BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - - NGUYỄN THỊ KHÁNH LY KIỂM TRA TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA PROTEIN NUCLEOCAPSID PHỤC VỤ VIỆC TẠO KIT CHẨN ĐOÁN HỘI CHỨNG RỒI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - - NGUYỄN THỊ KHÁNH LY KIỂM TRA TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA PROTEIN NUCLEOCAPSID PHỤC VỤ VIỆC TẠO KIT CHẨN ĐOÁN HỘI CHỨNG RỒI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ MINH HUYỀN TS NGUYỄN HỮU ĐỨC HÀ NỘI - 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu khác Tôi xin cam đoan thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Nguyễn Thị Khánh Ly Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS Nguyễn Thị Minh Huyền Phòng Công nghệ Tế bào động vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TS Nguyễn Hữu Đức Phó trưởng Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình bảo cho suốt trình làm luận văn Với tình cảm sâu sắc xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Quang Huấn Trưởng phòng Công nghệ Tế bào động Vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam toàn thể cán nghiên cứu phòng tận tình giúp đỡ suốt thời gian nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn Thầy, Cô khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội truyền đạt cho kiến thức trình học tập Để thực nghiên cứu này, xin chân thành cảm ơn tài trợ từ đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hướng Công nghệ sinh học với mã số đề tài VAST02.02/12-13 Để hoàn thành luận văn này, xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo, tập thể cán Trung tâm Nghiên cứu Dâu tằm tơ, nơi công tác Cuối cùng, cho phép gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè quan tâm, cổ vũ cho vững bước đường học tập nghiên cứu Hà Nội, tháng năm 2014 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Khánh Ly Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn 1.1.1 Triệu chứng lâm sàng 1.1.2 Bệnh tích phương thức lây truyền 1.1.3 Tình hình nghiên cứu hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn giới 1.1.4 Tình hình nghiên cứu hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn Việt Nam 1.2 Giới thiệu chung virus PRRS 17 1.2.1 Hình thái, cấu tạo phân tử virion PRRSV 18 1.2.2 Cấu trúc genome PRRSV 18 1.2.3 Sự đa dạng chủng virus PRRS lưu hành giới 19 1.2.4 Protein Nucleocapsid 21 1.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh 22 1.3.1 Chẩn đoán lâm sàng 22 1.3.2 Phương pháp chẩn đoán dựa kháng nguyên- kháng thể 22 1.3.3 Phương pháp RT-PCR 25 2.3.4 Phương pháp chẩn đoán nhanh dạng que thử 25 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 27 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 27 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 27 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 1.2.1 Phương pháp điện di protein (Laemmli, 1970) 27 2.2.2 Phương pháp ELISA 28 2.2.3 Phương pháp Dot - Blot 30 2.2.4 Gây miễn dịch chuột chủng BALB/c 31 2.2.5 Phương pháp Western blot 31 2.2.6 Phương pháp tạo kit chẩn đoán dạng que thử 32 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Kết kiểm tra tính kháng nguyên protein nucleocapsid 34 3.1.1 Kết tinh protein N tái tổ hợp 34 3.1.2 Kết kiểm tra hoạt tính kháng nguyên protein N tái tổ hợp 37 3.1.3 Kết kiểm tra hoạt tính protein N cách gây miễn dịch chuột nhắt trắng dòng BALB/c 40 3.2 Kết thử nghiệm tạo que chẩn đoán bệnh 46 3.3 Kết kiểm tra số mẫu huyết lợn que thử 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 Kết luận 54 Kiến nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ARN Ribonucleic Acid ATP Adenosine triphosphate BSA Bovine Serum Albumin bp Base pair (cặp base nitơ) dNTP Deoxyribonucleotide DBB Denaturing binding buffer DNA Deoxyribo – Nucleic Acid DWB Denaturing wash buffer ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid EtBr Ethidium Bromide HRP Horse Radish Peroxidase IPMA Immunoperoxidase Monolayer Assay IPTG Isopropyl β- D- 1- Thiogalactopyranoside kDa Kilo Dalton LB Luria Broth MVL Modified live virus MBP Maltose Binding Protein OD Optical Density ORF Open Reading Frame PCR Polymerase Chain Reaction PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PVDF Polyvinylidene fluoride TBS Tris-buffered saline TAE Tris acetic acid- EDTA TE Tris EDTA TRX Thioredoxin TMB 3,3’,5,5’- Tetramethylbenzidine Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Thành phần gel phân tách: 28 2.2 Thành phần gel cô 28 3.1 Kết kiểm tra hoạt tính kháng nguyên protein N phương pháp ELISA 3.2 38 Giá trị OD mẫu huyết chuột nồng độ pha loãng khác 3.3 Kết kiểm tra số mẫu huyết lợn phương pháp ELISA que thử 3.4 42 52 So sánh kết kiểm tra mẫu huyết lợn phương pháp ELISA que thử Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 52 Page vi DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Cấu tạo phân tử virion PRRSV 18 1.2 Sơ đồ hệ gen virus PRRS 19 1.3 Cấu trúc que chẩn đoán 26 2.1 Sơ đồ phản ứng ELISA 29 2.3 Bố trí thành phần que thử 32 3.1 Kết tinh protein N tái tổ hợp 35 3.2 Kết cắt protein MBP-protein N enzyme Thrombin 37 3.3 Kết kiểm tra hoạt tính kháng nguyên protein N phương pháp ELISA 3.4 38 Kết kiểm tra hoạt tính kháng nguyên phương pháp Dotblot 39 3.5 Chuột nhắt trắng dòng BALB/c sau gây miễn dịch 41 3.6 Kiểm tra hiệu giá kháng thể nồng độ pha loãng khác 43 3.7 Hoạt độ kháng thể kháng protein N kháng huyết thu từ chuột gây miễn dịch 43 3.8 Hình ảnh điện di protein trước làm Western blot 44 3.9 Kết western blot với mẫu huyết chuột gây miễn dịch 3.10 kháng nguyên N 45 Que thử chẩn đoán bệnh PRRS 46 3.11(a) Kết kiểm tra số mẫu huyết lợn 48 3.11 (b) Kết kiểm tra số mẫu huyết lợn 49 3.11 (c ) Kết kiểm tra số mẫu huyết lợn 49 3.11(d) Kết kiểm tra số mẫu huyết lợn 50 3.11 (e) Kết kiểm tra số mẫu huyết lợn 50 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tai xanh hay gọi hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRS) bệnh truyền nhiễm, lây lan nhanh, làm ốm chết nhiều lợn bệnh Trong năm qua ngành chăn nuôi nước ta nước khác giới sống chung với loại bệnh Tuy nhiên, gần Trung Quốc xuất dịch lớn gây chết hàng loạt lợn nuôi Từ Trung Quốc, tác nhân lây lan sang nhiều nước có Việt Nam gây thiệt hại lớn diện rộng Bệnh loại virus có tên Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) gây Loại virus làm giảm chức miễn dịch, tạo điều kiện cho loại mầm bệnh khác xâm nhập gây bệnh kế phát hệ hô hấp, có chứng liên cầu- bệnh nguy hiểm lây cho người dễ dẫn đến tử vong Do đó, vấn đề phải tìm phương pháp chẩn đoán nhanh chóng, xác tác nhân gây bệnh để kịp thời phòng ngừa Chẩn đoán xác lây nhiễm tiêm vaccine phòng dịch bệnh có ý nghĩa to lớn việc kiểm soát tới toán dịch bệnh nguy hiểm Trong ba loại protein cấu trúc virus PRRS protein nucleocapside (protein N) quy định ORF7 diện với số lượng lớn phân tử virion PRRS huyết lợn bị nhiễm PRRSV phản ứng mạnh với protein N Ngoài kit ELISA thương mại sử dụng để phát kháng thể kháng protein N Chính sản xuất protein N tái tổ hợp có hoạt tính kháng nguyên tương tự protein N virus mang tính ứng dụng cao dùng làm vật liệu kit chẩn đoán Hiện nay, việc chẩn đoán sớm hội chứng PRRS thường sử dụng Kit ELISA HerdChek 2XR (IDEXX) Mỹ, coi tiêu chuẩn vàng để phát kháng thể kháng virus PRRS có độ nhạy cao đặc hiệu Phương pháp phát kháng thể kháng virus PRRS lợn sau ngày nhiễm, nhiên Kit ELISA có giá thành đắt, tốn nhiều thời gian thực Gần đây, phương pháp chẩn đoán nhanh dạng que thử nguyên lý phương pháp sắc ký miễn dịch quan tâm, phương pháp chẩn đoán nhanh, nhạy, Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page Tại vị trí số màng chứa kháng thể cộng hợp vùng chứa kháng thể kháng IgG lợn cộng hợp vàng thường bảo quản dạng khô kháng thể từ màng giải phóng dạng tự có dòng dung dịch mẫu từ màng thấm mẫu chảy qua Kháng thể cộng hợp kết hợp với kháng thể kháng protein N phức hợp chạy màng Tại vị trí số màng gắn kháng thể (màng nitrocellulose) màng có khả liên kết với protein liên kết hóa học Trên màng có vị trí gắn kháng nguyên protein N vị trí gắn kháng thể kháng IgG lợn tương ứng với hai vị trí để đọc kết màng que thử Nếu mẫu huyết lợn có chứa kháng thể kháng protein N phản ứng xảy vị trí gắn protein N vị trí gắn kháng thể kháng IgG lợn làm xuất màu vị trí Nếu huyết không chứa kháng thể kháng protein N phản ứng xảy vị trí có gắn kháng thể kháng IgG lơn Kháng nguyên protein N kháng thể kháng IgG lợn đưa lên màng máy phun, khí nén cho đầu phun sử dụng Nitơ lỏng đảm bảo hàm lượng kháng nguyên, kháng thể que thử đồng Sử dụng phương pháp phun lên màng có hiệu tiết kiệm kháng nguyên, kháng thể Tại vị trí số màng hấp thụ, màng có chất sợi cellulose ép lại với thành đóng vai trò quan trọng việc mao dẫn que thử, định hướng mao dẫn dòng chảy dung dịch que thử trình thử Màng tạo cho mao dẫn que thử chạy theo chiều từ lên mà không cho dòng mẫu chạy ngược trở lại, việc dòng mẫu chạy ngược lại làm tăng nguy dương tính giả que thử Màng hấp thụ mạnh hay yếu phần ảnh hưởng tới khả bắt giữ kháng thể vị trí gắn protein N kháng thể kháng IgG lợn Khi dòng dung dịch mẫu huyết lợn chạy qua vị trí này, chúng cần có khoảng thời gian để bắt giữ mẫu, chạy nhanh làm cho tỷ lệ phản ứng giảm, phần chất bị chảy trôi không kịp phản ứng làm giới hạn phát tạo dương tính giả Trong trường hợp màng hấp thụ yếu, tốc độ dòng dung dịch thấp kéo dài thời gian phản ứng, số trường hợp không cho kết Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 47 3.3 Kết kiểm tra số mẫu huyết lợn que thử Sau tạo que thử theo nguyên lý thiết kế giải thích trên, thử nghiệm kiểm tra 20 mẫu huyết lợn Các mẫu xét nghiệm phương pháp ELISA trước (HerdCheck 2XR Mỹ) Khi nhỏ mẫu huyết lợn vào vị trí nhỏ mẫu Nếu lợn mắc bệnh PRRS, huyết lợn chứa kháng thể kháng protein N virus PRRS, phản ứng kháng nguyên – kháng thể diễn làm xuất màu vị trí đường thử đường đối chứng Phản ứng coi dương tính xuất đồng thời vạch vị trí đường thử vị trí đường đối chứng Nếu lợn không mắc bệnh, huyết lợn chứa kháng thể kháng protein N virus PRRS, phản ứng đặc hiệu kháng nguyên- kháng thể không diễn ra, không làm xuất vạch màu vị trí đường thử, xuất màu vị trí đường đối chứng phản ứng kháng thể kháng IgG lợn cộng hợp vàng với kháng thể lợn, phản ứng coi âm tính xuất vạch màu vị trí đường đối chứng Kết kiểm tra que thử thể hện qua hình 3.11 Hình 3.11(a) Kết kiểm tra số mẫu huyết lợn (A: Vị trí đường thử; B: Vị trí đường đối chứng) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 48 (a) Hình 3.11 (b) Kết kiểm tra số mẫu huyết lợn (A: Vị trí đường thử; B: Vị trí đường đối chứng) Hình 3.11 (c ) Kết kiểm tra số mẫu huyết lợn (A: Vị trí đường thử; B: Vị trí đường đối chứng) Kết hình 3.11 (a), (b),(c) cho thấy, mẫu huyết T7-5; T7-3; T74; Q11; 61; T0-13; T0-12; T0-14, Q5; Q12; T7-1; T7-2 kiểm tra que thử Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 49 thấy xuất đồng thời vạch màu hồng tím vị trí A (vị trí đường thử) vị trí B (vị trí đường đối chứng), điều đồng nghĩa với kết dương tính Que thử kiểm tra mẫu huyết CTH3 B26 có xuất vạch màu vị trí B mà xuất màu vị trí A, điều chứng tỏ kết âm tính Kết trùng hợp với kết kiểm tra ELISA Hình 3.11(d) Kết kiểm tra số mẫu huyết lợn (A: Vị trí đường thử; B: Vị trí đường đối chứng) Hình 3.11 (e) Kết kiểm tra số mẫu huyết lợn (A: Vị trí đường thử; B: Vị trí đường đối chứng) Hình 3.11 (d) cho thấy, que thử kiểm tra mẫu huyết số 15 21có xuất vạch màu vị trí A vị trí B, kết coi dương tính Kết Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 50 trái ngược với kết kiểm tra ELISA (kết ELISA, mẫu huyết số 15 21 âm tính) Đây coi trường hợp dương tính giả mẫu có bị lẫn với mẫu bệnh phản ứng không đặc hiệu kháng thể với thành phần que thử Que thử kiểm tra mẫu số 30 không thấy xuất vạch đường đối chứng đường thử, điều kháng thể kháng lợn bị trong trình xử lý màng sau phun kháng nguyên, kháng thể Que thử số 31 có xuất vạch vị trí B, kết coi âm tính, với kết ELISA kiểm tra trước Hình 3.11 (e) cho thấy, que thử kiểm tra mẫu huyết số xuất vạch vị trí B, kết âm tính, với kết kiểm tra ELISA trước Tại que thử kiểm tra mẫu huyết Q8 có xuất vạch vị trí B, kết cho âm tính lại trái ngược với kết kiểm tra phương pháp ELISA Đây coi trường hợp âm tính giả Việc kiểm tra mẫu huyết lợn que thử cho kết dương tính âm tính xuất vạch màu vị trí đường thử đường đối chứng Bình thường que thử thử với kháng thể chuẩn nên cho kết xuất vạch màu đường thử đường đối chứng rõ nét so với kết thử nghiệm với mẫu thực địa hàm lượng kháng thể huyết lợn thu từ thực địa khác nên có xuất vạch màu đậm nhạt khác que thử kiểm tra Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 51 Bảng 3.3 Kết kiểm tra số mẫu huyết lợn phương pháp ELISA que thử Kết chẩn đoán STT Mẫu Kết ELISA T7-1 + + T7-2 + + T7-3 + + T7-4 + + T7-5 + + T0-12 + + T013 + + T0-14 + + Q5 + + 10 Q8 + _ 11 Q11 + + 12 Q12 + + 13 _ _ 14 15 _ + 15 21 _ + 16 30 _ Không vạch 17 31 _ _ 18 61 + + 18 B26 _ _ 20 CTH3 _ _ Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp que thử Page 52 Bảng 3.4: So sánh kết kiểm tra mẫu huyết lợn phương pháp ELISA que thử Phương pháp Kiểm tra ELISA Kiểm tra que thử Tổng số Số mẫu Số mẫu Số mẫu Tỷ lệ sai mẫu dương tính âm tính sai lệch 20 13 20 12 4 4/20 Kết bảng 3.4 cho thấy, tiến hành kiểm tra 20 mẫu huyết lợn, với phương pháp ELISA cho kết 13 mẫu dương tính mẫu âm tính Các mẫu huyết kiểm tra que thử cho kết 12 mẫu dương tính mẫu âm tính, số mẫu sai lệch hai phương pháp mẫu Các kết sai lệch gồm có dương tính giả, âm tính giả không vạch Như que thử chẩn đoán bệnh PRRS tạo bước đầu cho kết định có số kết sai khác so với phương pháp ELISA Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.Đã kiểm tra hoạt tính kháng nguyên protein N tái tổ hợp phương pháp ELISA Dot blot Kết cho thấy protein N tái tổ hợp đạt chất lượng để sử dụng phục vụ cho việc tạo kit chẩn đoán bệnh PRRS lợn Đã sử dụng protein N tái tổ hợp để gây miễn dịch chuột thu đáp ứng miễn dịch tốt với mức liều gây miễn dịch thấp 10µ g kháng nguyên protein N/con/lần Đã sử dụng protein N để thử nghiệm tạo kit chẩn đoán virus PRRS dạng que thử nhanh theo nguyên lý dòng chảy miễn dịch Kiểm tra 20 mẫu bệnh que thử cho kết 12 mẫu dương tính, mẫu âm tính mẫu sai lệch so với phương pháp ELISA Kiến nghị Với mong muốn tạo kit chẩn đoán bệnh PRRS Việt Nam với giá thành phù hợp, kết nghiên cứu cần tiếp tục tối ưu hóa đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu kit để tạo que thử với chất lượng tốt, ứng dụng vào thực tiễn Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bùi Quang Anh Nguyễn Văn Long (2007), "Một số đặc điểm dịch tễ Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (lợn tai xanh) tình hình Việt Nam", Diễn Đàn khuyến nông công nghệ, Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn (2007), "Hướng dẫn phòng chống hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRS)" Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn (2008), "Báo cáo thống kê tháng 12" Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn (2010), "Báo cáo thống kê tháng 12" Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn (2011), "Báo cáo thống kê tháng 12" Bộ Nông Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn (2012), "Báo cáo thống kê tháng 12" Đậu Ngọc Hào, Văn Đăng Kỳ, Nguyễn Văn Long Tiêu Quang An (2008), "Một số đặc điểm dịch tễ Hội chứng sinh sản hô hấp (PRRS) lợn từ cuối tháng đến đầu tháng 7/2008 số tỉnh nước", Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 5(15), tr 14-20 Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dụng, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Lê Quang Huấn, Lã Thị Huyền (2009), Kháng thể tái tổ hợp ứng dụng, NXB Khoa học tự nhiên công nghệ, Hà Nội 10 Lê Thanh Hòa, Lê Thị Kim Xuyến, Đoàn Thị Thanh Hương, Trần Quang Vui, Phạm Công Hoạt Nguyễn Bá Hiên (2009), "Phân tích gen M mã hóa protein màng vi rút gây bệnh "Tai xanh" Việt Nam so sánh với chủng Trung Quốc giới", Tạp chí Khoa học Phát triển, 3, tr 282-290 11 Lê Văn Năm (2007), "Kết khảo sát bước đầu biểu lâm sàng bệnh tích đại thể bệnh PRRS số địa phương thuộc Đồng Bắc Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 55 Việt Nam", Hội thảo PRRS bệnh liên cầu gây lợn 10/2007, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, tr 64-77 12.Nguyễn Bá Hiên, Nguyễn Thị Lan Nguyễn Hữu Nam (2013), "Nghiên cứu chọn chủng vacxin virut gây Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp dể sản xuất vacxin phòng bệnh", Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 1, tr 1-9 13.Nguyễn Đức Hiền (2012), "Tình hình nhiễm hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS) số yếu tố nguy lan truyền bệnh đàn heo thành phố Cần Thơ", Tạp chí Khoa học, 22, tr 96-105 14.Nguyễn Ngọc Hải Võ Khánh Hưng (2012b), "Tính đa dạng kiểu gen virut PRRS nhiễm số đàn heo chăn nuôi." Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 19 (1), tr 20-26 15.Nguyễn Ngọc Hải, Trần Thị Bích Liên, Trần Thị Dân Nguyễn Ngọc Tuân (2007), "Chẩn đoán vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo kỹ thuật RT-PCR", Khoa học Kỹ thuật thú y, 14 (5), tr 5-12 16.Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2006), Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp 17.Nguyễn Thị Lan Nguyễn Thị Hoa (2012), "Chuẩn đoán hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản (PRRS) lợn cai sữa kỹ thất bệnh lý kỹ thuật RT PCR", Tạp chí Khoa học Phát triển, 10 (2), tr 301-306 18.Phạm Ngọc Thạch Đàm Văn Phải (2007), "Một số tiêu lâm sàng, tiêu máu lợn mắc hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp (bệnh tai xanh) số đàn lợn tỉnh Hải Dương Hưng Yên", Hội thảo PRRS bệnh liên cầu khuẩn lợn, ĐH Nông Nghiệp Hà Nội 19.Trần Thị Bích Liên (2008), "Bệnh tai xanh heo", NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh, tr 54-63 20.Tô Long Thành (2007), "Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn", Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, (14), tr 81-87 21.Tô Long Thành Nguyễn Văn Long (2008), "Kết chẩn đoán nghiên cứu virút gây Hội chứng sinh sản hô hấp (PRRS) lợn Việt Nam từ tháng 3/2007 đến 5/2008", Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, (15), tr 5-13 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 56 22.Võ Khánh Hưng Nguyễn Ngọc Hải (2012a), "Phân tích di truyền số chủng vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (PRRSV) số tỉnh miền Nam Việt Nam dựa ORF7", Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 17 (1), tr 25-33 23.Youjun Feng, Tiezhu Zhao, Nguyễn Tùng, Ken Inui, Ying Ma, Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Văn Cảm, Di Liu, Bùi Quang Anh, Tô Long Thành, Chuabin Wang, Kegong Tian Gao George F (2009), "Các biến chủng virut gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp Việt Nam Trung Quốc năm 2007", Khoa học thú y, 16 (1), tr 5-9 TIẾNG ANH 24.Amonsin A., Kedkovid R., Puranaveja S., Wongyanin P., Suradhat S., Thanawongnuwech R (2009), "Comparative analysis of complete nucleotide sequence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) isolates in Thailand (US and EU genotypes)", Virol J, 6, pp 143 25.Andreyev V G., Wesley R D., Mengeling W L., Vorwald A C., Lager K M (1997), "Genetic variation and phylogenetic relationships of 22 porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) field strains based on sequence analysis of open reading frame 5", Arch Virol, 142 (5), pp 993-1001 26.Benfield D A., Nelson E., Collins J E., Harris L., Goyal S M., Robison D., Christianson W T., Morrison R B., Gorcyca D., Chladek D (1992), "Characterization of swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus (isolate ATCC VR-2332)", J Vet Diagn Invest, (2), pp 127-133 27.Costers S., Lefebvre D J., Goddeeris B., Delputte P L., Nauwynck H J (2009), "Functional impairment of PRRSV-specific peripheral CD3+CD8high cells", Vet Res, 40 (5), pp 46 28.Damrongwatanapokin S., Arsayuth K., Kongkrong C., Parchariyanon S., Pinyochon W., Tantaswasdi U (1996), "Serological studies and isolation of porcine reproductive and resiratory syndrome (PRRS) virus in Thailand", J Thai vet Med Assoc, 47, pp 19-30 29.Das F B., Dinh X P., Vu L X H., Ansari I H., Kwon B., Osorio F A., Pattnaik Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 57 A K (2009), "The role of N-glycosylation of minor envelope glycoproteins of PRRSV on infectious virus production and interaction with the receptor CD163", International PRRS Symposium, pp 56 30.Dea S., Gagnon C A., Mardassi H., Pirzadeh B., Rogan D (2000), "Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates", Arch Virol, 145 (4), pp 659-688 31.Feng Y., Zhao T., Nguyen T., Inui K., Ma Y., Nguyen T H., Nguyen V C., Liu D., Bui Q A., To L T., Wang C., Tian K., Gao G F (2008), "Porcine respiratory and reproductive syndrome virus variants, Vietnam and China, 2007", Emerg Infect Dis, 14 (11), pp 1774-1776 32.Gonin P., Pirzadeh B., Gagnon C A., Dea S (1999), "Seroneutralization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus correlates with antibody response to the GP5 major envelope glycoprotein", J Vet Diagn Invest, 11 (1), pp 20-26 33.Indik S., Schmoll F., Sipos W., Klein D (2005), "Genetic variability of PRRS virus in Austria: consequences for molecular diagnostics and viral quantification", Vet Microbiol, 107 (3-4), pp 171-178 34.Keffaber K K (1989), "Reproductive failure of unknown etiology", Am Assoc Swine Pratitioners Newslett., 1, pp 1-10 35.Lee C., Hodgins D., Calvert J G., Welch S K., Jolie R., Yoo D (2006), "Mutations within the nuclear localization signal of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus Nucleocapsid protein attenuate virus replication", Virology, 346 (1), pp 238-250 36.Li J., Yin Y., Guo B., Zhou S., Zhang Y., Liu X., Sun T (2012), "Sequence analysis of the NSP2, ORF5, and ORF7 genes of 11 PRRS virus isolates from China", Virus Genes, 45 (2), pp 256-264 37.Madsen K G., Hansen C M., Madsen E S., Strandbygaard B., Botner A., Sorensen K J (1998), "Sequence analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus of the American type collected from Danish swine Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 58 herds", Arch Virol, 143 (9), pp 1683-1700 38.Mardassi H., Massie B., Dea S (1996), "Intracellular synthesis, processing, and transport of proteins encoded by ORFs to of porcine reproductive and respiratory syndrome virus", Virology, 221 (1), pp 98-112 39.Meng X J., Paul P S., Halbur P G (1994), "Molecular cloning and nucleotide sequencing of the 3'-terminal genomic RNA of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus", J Gen Virol, 75 (7), pp 1795-1801 40.Meng X J., Paul P S., Halbur P G., Lum M A (1995a), "Phylogenetic analyses of the putative M (ORF 6) and N (ORF 7) genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): implication for the existence of two genotypes of PRRSV in the U.S.A and Europe", Arch Virol, 140 (4), pp 745755 41.Meng X J., Paul P S., Halbur P G., Morozov I (1995b), "Sequence comparison of open reading frames to of low and high virulence United States isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus", J Gen Virol, 76 (12), pp 3181-3188 42.Mengeling W L., Lager K M., Vorwald A C (1998), "Clinical consequences of exposing pregnant gilts to strains of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus isolated from field cases of "atypical" PRRS", Am J Vet Res, 59 (12), pp 1540-1544 43.Mengeling W L., Vorwald A C., Lager K M., Brockmeier S L (1996), "Diagnosis of porcine reproductive and respiratory syndrome using infected alveolar macrophages collected from live pigs", Vet Microbiol, 49 (1), pp 105115 44.Meulenberg J J., Hulst M M., De Meijer E J., Moonen P L., Den Besten A., De Kluyver E P., Wensvoort G., Moormann R J (1993), "Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS), is related to LDV and EAV", Virology, 192 (1), pp 62-72 45.Meteu E., Diaz I., 2008 The challenge of PRRS immunology Vet J 177 (3), pp 345-351 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 59 46.Murtaugh M P., Xiao Z., Zuckermann F (2002), "Immunological responses of swine to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection", Viral Immunol, 15 (4), pp 533-547 47.Pesente P., Rebonato V., Sandri G., Giovanardi D., Ruffoni L S., Torriani S (2006), "Phylogenetic analysis of ORF5 and ORF7 sequences of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) from PRRS-positive Italian farms: a showcase for PRRSV epidemiology and its consequences on farm management", Vet Microbiol, 114 (3), pp 214-224 48 Plana-Duran J., Climent I., Sarraseca J., Urniza A., Corte’s E., Vela C., Casal JI., 1997 Baculovirus expression of proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain Olot/91 Involvement of ORF3 and ORF5 proteins in protection, Virus Genes, 14, pp 19-29 49 Rowland R R., Schneider P., Fang Y., Wootton S., Yoo D., Benfield D A (2003), "Peptide domains involved in the localization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein to the nucleolus", Virology, 316 (1), pp 135-145 50.Saito K., Higuchi T., Kurata A., Fukuyasu T., Ashida K (1996), "Characterization of non-pigmented Staphylococcus chromogenes", J Vet Med Sci, 58 (7), pp 711-713 51.Shi M., Lam T T., Hon C C., Murtaugh M P., Davies P R., Hui R K., Li J., Wong L T., Yip C W., Jiang J W., Leung F C (2010), "Phylogeny-based evolutionary, demographical, and geographical dissection of North American type porcine reproductive and respiratory syndrome viruses", J Virol, 84 (17), pp 8700-8711 52 Yin G., Gao L., Shu X., Yang G., Guo S., Li W (2012), "Genetic diversity of the ORF5 gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in southwest China from 2007 to 2009", PLoS One, (3), pp 3756 53.Yoon K J., Zimmerman J J., Swenson S L., Mcginley M J., Eernisse K A., Brevik A., Rhinehart L L., Frey M L., Hill H T., Platt K B (1995), "Characterization of the humoral immune response to porcine reproductive and Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 60 respiratory syndrome (PRRS) virus infection", J Vet Diagn Invest, (3), pp 305-312 INTERNET 54.http://vietsciences.free.fr/timhieu/khoahoc/ykhoa/images/PRRS infectedMacrophage.jpg) 55 http://ias-cnsh.org/Portals/0/PRRS virus-structure) 56 http://en.wikipedia.org/wiki/Maltose-binding_protein) 57 http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=4A8ADF29-5056-8A76-4EC663375BA024E7) 58 http://en.wikipedia.org/wiki/Thioredoxin) 59 http://en.wikipedia.org/wiki/Maltose-binding_protein) 60 http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_G) 61 http://www Molecularcloning.com 62 http://dl.vnu.edu.vn/bitstream/11126/562/1/01050000508.pdf 63 http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-prrsv-structure.asp Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 61 [...]...có tính đặc hiệu cao và có thể chẩn đoán ngay ở bất kỳ điều kiện nào Ở nước ta, hiện chưa có các nghiên cứu sản xuất que thử chẩn đoán nhanh cho bệnh PRRS tương tự Vì vậy với mong muốn tạo được que chẩn đoán nhanh với giá thành phù hợp ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài: Kiểm tra tính kháng nguyên của protein nucleocapsid phục vụ việc tạo kit chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn ... giá được hoạt tính sinh học của kháng nguyên Nội dung - Kiểm tra tính kháng nguyên của protein nucleocapsid - Thử nghiệm tạo kit chẩn đoán bệnh bằng que thử - Kiểm tra một số mẫu huyết thanh lợn bằng que thử Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 1.1.1 Triệu chứng lâm sàng... trong chẩn đoán virus và hiệu quả của vắc-xin và vì vậy các công trình nghiên cứu tốc độ phát triển của virus, giải trình tự của các mẫu nên được tiến hành thường xuyên 1.1.4 Tình hình nghiên cứu về hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại Việt Nam Cho đến nay ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, đặc biệt là nghiên cứu sâu về mầm bệnh, tính chất kháng. .. tiến hành điều tra một số trường hợp bệnh ở lợn có hiện tượng lợn con chết và lợn nái sảy thai và điều trị kháng sinh không hiệu quả Trong nghiên cứu này, người ta điều tra một số nguyên nhân gây bệnh trong đó có hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn Điều tra được tiến hành ở các đàn lợn gia đình, một số trại giống của Nhà nước và một số lò mổ Các nhà khoa học đã phát hiện thấy kháng thể PRRS... Phương pháp chẩn đoán dựa trên kháng nguyên- kháng thể Chẩn đoán nhanh sự tồn tại của tác nhân gây bệnh dựa trên cơ sở phản ứng kháng nguyên – kháng thể là một trong những hướng ứng dụng đang được quan tâm trên thế giới cũng như Việt nam 1.3.2.1 Bản chất của sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể Sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể phụ thuộc vào cấu trúc bề mặt của kháng nguyên và kháng thể... giữa dòng virus PRRS châu Âu và Bắc Mỹ ở khung đọc mở này là rất rõ, cụ thể sự tương đồng về trình tự nucleotide là 57-59% và tương đồng về trình tự axit amin là 62% (Andrey V G và cs, 1997) 1.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh 1.3.1 Chẩn đoán lâm sàng Về chẩn đoán lâm sàng thường dựa vào hai nhóm triệu chứng đó là các triệu chứng về rối loạn hô hấp và rối loạn sinh sản: Ở lợn nái tăng đột biến tỷ lệ... động dục hoặc không động dục trở lại, rối loại sinh sản có thể kéo dài đến vài tháng Biểu hiện các triệu chứng hô hấp bao gồm: loạn hô hấp, lợn biểu hiện đau khi thở, hắt hơi, tăng tần số hô hấp, thở khó, thở đứt quãng Khi bị nhiễm virus PRRS lợn con có tỷ lệ chết trước cai sữa cao, gầy yếu, bỏ ăn phù mắt, các nốt phồng rộp trên da, ỉa chảy, đi không vững và run, đứng choãi chân Lợn trưởng thành có biểu... bệnh và không cho ăn nội tạng từ lợn nghi mắc bệnh (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) 1.1.3 Tình hình nghiên cứu về hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trên thế giới Virus gây bệnh lợn tai xanh được biết đến vào cuối những năm 1980 ở Mỹ và Châu Âu, từ đó lan rộng khắp thế giới Thời kỳ này người ta đã công bố một loại bệnh gây ra viêm phổi, chậm phát triển, gây chết trên những con lợn đang sinh trưởng và lợn. .. rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 1.1.1 Triệu chứng lâm sàng Căn cứ vào các biểu hiện của lợn bị bệnh, người ta có thể chia thành hai loại triệu chứng: các triệu chứng rối loạn sinh sản ở lợn nái và các triệu chứng hô hấp Các triệu chứng rối loạn sinh sản ở lợn nái bao gồm: lợn nái bị sốt 39 – 40oC, bỏ ăn, mệt mỏi, giảm tỷ lệ thụ thai và số con đẻ ra, sảy thai (tỷ lệ này có thể đến 50% trong các đàn... mang tính kháng nguyên cao và là protein đa dạng trong hạt virus (Costers S và cs, 2009) Protein N là protein cơ bản nhất của virus, được phát hiện với lượng lớn trong các tế bào bị nhiễm và chiếm khoảng 20 – 40% lượng protein có trong hạt virus Protein N là protein gây đáp ứng kháng thể sớm nhất và hầu hết những xét nghiệm chẩn đoán bệnh PRRS chủ yếu là phát hiện kháng thể kháng lại protein này Vài ... tạo kit chẩn đoán hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn Mục tiêu - Đánh giá hoạt tính sinh học kháng nguyên Nội dung - Kiểm tra tính kháng nguyên protein nucleocapsid - Thử nghiệm tạo kit chẩn. .. DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - - NGUYỄN THỊ KHÁNH LY KIỂM TRA TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA PROTEIN NUCLEOCAPSID PHỤC VỤ VIỆC TẠO KIT CHẨN ĐOÁN HỘI CHỨNG RỒI... loạn sinh sản hô hấp lợn 1.1.1 Triệu chứng lâm sàng Căn vào biểu lợn bị bệnh, người ta chia thành hai loại triệu chứng: triệu chứng rối loạn sinh sản lợn nái triệu chứng hô hấp Các triệu chứng