng FGF-2 (18kDa) cho tín hiệu dƣơng tính lai với kháng thể kháng FGF-2 Do vậy, kết luận vạch FGF-2 mục tiêu Ở phân đoạn dung ly tiếp theo, không thấy xuất vạch protein mục tiêu Nhƣ protein mục tiêu đƣợc dung ly hoàn toàn 20% dung dịch B Protein phân đoạn 20% đƣợc thu nhận, đánh giá độ tinh nhƣ hiệu suất thu hồi tiếp tục đƣợc tinh chế sắc ký lực heparin nhằm thu nhận FGF-2 tinh 95% Hiệu trình tinh chế sắc ký trao đổi cation đƣợc đánh giá phần mềm Quantity One (phụ lục 5) phƣơng pháp Bradford Kết tính toán cho thấy với cột trao đổi cation SP FF 5ml, thu nhận protein tái tổ hợp FGF-2 có độ tinh 78,5% với hiệu suất thu hồi 60,06% (bảng 3.4) Bảng 3.4 Hiệu suất trình tinh chế sắc ký trao đổi cation Nồng độ Tổng protein protein (mg/ml) (mg) 30 3,34 100,20 6,90 6,91 12 0,44 5,28 78,50 4,15 Mẫu Thể tích tinh chế (ml) Trƣớc Sau Hiệu suất Độ tinh (%) Lƣợng FGF-2 (mg) 60,06% 3.5.2 Tinh chế sắc ký lực với heparin Do FGF-2 tƣơng tác đặc hiệu với heparin, nên thí nghiệm sử dụng cột sắc ký Heparin để tinh chế bƣớc hai nhằm tăng độ tinh sản phẩm protein tái tổ hợp FGF-2 lên 95% - 73 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận Kết điện di SDS-PAGE sản phẩm tinh chế sắc kí lực heparin cho thấy, giếng (hình 3.13) tƣơng ứng với phân đoạn dung ly 60% dung dịch B xuất vạch khoảng 18kDa, ngang với vạch FGF-2 trƣớc tinh chế Đồng thời, kết lai Western Blot với kháng thể đặc hiệu kháng FGF-2, xuất vạch tín hiệu tƣơng ứng với vạch protein gel SDS-PAGE Do đó, khẳng định protein đƣợc thu nhận giếng FGF-2 mục tiêu Hình 3.13 Hình điện di SDS (A) Western Blot (B) với kháng thể kháng FGF-2 sản phẩm tinh chế sắc ký lực với Heparin 1, thang protein phân tử lượng thấp; 2, mẫu trước qua cột; 3, mẫu không bám vào cột Heparin; 4, mẫu tinh chế thu phân đoạn dung ly 60% dung dịch B Sử dụng phần mềm Quantity One (phụ lục 6) phƣơng pháp đo Bradford cho thấy, protein tái tổ hợp FGF-2 thu đƣợc sau tinh chế Heparin có độ tinh 97,10% với hiệu suất thu hồi sản phẩm 76,73% (bảng 3.5) - 74 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết - Biện luận Bảng 3.5 Hiệu suất tinh chế FGF-2 cột Heparin Mẫu tinh Thể tích Nồng độ protein Lƣợng Tổng Độ tinh protein (mg) (%) FGF-2 chế (ml) Trƣớc 30 0,34 10,20 78,50 7,65 Sau 11 0,55 6,05 97,10 5,87 (mg/ml) Hiệu suất (mg) 76,73% Từ kết đạt đƣợc trên, tính toán cho thấy từ lít dịch lên men dòng E.coli BL21(DE3)/pET-FGF, thu nhận đƣợc 106,15 mg FGF-2 dạng tinh sạch, đạt hiệu suất thu hồi khoảng 46,08% (bảng 3.6) Bảng 3.6 Tóm tắt hiệu trình thu nhận FGF-2 từ lít dịch lên men chủng BL21(DE3)/pET-FGF Khối lƣợng Bƣớc thu nhận FGF-2 (mg) Pha tan dịch đồng tế bào Tinh chế trao đổi cation Tinh chế lực heparin Độ tinh (%) Hiệu suất riêng bƣớc (%) Hiệu suất thu hồi (%) 230,33 6,90 100 100 138,34 78,50 60,06 60,06 106,15 97,10 76,73 46,08 - 75 - Luận văn thạc sĩ sinh học [...]... luận Hình 3. 8 Kết quả điện di SDS-PAGE (A) và lai Western (B) xác nhận sự biểu hiện FGF -2; 1, thang protein phân tử lượng thấp; 2, E coli BL21(DE3)/pET-fgf2, IPTG(-); 3, E coli BL21(DE3)/pET-fgf2, IPTG(+) protein tổng số; 4, E coli BL21(DE3)/pETfgf2, IPTG(+) thể vùi; 5, E coli BL21(DE3)/pET-fgf2, IPTG(+) thể tan Dựa vào kết quả điện di ta thấy ở giếng 2 tƣơng ứng mẫu E coli BL21(DE3)/pET-fgf2 không đƣợc... protein tái tổ hợp FGF -2 có độ tinh sạch 78,5% với hiệu suất thu hồi là 60,06% (bảng 3. 4) Bảng 3. 4 Hiệu suất của quá trình tinh chế bằng sắc ký trao đổi cation Nồng độ Tổng protein protein (mg/ml) (mg) 30 3, 34 100 ,20 6,90 6,91 12 0,44 5 ,28 78,50 4,15 Mẫu Thể tích tinh chế (ml) Trƣớc Sau Hiệu suất Độ tinh sạch (%) Lƣợng FGF -2 (mg) 60,06% 3. 5 .2 Tinh chế bằng sắc ký ái lực với heparin Do FGF -2 có thể tƣơng... One (phụ lục 6) và phƣơng pháp đo Bradford cho thấy, protein tái tổ hợp FGF -2 thu đƣợc sau tinh chế Heparin có độ tinh sạch 97,10% với hiệu suất thu hồi sản phẩm 76, 73% (bảng 3. 5) - 74 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết quả - Biện luận Bảng 3. 5 Hiệu suất tinh chế FGF -2 trên cột Heparin Mẫu tinh Thể tích Nồng độ protein Lƣợng Tổng Độ tinh protein (mg) sạch (%) FGF -2 chế (ml) Trƣớc 30 0 ,34 10 ,20 78,50 7,65... FGF -2 ở dạng tan từ dòng tế bào E coli BL21(DE3) - 66 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết quả - Biện luận 3. 4 Bƣớc đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít để thu nhận protein FGF -2 tái tổ hợp dạng tan 3. 4.1 Xây dựng đƣờng cong tăng trƣởng Quá trình lên men cảm ứng biểu hiện FGF -2 tái tổ hợp dạng tan trong chủng E coli BL21(DE3)/pET-FGF đƣợc tiến hành bằng hệ thống lên men tự động trong vòng 24 ... khối khô (g/l) (X) 5 ,20 ± 0, 53 Lƣợng protein tổng thu đƣợc trong 1 lít dịch lên men (g) (Y) % FGF -2 trong pha tan (Z) 2, 11 ± 0 ,29 10,9 Lƣợng FGF -2 (g/l) (T) 0 , 23 ± 0, 03 Hiệu quả thu nhận FGF -2 (E%) 4, 42 ± 0,97 Kết quả ghi nhận đƣợc ở bảng 3. 3 cho thấy quá trình lên men chủng BL21(DE3)/pET-FGF thu đƣợc 0 , 23 ± 0, 03 g protein FGF -2 dạng tan trong một lít dịch lên men với tỉ lệ FGF -2 trong pha tan là 10,9%,... quả thu nhận FGF -2 là 4, 42% - 71 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết quả - Biện luận 3. 5 Tinh chế FGF -2 3. 5.1 Tinh chế bằng sắc ký trao đổi cation Nhiều nghiên cứu cho thấy FGF -2 bền ở pH trung tính, do vậy chúng tôi tiến hành tinh chế FGF -2 ở pH 7 Mặt khác, FGF -2 có điểm đẳng điện pI=9,6 nên ở bƣớc tinh chế đầu tiên, chúng tôi sử dụng sắc ký trao đổi cation nhằm thu nhận FGF -2 Ở bƣớc tinh chế bằng sắc ký... hoàn toàn và đạt hiệu suất cao nhất Bảng 3 .2 Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ FGF -2 trong pha tan (%) sau mỗi chu kì phá tế bào Số chu kì % FGF -2 pha tan 1 12, 6 2 13 ,2 3 12, 6 Dịch nổi thu nhận sau khi ly tâm đƣợc định lƣợng Bradford nhằm đánh giá hiệu quả của quá trình lên men Kết quả sau xử lý đƣợc trình bày ở bảng 3 Bảng 3. 3 Hiệu quả thu nhận FGF -2 ở chủng E coli BL21(DE3)/pET-FGF... 76, 73% Từ các kết quả đạt đƣợc ở trên, chúng tôi tính toán cho thấy từ một lít dịch lên men dòng E .coli BL21(DE3)/pET-FGF, chúng tôi thu nhận đƣợc 106,15 mg FGF -2 dạng tinh sạch, đạt hiệu suất thu hồi khoảng 46,08% (bảng 3. 6) Bảng 3. 6 Tóm tắt hiệu quả quá trình thu nhận FGF -2 từ một lít dịch lên men chủng BL21(DE3)/pET-FGF Khối lƣợng Bƣớc thu nhận FGF -2 (mg) Pha tan dịch đồng nhất tế bào Tinh chế trao... BL21(DE3)/pET-FGF sau 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 , 22 , 24 giờ lên men Tại thời điểm giờ lên men thứ 8, chất cảm ứng IPTG đƣợc bổ sung và protein mục tiêu bắt đầu đƣợc tạo thành Do đó, ở giờ nuôi cấy thứ 8 (giếng 2) không có sự biểu hiện của protein mục tiêu Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy bắt đầu từ giờ nuôi cấy thứ 10 (giếng 3) vạch protein mục tiêu xuất hiện và mức độ biểu hiện của protein này cũng tăng dần... sắc ký Heparin để tinh chế bƣớc hai nhằm tăng độ tinh sạch của sản phẩm protein tái tổ hợp FGF -2 lên trên 95% - 73 - Luận văn thạc sĩ sinh học Kết quả - Biện luận Kết quả điện di SDS-PAGE sản phẩm tinh chế bằng sắc kí ái lực heparin cho thấy, ở giếng 4 (hình 3. 13) tƣơng ứng với phân đoạn dung ly 60% dung dịch B xuất hiện một vạch duy nhất khoảng 18kDa, ngang với vạch FGF -2 trƣớc tinh chế Đồng thời, kết ... protein tái tổ hợp FGF-2 có độ tinh 78,5% với hiệu suất thu hồi 60,06% (bảng 3. 4) Bảng 3. 4 Hiệu suất trình tinh chế sắc ký trao đổi cation Nồng độ Tổng protein protein (mg/ml) (mg) 30 3, 34 100,20... nhận biểu protein tái tổ hợp FGF-2 chủng BL21(DE3) /pET-fgf2 Các dòng E coli mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 đƣợc nuôi cấy cảm ứng IPTG để kiểm tra khả biểu protein FGF-2 Kết kiểm tra biểu protein... 6, Plasmid tái tổ hợp pET-fgf2; giếng 7, Plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 cắt enzyme EcoRI; giếng 8, Plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 cắt hai enzyme BamHI NdeI Đồng thời, plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 đƣợc