BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM - o0o - PHẠM NGỌC MỸ DUNG NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH CHIẾT VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA DỊCH CHIẾT TỪ CÂY SẢ (Cymbopogon citratus Stapf) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM GVHD: ThS TRẦN THỊ HUYỀN ThS NGUYỄN THỊ HẢI THANH KHÁNH HÒA -07/ 2015 i LỜI CAM ĐOAN Sinh viên: Phạm Ngọc Mỹ Dung Nơi đào tạo: Trường Đại học Nha Trang Khoa: Công nghệ Thực Phẩm Chuyên ngành: Chế Biến thủy sản Giáo viên hướng dẫn: ThS Trần Thị Huyền, Ths Nguyễn Thị Thanh Hải Tên đồ án tốt nghiệp: “Nghiên cứu trình chiết khảo sát khả kháng vi sinh vật dịch chiết từ Sả (Cymbopogon citratus Stapf)” Nội dung cam đoan: Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu hướng dẫn cô Trần Thị Huyền cô Nguyễn Thị Thanh Hải, với giúp đỡ tập thể cán Trung tâm TNTH Trường Đại học Nha Trang Các số liệu kết nêu đồ án trung thực chưa công bố Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với lời cam đoan Nha Trang, ngày 20 tháng năm 2015 Sinh viên Phạm Ngọc Mỹ Dung ii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG viii LỜI CẢM ƠN ix LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Sả Chanh 1.1.1 Phân lọai học 1.1.3 Phân bố điều kiện trồng trọt 1.1.3.1 Phân bố 1.1.3.2 Điều kiện trồng trọt .6 1.1.4 Thành phần hóa học tinh dầu Sả Chanh .6 1.1.5.Công dụng Sả Chanh .9 1.2 Giới thiệu chất kháng khuẩn từ thực vật 10 1.2.1 Giới thiệu chất kháng khuẩn thực vật 10 1.2.2 Khả kháng khuẩn dịch chiết Sả Chanh 12 1.2.3 Cơ chế kháng khuẩn 14 1.3 Giới thiệu phương pháp ly trích tinh dầu Sả Chanh 14 1.3.1 Phương pháp dùng dung môi ngâm chiết 14 1.3.2 Phương pháp lôi nước .15 1.3.3 Phương pháp chiết hồi lưu (soxhlet) 15 1.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết 16 1.4.1 Dung môi 16 1.4.2 Nhiệt độ chiết 16 iii 1.4.3 Thời gian chiết xuất 17 1.4.4 Độ mịn nguyên liệu .17 1.4.5 Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi .18 1.5 Nghiên cứu nước Sả Chanh 18 1.5.1 Nghiên cứu nước 18 1.5.2 Nghiên cứu nước .19 1.6 Giới thiệu chủng vi sinh vật 20 1.6.1 Escherichia coli 20 1.6.1.1 Phân loại E coli 21 1.6.1.2 Đặc điểm hình thái E coli 21 1.6.1.3 Tính chất nuôi cấy .21 1.6.1.4 Khả gây bệnh E coli 22 1.6.2 Staphylococcus aureus 22 1.6.2.1 Phân loại Staphylcoccus aureus 22 1.6.2.2 Đặc điểm hình thái S.aureus .23 1.6.2.3 Tính chất nuôi cấy .23 1.6.2.4 Khả gây bệnh S.aureus 24 1.6.3 Salmonella 24 1.6.3.1 Đặc điểm hình thái Salmonella 24 1.6.3.2 Tính chất nuôi cấy .25 1.6.3.3 Khả gây bệnh Salmonella 26 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 27 2.2 Dụng cụ, hóa chất thiết bị nghiên cứu 27 2.3 Nội dung nghiên cứu 29 2.4 Phương pháp nghiên cứu 29 2.4.1 Phương pháp thu mẫu xử lý mẫu 29 2.4.2 Bố trí thí nghiệm 30 2.4.2.1 Lập sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 30 iv 2.4.2.2 Thí nghiệm 1: khảo sát ảnh hưởng loại dung môi chiết đến khả kháng khuẩn dịch chiết Sả 32 2.4.2.3 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng nồng độ dung môi chiết đến khả kháng khuẩn dịch chiết Sả 34 2.4.2.4 Thí nghiệm 3: khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi chiết đến khả kháng khuẩn dịch chiết Sả 36 2.4.2.5 Thí nghiệm 4: khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến khả kháng khuẩn dịch chiết Sả 38 2.4.2.6 Thí nghiệm 5: khảo sát ảnh hưởng thời gian chiết đến khả kháng khuẩn dịch chiết sả 40 2.5 Phương pháp phân tích 41 2.5.1 Phương pháp cấy ria vi khuẩn, pha loãng vi khuẩn 41 2.5.2 Phương pháp khuếch tán giếng thạch 41 2.5.3 Phương pháp phân tích, xử lý số liệu 41 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 Ảnh hưởng loại dung môi chiết đến khả kháng khuẩn dịch chiết sả .42 3.2 Ảnh hưởng nồng độ dung môi chiết đến khả kháng khuẩn dịch chiết Sả 44 3.3 Ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết đến khả kháng khuẩn dịch chiết Sả 49 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến khả kháng khuẩn dịch chiết Sả 53 3.5 Ảnh hưởng thời gian chiết đến khả kháng khuẩn dịch chiết Sả 56 3.6 Đề xuất quy trình chiết tinh dầu Sả hoàn chỉnh 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 Kết luận: 60 Kiến nghị: 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 64 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BSA: Bismuth Sulfite Agar cm: centimet EMB: Eosin Methyl Blue g: gam ha: hecta m: met ml: mililit NA: Nutrient agar NL/DM: Nguyên liệu/dung môi PL: phụ lục TN: thí nghiệm µl: microlit vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Cây Sả Chanh (Cymbopogon citratus stapf) Hình 1.2 Cấu trúc phân tử citral 13 Hình 1.3 Vi khuẩn E coli 21 Hình 1.4 Vi khuẩn S.aureus 23 Hình 1.5 Vi khuẩn Salmonella 25 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 30 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng loại dung môi đến hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết từ Sả Chanh 32 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nồng độ dung môi đến hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết từ Sả Chanh 34 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Sả Chanh 36 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Sả Chanh 38 Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian đến hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết từ Sả Chanh 40 Hình 3.1 Hình ảnh đường kính vòng tan thu dịch chiết Sả chiết ba dung môi (1) nước; (2) ethanol; (3) aceton số vi khuẩn thị: a)E coli.b) S aureus.c)Salmonella 43 Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Sả lên vi khuẩn thị 45 Hình 3.3 Hình ảnh đường kính vòng tan thu dịch chiết Sả chiết bốn nồng độ dung môi chiết(1) ethanol 60%, (2) ethanol 70%, (3) ethanol 80%, (4) ethanol 90% số vi khuẩn thị: a)E coli.b) S aureus c)Salmonella 46 Hình 3.4 Ảnh hưởng tỉ lệ NL/DM đếnhoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Sả lên vi khuẩn thị 49 vii Hình 3.5 Hình hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Sả chiết bốn tỉ lệ NL/DM chiết (1) 1/5, (2) 1/10, (3) 1/15, (4) 1/20 số vi khuẩn thị : a)E coli.b)S aureus.c)Salmonella 50 Hình 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ đếnhoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Sả lên vi khuẩn thị 53 Hình 3.7 Hình hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Sả chiết bốn nhiệt độ chiết (1) 300C, (2) 350C, (3) 400C, (4) 450C số vi khuẩn thị: a)E coli b)S aureus c) Salmonella 54 Hình 3.8 Ảnh hưởng thời gian đến hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Sả lên vi khuẩn thị 56 Hình 3.9 Hình hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Sả chiết bốn thời gian chiết giờ, giờ, giờ, số vi khuẩn thị: a) E coli b)S aureus c) Salmonella 57 Hình 3.10 Sơ đồ quy trình chiết tinh dầu Sả hoàn chỉnh 59 viii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Thành phần hóa học tinh dầu SảC.citratus Sả C.nadus từ Togo .7 Bảng 1.2 Thành phần chất cấu tạo nên thành tế bào vi khuẩn 14 Bảng 3.1 Bảng đường kính vòng tan thể hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Sả với ba loại dung môi nước, ethanol, aceton lên loại vi sinh vật thị 42 ix LỜI CẢM ƠN Bốn năm khoảng thời gian em ngồi ghế nhà trường, trau dồi kiến thức mà kiến thức giúp em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp mình, bên cạnh kinh nghiệm vô quý báu, tảng vững cho em bước đường đời đầy chông gai phía trước Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, quý Thầy, Cô Bộ môn Công nghệ Chế biến Thủy sản Khoa Công nghệ Thực phẩm truyền đạt cho em kiến thức quý báu bổ ích Sự biết ơn sâu sắc em xin gửi đến cô Ths Trần Thị Huyền, cô Ths Nguyễn Thị Thanh Hải tận tình hướng dẫn động viên em suốt trình em làm đồ án Em xin chân thành cảm ơn thầy, cô Hội đồng chấm đồ án bỏ thời gian quý báu đọc nhận xét góp ý để giúp đồ án em hoàn thiện Con xin cảm ơn Ba, Mẹ dạy dỗ chăm sóc con, tạo điều kiện hỗ trợ mặt kinh phí tinh thần để hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp Và cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến tất anh chị, bạn phòng Công nghệ Sinh học quan tâm, giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm khoảng thời gian thực đồ án Xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày….tháng….năm 2015 58 Nhận xét: TừHình 3.8 Hình 3.9 có nhận xét sau: Khi dịch chiết chiết dung môi ethanol 700 nhiệt độ 400C thời gian cho vòng kháng khuẩn lớn nhấtở ba đĩa cấy chứa ba vi khuẩn thị E.coli, S.aureus, Salmonella, cụ thể đĩa cấy vi khuẩn E coli cho vòng kháng có đường kính 2,2 mm; đối vớiđĩa cấy vi khuẩn S.aureus cho vòng kháng có đường kính 7,3 mm đối vớiđĩa cấy vi khuẩn Salmonella cho vòng kháng có đường kính 7,7 mm Từ kết cho thấy chiết thời gian giờ, vòng kháng vi khuẩn thị lớn nhất, điều chứng tỏ với thời gian chiết dịch chiết Sả có hoạt tính kháng khuẩn cao Giải thích kết Khi thời gian chiết kéo dài giúp dung môi thẩm thấu vào tế bào Sả qua mao quản, tạo điều kiện thuận lợi cho trình khuếch tán hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn vào dung môi Khi bắt đầu chiết, chất có phân tử lượng nhỏ hòa tan khuếch tán vào dung môi, sau đến chất có phân tử lượng lớn (thường tạp nhựa, keo,…) Do thời gian chiết ngắn không chiết hết hoạt chất dược liệu Nhưng thời gian chiết dài quá, dịch chiết lẫn nhiều tạp chất Lúc đầu chất có Sả nhiều, nên khuếch tán chúng khỏi tế bào nhanh mạnh Nhưng lượng dung môi ngấm sâu vào thành phần Sả, lúc nồng độ chất tan có dung môi Sả gần đạt trạng thái bão hòa hàm lượng chất kháng khuẩn Sả giảm so với ban đầu khuếch tán môi trường dung môi, khuếch tán chất kháng khuẩn khỏi tế bào Sả giảm chậm Do khả hòa tan chúng vào môi trường chiết giảm dần ổn định, hiệu suất chiết không tăng, từ ảnh hưởng đến hàm lượng chất dịch chiết, gây tổn thất chất bay để lâu làm hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Sả 59 3.6 Đề xuất quy trình chiết tinh dầu Sả hoàn chỉnh Sơ đồ quy trình: Nguyên liệu Xử lý Xay Cân Dung môi: ethanol Nồng độ dung môi: 700 Chiết Tỉ lệ NL/DM: 1/10 Nhiệt độ: 400C Thời gian: Lọc Cô quay chân không Dịch chiết Sả có hoạt tính kháng khuẩn Hình 3.10.Sơ đồ quy trình chiết tinh dầu Sả hoàn chỉnh Thuyết minh quy trình: Sả sau thu mua phải đảm bảo không bị sâu bọ, dập nát Tiến hành công đoạn xử lý, loại bỏ bẹ già bên ngoài, rửa để Tiếp đến đem thái mỏng xay mẫu, cân mẫu với khối lượng chọn Mẫu sau cân xong tiến hành cho dung môi ethanol 700 vào với tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 1/10, đem chiết bể ổn nhiệt 400C với thời gian Để thu dịch chiết ta tiến hành lọc mẫu để loại bã, đem cô quay chân không đuổi dung môi, ta dịch chiết Sả cô đặc có hoạt tính kháng khuẩn 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Các kết thu từ sơ đồ bố trí thí nghiệm cho phép đưa số kết luận thông số trình chiết nhằm thu dịch chiết có hoạt tính kháng khuẩn từ Sả Chanh: - Dung môi ethanol nồngđộ 700 - Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 1/10 - Nhiệtđộ chiết 400C - Thời gian chiết - Dịch chiết thu trình chiết với thông số cho khả kháng vi khuẩn Salmonella tốt Kiến nghị: Mặc dù cố gắng trình làm đề tài thời gian có hạn số điều kiện khách quan nên đề tài chưa nghiên cứu vấn đề sau: + Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết từ phận khác Sả Chanh + Tiếp tục nghiên cứu tốiưu trình chiết để thu dịch chiết có hoạt tính kháng khuẩn cao + Thử nghiệm phương pháp chiết khác để thu dịch chiết có hoạt tính kháng khuẩn cao + Nghiên cứu phân lập định lượng hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn từ Sả chanh + Nghiên cứuứng dụng tinh dầu Sả Chanh bảo quản thực phẩm 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng việt: [1] Nguyễn Thị Thúy Anh (2011), Nghiên cứu khả kháng khuẩn sâu số loài thực vật, Đồ án Tốt nghiệpĐại học, TrườngĐại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh [2] Phạm Văn Dũng (2007), Phân lập xác định số gen sản sinh độc tố đường ruột vi khuẩn E coli kỹ thuật Multiplex – PCR thịt heo Nha Trang, Đồ án Tốt nghiệp Đại Học, Trường Đại học Nha Trang, Nha Trang [3] Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho (2013), “ Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn In vitro dịch chiết tỏi (allium Sativum L.) đối vớiE coligây bệnh vàE colikháng Ampicillin, Kanamycin”, Tạp chí Khoa học Phát triển, 11 (6), tr 804 – 808 [4] Lê Tự Hải, Đặng Công Anh Tuấn, Nghiên cứu tách xác định thành phần hóa học tinh dầu Pơmu Quảng Nam, TrườngĐại học Sư phạm, Đại họcĐà Nẵng, Đà Nẵng [5] Trần thị Hoa (2010), Nghiên cứu hoạt tính sinh học polysaccharide từ dương Xỉ Pteridium Aquilinum, Đồán tốt nghiệpĐại học, TrườngĐại học Nha Trang, Nha Trang [6] Phùng ThịÁi Hữu (2013), Nghiên cứu chiết tách xác định thành phần hóa học tinh dầu Sả Chanh quận Cẩm Lệ - Đà Nẵng, Khóa luận Tốt nghiệp, TrườngĐại học Sư phạm, Đại họcĐà Nẵng, Đà Nẵng [7] Phan Thị Kim Ngân (2012), Nghiên cứu tách chiết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ tim sen, Đồán Tốt nghiệpĐại học, TrườngĐại học Nha Trang, Nha Trang [8] Nguyễn Thị Mỹ Nương (2012), Nghiên cứu tách chiết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ vỏ long, Đồán Tốt nghiệpĐại Học, TrườngĐại học Nha Trang, Nha Trang 62 [9] Đỗ Thị Thúy Phượng (2007), Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn khả chống oxy hóa số hợp chất thứ cấp từ Xuân Hoa (Pseudranthemum Palatiferum), Khóa luận Tốt nghiệp, TrườngĐại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh, TP Hồ Chí Minh [10] Nguyễn Quốc Châu Thanh (2013), Ly trích khảo sát thành phần hóa học tinh dầu Sả Chanh (Cymbopogon citratus stapf.), Luậnán Tốt nghiệpĐại học, TrườngĐại học Cần Thơ, Cần Thơ [11] Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (1997), Vi sinh vật thú y, NXB Nông nghiệp Hà Nội, Tr 81 – 85 [12] Nguyễn Thị Bích Thuyền, Nguyễn Thị Diệu Thúy, Châu Thị Thúy Hằng (2012), “ khảo sát thành phần hóa học hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu chanh (Plectranthus Amboinicus Lour.)”, Tạp chí khoa học, 21a tr 144 – 147 [13] Trần Linh Thước (2006), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm, mĩ phẩm, NXB Giáo dục [14] Trần Đình Tú (2013), Nghiên cứu chiết rút Phlorotanin chống oxy hóa từ rong mơ Sargassum Mcclurei phương pháp vi sóng, Đồ án Tốt nghiệp Đại học, Tường Đại học Nha Trang, Nha Trang [15] Đặng Thị Tuyết (2012), Nghiên cứu chiết đánh giá hoạt tính chống oxy hóa pectin thô từ vỏ cùi bưởi citrus SP., Đồán Tốt nghiệpĐại học, TrườngĐại học Nha Trang, Nha Trang [16] Trịnh Kim Vẹn (2008), Khảo sát ảnh hưởng hệ dung môi, phương pháp nhiệt độ trích ly đến mật độ độ bền màu Anthocyanin từ bắp cải tím, Luận văn Tốt nghiệpĐại học, TrườngĐaị học Cần Thơ, Cần Thơ Tài liệu tham khảo nước ngoài: [17] Christopher E.Ekpenyong, Ernest E.Akpan, Nyebuk E.Daniel (2014), “ Phytochemical constituents therapeutic applications and toxicological profile of Cymbopogon citratus stapf (DC) leafextract”, Journal of pharmacognosy and phytochemistry,3(1), p 133 – 141 63 [18] D.ganijewala (2009), “ Cymbopogon assential oil: chemical compositions and bioactivities”, International journal of essential oil therapeutics, p 56 – 65 [19] Kazuhiko Nakahara et al (2003), “ chemical composition and antifungal activity of essential oil from Cymbopogon nadus ( Citronella grass)”, JARQ, 37(4), p 249 – 252 [20] Koffi Koba, Komla Sanda et al (2009), “ In vitro cytotoxic activity of Cymbopogon citratus L and Cymbopogon nardus L essential oil from Togo”, Bangladesh J Pharmacol, p 29 – 34 [21] Luiz Cláudio Almeida Barbosa et al (2008), “ Evaluation of the chemical composition of Brazilian commercial cymbopogon citratus (DC) stapf samples”, Molecules, 13 p 1864 – 1874 [22] Ronicely Pereira Rocha et al (2014), “ Influence of plant age on the content and composition of essential oil of Cymbopogon citratus (DC) stapf.”, Journal of Medicinal plant Research, (37), p 1121 – 1126 [23] Zeneida Teixeira Pindo et al (2015), “ Chemical composition and insecticidal activity of Cymbopogon citratus essential oil from Cuba and Brazil against housefly”, Baraz J Vet Parasitol, 24 (1), p 36 – 44 Tài liệu tham khảo webside: [24] www.khoahocphothong.com.vn [25] www.vinacare.vn [26] www.wikipedia.org 64 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH QUÁ TRÌNH CHIẾT TINH DẦU SẢ Hình ảnh trình xử lý nguyên liệu: Sả sau loại bỏ bớt phần bẹ già Sả thái mỏng Sả sau xay xong 65 Hình ảnh thí nghiệm 1: xác định loại dung môi chiết Chiết Sả cốc thủy tinh với ba dung môi nước, ethanol, aceton Dịch chiết Sả sau lọc Dịch chiết Sả sau cô quay chân không 66 Hình ảnh thí nghiệm 2: xác định nồng độ dung môi chiết Dịch chiết Sả sau cô quay chân không Hình ảnh thí nghiệm 3: xác định tỉ lệ nguyên liệu/dung môi chiết Dịch chiết Sả sau cô quay chân không 67 Hình ảnh thí nghiệm 4: xác định nhiệt độ chiết Dịch chiết Sả sau cô quay chân không Hình ảnh thí nghiệm 4: xác định nhiệt độ chiết Dịch chiết Sả sau cô quay chân không 68 PHỤ LỤC PHƯƠNG PHÁP CẤY RIA VÀ PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN TRÊN GIẾNG THẠCH Phương pháp cấy ria Chuẩn bị: - Đĩa petri: gói báo đem sấy tủ sấy nhiệt độ 1600C, thời gian - Môi trường pha bình tam giác, làm nút đậy kín miệng bình, bao miệng bình giấy bạc - Nước muối sinh lý: sau pha xong, hút vào ống nghiệm ml, làm nút đậy kín ống nghiệm, bao miệng ống nghiệm giấy bạc, đem hấp vô trùng tủ hấp với nhiệt độ 1210C, thời gian 15 phút - Tủcấy: vệ sinh tủ cấy cồn 700 Công thức phamôi trường nước muối sinh lý: Môi trường NA: Nutrient: gam Agar: 20 gam Nước cất: 1000 ml Nước muối sinh lý: Pepton: 10 gam NaCl: 10 gam KH2PO4: 1,5 gam Na2HPO4: 3,6 gam Nước cất: 1000 ml Tiến hành cấy ria: - Khử trùng bề mặt bàn tay cồn 700, chờ khô đốt đèn cồn Đĩa môi trường đổ bảo quản lạnh nhiệt độ 40C – 80C, trước dùng đặt vào tủ ấm 370C khoảng 30 phút cho mặt thạch thật khô - Dùng bút ghi lên đáy hộp petri tên vi khuẩn ngày cấy, người cấy - Đốt que cấy lửa đèn cồn thao tác lấy mẫu ống nghiệm 69 - Dùng ngón ngón ( bàn tay trái ) ấn vào tâm đĩa petri, ngón lại xoay hơ mép nắp đĩa đèn cồn trước cấy - Cầm đĩa lọt vào lòng bàn tay trái, ngón ngón út tỳ vào nắp để đẩy nắp lên cho nắp đáy tạo góc khoảng 450 - Đưa đầu que cấy vào phết góc nhỏ, sát thành đĩa - Thực cấy ria hình gíc giắc Sau cấy xong đường thứ nhất, hơ que cấy lửa đèn cồn, chờ que cấy nguội, tiếp tục từ điểm dừng đường cấy thứ tiến hành cấy đường cấy thứ hai, đường cấy thứ ba điểm dừng đường cấy thứ hai, cấy cho đường cấy không dính vào - Sau cấy đặt úp petri lại, gói lại đặt vào tủ ấm nhiệt độ 370C, thời gian 24 Phương pháp khuếch tán giếng thạch Chuẩn bị: bước chuẩn bịtương tự phương pháp cấy ria Cách tiến hành: + Môi trường NA sau hấp khử trùng xong tiến hành đổ vào đĩa petri với thể tích 25 – 30ml để tạo mặt thạch + Sau dùng pipetman hút xác 100µl dung dịch vi khuẩn chuẩn bị cho vào đĩa petri chứa môi trường NA Dùng que cấy trang trải vi khuẩn lên bề mặt thạch để vi khuẩn sinh trưởng mặt thạch + Đợi mặt thạch tương đối khô, tiến hành dùng đầu típ xanh đục lỗ + Dùng pipetman hút xác 100µl dịch chiết Sả cho vào lỗ thạch + Các thao tác cần phải thực điều kiện vô trùng, đảm bảo nguyên tắc sử dụng tủ cấy + Ủ đĩa petri 24h nhiệt độ 370C Sau quan sát kết dựa vào vòng kháng khuẩn dịch chiết Sả Nếu dịch Sả có tạo vòng kháng khuẩn chứng tỏ dịch Sả có khả kháng chủng vi khuẩn thử nghiệm, đo đường kính kháng khuẩn báo cáo kết 70 Công thức tính vòng kháng: A=D-d Trong đó: A đường kính vòng kháng dịch chiết Sả D đường kính vòng tan lớn (mm) d đường kính lỗ thạch (mm) 71 PHỤ LỤC BẢNG ĐƯỜNG KÍNH VÒNG TAN THỂ HIỆN HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT SẢ Bảng PL1 Bảng đường kính vòng tan thể hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Sả với bốn nồng độ dung môi ethanol 600, ethanol 700, ethanol 800, ethanol 900 lên loại vi sinh vật thị Đường kính vòng tan Vi Đường kính vòng tan (mm) (A = D - 6mm) Ethanol Ethanol Ethanol Ethanol 60%(1) 70%(2) 80% (3) 90% (4) Escherichia coli 1,3 ± 0,3A 4,5 ± 0,5B 1,7 ± 0,3A 1,8 ± 0,3A Staphilcoccus aureus 1,3 ± 0,3a 5,3 ± 0,3c ± 0,3b 2,2 ± 0,1b Salmonella 1,3 ± 0,3a ± 0,5c 2,4 ± 0,1b 2,3 ± 0,3b Sinh vật thị Bảng PL2 Bảng đường kính vòng tan thể hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Sả với bốn tỉ lệ NL/DM: 1/5; 1/10; 1/15; 1/20 lên loại vi sinh vật thị Đường kính vòng tan Đường kính vòng tan (mm) (A = D - 6mm) Vi Sinh vật 1/5 (1) 1/10 (2) 1/15 (3) 1/20 (4) Escherichia coli 1,2 ± 0,3A 3,3 ± 0,3C 1,8 ± 0,3B 1,7 ± 0,1B Staphilcoccus aureus 1,7 ± 0,3a 5,3 ± 0,3c 2,8 ± 0,3b 1,8 ± 0,3a Salmonella 2,7 ± 0,3ab 5,9 ± 0,4c 3,1 ± 0,1a 2,2 ± 0,2a thị 72 Bảng PL3 Bảng đường kính vòng tan thể hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Sả với bốn nhiệt độ chiết 300C; 350C; 400C; 450C; lên loại vi sinh vật thị Đường kính vòng tan Đường kính vòng tan (mm) (A = D - 6mm) Vi 300C (1) 350C (2) 400C (3) 450C (4) Escherichia coli 0,3 ± 0,1A 0,7 ± 0,3A 3,2 ± 0,3B 0,7 ± 0,3A Staphilcoccus aureus 2,8 ± 0,3b 4,3 ± 0,3c 6,8 ± 0,3d 1,2 ± 0,3a Salmonella 3,2 ± 0,3a 4,3 ± 0,3b 7,2 ± 0,3c 4,7 ± 0,3b Sinh vật thị Bảng PL4 Bảng đường kính vòng tan thể hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết Sả với bốn thời gian chiết giờ; giờ; giờ; lên loại vi sinh vật thị Đường kính vòng tan Đường kính vòng tan (mm) (A = D - 6mm) Vi Sinh vật (1) (2) (3) (4) Escherichia coli 0,4 ± 0,1A 0,7 ± 0,3A 2,2 ± 0,3B 0,8 ± 0,3A Staphilococcus aureus 3,2 ± 0,3b 4,3 ± 0,3c 7,3 ± 0,3d 2,2 ± 0,3a Salmonella 4,8 ± 0,3ab 5,3 ± 0,3b 7,7 ± 0,3c 4,7 ± 0,3a thị [...]... dụng kháng khuẩn rất tốt đối với vi khuẩn staphylococcus aureus, Escherichia coli, nấm Aspergillus niger… Tuy nhiên, vi c nghiên cứu về đặc tính kháng khuẩn của cây Sả Chanh chưa được quan tâm nhiều ở Vi t Nam Vì vậy, em chọn đề tài “ Nghiên cứu quá trình chiết và khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của dịch chiết từ cây Sả( Cymbopogon Citratus Stapf) nhằm đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ. .. chiết từ cây Sả, góp phần nâng cao giá trị sử dụng của cây Sả Chanh tại Vi t Nam cũng như trên toàn Thế Giới Mục tiêu của đề tài: khảo sát ảnh hưởng của chế độ chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Sả Nội dung của đề tài: + Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Sả + Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chiết đến hoạt tính kháng. .. khuẩn của dịch chiết từ cây Sả 2 Ý nghĩa khoa học: đề tài cung cấp dữ liệu khoa học có ý nghĩa tham khảo về sự ảnh hưởng của dung môi chiết, thời gian và nhiệt độ chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Sả Ý nghĩa thực tiễn: đề tài chỉ mới được nghiên cứu với quy mô tại phòng thí nghiệm, dựa trên kết quả khảo sát của đề tài, các nhà sản xuất có thể mở rộng phạm vi sử dụng dịch chiết từ cây. .. năng kháng khuẩn của dịch chiết từ Sả vẫn là vấn đề đang được nghiên cứu 1.5.2 Nghiên cứu ngoài nước Trên thế giới, hoạt tính kháng khuẩn của các loại tinh dầu thực vật đã được quan tâm và nghiên cứu từ rất lâu, và đã có những nghiên cứu được công bố + Năm 2003, Kazuhico Nakahara và các cộng sựđã nghiên cứu về thành phần hóa học, khả năng kháng nấm của tinh dầu Sả chiết xuất từ loài SảC.nadus, Các thành... phút và lá Sả Chanh là 150 phút, thể tích nước cất là 500 ml, nhiệt độ là 1500C Thành phần chính của tinh dầu là cis–citral và trans-citral Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng tinh dầu Sả Chanh có khả năng chốngoxy hóa và c chế khả năng phát triển của một số loạivi khuẩn, vi nấm là khá tốt [3] 19 - Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội cũng đã nghiên cứu về lợi ích của cây Sả Chanh, nhưng khả năng kháng. .. như khả năng kháng một số vi sinh vật gây bệnh + Tinh dầu Sả có công dụng diệt côn trùng: một bài báo khoa học nói rằng, do tinh dầu có đặc tính dễ bay hơi, có mùi khó chịu, có thể gây độc cho côn trùng, tác động vào hệ thần kinh nội tiết và sinh sản của côn trùng, làm cho chúng chết đi [23] + Tinh dầu Sả có khả năng kháng nấm: một nghiên cứu ã nói về thành phần hóa học và hoạt tính kháng nấm của tinh... dầu Sả[ 22] + Bộ phận khác nhau của cây Sả (thân, lá, hoa): một bài báo khoa họcđã nghiên cứu và chỉ ra đượcở các bộ phân khác nhau của cây Sả sẽ có thành phần hóa học khác nhau, đối với loài SảC.martinii thì geraniol là thành phần chính (có 53,41% geraniol 9 trong tinh dầu chiết xuất từ lá và 69,63% geraniol trong tinh dầu chiết xuất từ hoa) [18] 1.1.5.Công dụng của cây Sả Chanh Hiện nay, Sả Chanh và. .. Nhiều loại saponin có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn 1.2.2 Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Sả Chanh Trong dịch chiết Sả Chanh có chứa các thành phần kháng khuẩn chủ yếu sau: + Citral: là thành phần chính trong dịch chiết Sả, gồm hai đồng phân cis-citral (neral), trans-citral (geranial) Citral có khả năng kháng khuẩn rất mạnh có thể tiêu diệt được cả vi khuẩn hiếu khí và kị khí như Staphylococcus... trồng để sản xuất tinh dầu Sả Jammu với tên thương phẩm là Jammu lemongrass oil + Cymbopogon citratus Stapf (Sả Chanh): được trồng để sản xuất tinh dầu có tên thương phẩm là West Indian Lemongrass oil, thành phần chính chứa hàm lượng citral cao (80 - 90%) [18] 1.1.2 Đặcđiểm hình thái của cây SảChanh Hình 1.1 .Cây Sả Chanh (Cymbopogon citratus stapf) Cây Sả Chanh (Cymbopogon citratus stapf) là loại cây nhiệt... chính của cả hai thử nghiệm các loại tinh dầu, neral, geranial và citronellal là có khả năng gây độc cao cho dòng tế bào HaCaT Do đó, tác dụng gây độc tế bào của các loại dầu thiết yếu của C .citratus và C nardus tìm thấy trong nghiên cứu này chắc chắn làdo thành phầncitral (neral và geranial) [20] + Năm 2014, Christopher E.Ekpenyuong và các cộng sựđã nghiên cứu về cácứng dụng của tinh dầu Sả và khả năng ... tâm nhiều Vi t Nam Vì vậy, em chọn đề tài “ Nghiên cứu trình chiết khảo sát khả kháng vi sinh vật dịch chiết từ Sả( Cymbopogon Citratus Stapf) nhằm đánh giá khả kháng khuẩn dịch chiết từ Sả, góp... đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu trình chiết khảo sát khả kháng vi sinh vật dịch chiết từ Sả (Cymbopogon citratus Stapf) Nội dung cam đoan: Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu hướng dẫn cô Trần... môi chiết đến khả kháng khuẩn dịch chiết Sả 49 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến khả kháng khuẩn dịch chiết Sả 53 3.5 Ảnh hưởng thời gian chiết đến khả kháng khuẩn dịch chiết Sả