Nghiên cứu quy trình công nghệ tách chiết tinh chế Mangostin vỏ măng cụt Garcinia Mangostnan L làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư Mai Thị Hiên Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Khoa Sinh học Luận văn Thạc sĩ ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30 Người hướng dẫn: TS Đỗ Thị Tuyên Năm bảo vệ: 2011 Abstract Tổng quan măng cụt; hợp chất xanthone có vỏ măng cụt; hoạt tính sinh học mangostin dẫn xuất xanthone khác; peroxidase; peroxy hóa lipid Giới thiệu số vi sinh vật gây bệnh người Staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa, Candida albicans Nghiên cứu mangostin Việt Nam giới Trình bày nguyên liệu hóa chất; thiết bị thí nghiệm; phương pháp nghiên cứu -mangostin xác định cấu trúc, tối ưu điều kiện tách(tách chiết chiết, phương pháp tinh sạch, sắc kí mỏng, xác định làm lượng malondialdehyde, xác định hoạt độ peroxidase, định lượng protein, ) mangostin từ vỏĐưa kết thảo luận: tách chiết tinh -mangostin; hoạt tính chống oxiquả măng cụt; hoạt tính kháng khuẩn -mangostin.hóa Keywords Sinh học thực nghiệm; Công nghệ tách chiết; Điều trị ung thư; Quả măng cụt Content Mở đầu Các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên vinblastine từ dừa cạn (Catharanthus roseus), taxol thông đỏ (Taxus brevifolia), colchicine từ tỏi độc (Colchicum autunale), scutebalcaletone từ bán chi liên (Scutellaria barbata), số hoạt chất từ chè xanh (Camellia sinensis), sử dụng để điều trị cho bệnh nhân ung thư Trong đó, măng cụt Garcinia mangostana L ăn trồng nhiều miền Nam, Việt Nam Theo kinh nghiệm dân gian, vỏ măng cụt dùng để điều trị nhiều loại bệnh nhiễm trùng Tuy nhiên việc khai thác ứng dụng hoạt chất sinh học từ vỏ măng cụt nước ta chưa quan tâm nhiều Xuất phát từ thực tế đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ tách chiết tinh chế mangostin vỏ măng cụt Garcinia mangostana L làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư” thực với mục tiêu: tách chiết tinh chế -mangostin từ vỏ măng cụt nghiên cứu số hoạt tính sinh học -mangostin Tổng quan Măng cụt có tên khoa học Garcinia mangostana L thuộc họ Bứa (Clusiaceae), loại ăn trồng vùng khí hậu nhiệt đới, đặc biệt phổ biến vùng Đông Nam Á, Ấn Độ, Sri Lanka Ở Việt Nam măng cụt chủ yếu trồng vùng đồng sông Cửu Long với tổng diện tích lên tới 4900 ha, cho sản lượng khoảng 4500 Theo dự án phát triển sản xuất xuất rau, hoa tươi Việt Nam, dự kiến phát triển diện tích trồng măng cụt vùng đồng sông Cửu Long lên khoảng 11300 ha, cho sản lượng 24000 Trong tập trung trồng chủ yếu tỉnh Bến Tre, Vĩnh Long, Trà Vinh Bình Dương Măng cụt đòi hỏi điều kiện thổ nhưỡng khắt khe, khí hậu nóng ẩm Do đó, măng cụt phân bố vùng có khí hậu ấm áp, không tiến xa vùng khí hậu lạnh phía bắc mà dừng lại Huế Măng cụt loài thực vật giàu dẫn xuất xanthone phát Trong số 200 dẫn xuất xanthone tìm thấy thực vật có đến 60 dẫn xuất măng cụt, chủ yếu tập trung phần vỏ Trong số dẫn xuất xanthone có vỏ măng cụt -mangostin có hàm lượng cao nhất, chiếm khoảng 0,02-0,2% trọng lượng khô Tiếp đến -mangostin -mangostin, chiếm khoảng 0,016-0,07% Hàm lượng chất gacinone, đặc biệt garcinone E chiếm khoảng 0,01-0,035%, chất có hoạt tính ức chế mạnh phát triển nhiều loại tế bào ung thư, nhiều nhà khoa học quan tâm Hiện nay, dẫn xuất xanthone từ măng cụt, nhà khoa học quan tâm nhờ hoạt tính sinh học quan trọng hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chống oxi hóa, đặc biệt hoạt tính chống ung thư, nhằm mục đích tìm hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư Nguyên liệu phương pháp Chủng P aeruginosa JN 592444.1 cung cấp Phòng Vi sinh vật đất, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Chủng S aureus cung cấp Phòng Vi sinh vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Chủng nấm C albicans ATCC 10231 mua từ bảo tàng giống chuẩn Mỹ, 10801 University Boulevard Manassas, VA 20110, USA Chủng P aeruginosa JN 592444.1 cung cấp Phòng Vi sinh vật đất, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Chủng S aureus cung cấp Phòng Vi sinh vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Chủng nấm C albicans ATCC 10231 mua từ bảo tàng giống chuẩn Mỹ, 10801 University Boulevard Manassas, VA 20110, USA Chuột nhắt trắng, giống đực, chủng, dòng Swiss, trưởng thành, khỏe mạnh, trọng lượng 22  g (n = 72) cung cấp từ Ban chăn nuôi Học viện Quân Y Chuột nhắt trắng, giống đực, chủng, dòng Swiss, trưởng thành, khỏe mạnh, trọng lượng 22  g (n = 72) cung cấp từ Ban chăn nuôi Học viện Quân Y Vỏ măng cụt thu thập từ khu vực Hà Nội Nguyên liệu sấy khô tủ ấm 60C, nghiền thành bột mịn Bảo quản điều kiện khô ráo, thoáng mát Các phương pháp sử dụng: Phương pháp tách chiết mangostin từ vỏ măng cụt; Phương pháp sắc kí, phương pháp xác định hàm lượng protein Bradford; Phương pháp xác định hàm lượng MDA; Phương pháp xác định hoạt độ peroxidase Kết Dung môi an toàn, hiệu kinh tế phù hợp cho trình tách chiết mangostin từ vỏ măng cụt ethanol, tỷ lệ dung môi : nguyên liệu 3:1, 60C, Sản phẩm thu có độ 98,5%, chiếm 0,13% khối lượng nguyên liệu ban đầu Chế phẩm tinh có khả kháng lại số vi khuẩn nấm gây bệnh người S aureus, P aeruginosa, C albicans Diệt 100% vi khuẩn S aureus nồng độ 15 g/ml; ức chế 70% phát triển P aeruginosa nồng độ 1000 g/ml, 50% phát triển nấm C albicans nồng độ 1500 g/ml Hoạt chất -mangostin có khả chống oxi hóa, bảo vệ gan khỏi công chất độc có tính oxi hóa mạnh CCl4 Thể tác dụng làm tăng hoạt độ peroxidase làm giảm hàm lượng MDA gan chuột nhóm nghiên cứu, đặc biệt hai nhóm nghiên cứu: nhóm chuột uống -mangostin liều 0,1 mg/10 g thể trọng, hoạt độ peroxidase gan tăng 45% so với nhóm đối chứng, 57% so với nhóm nhiễm độc CCl4; nhóm chuột uống -mangostin liều 0,2 mg/10 g thể trọng, hàm lượng MDA gan chuột giảm 6% so với nhóm đối chứng, giảm 60% so với nhóm nhiễm độc CCl4 Kiến nghị Thử nghiệm hoạt tính chống ung thư -mangostin số dòng tế bào ung thư từ chuột Sản xuất -mangostin qui mô pilot để làm thuốc hỗ trợ phòng chống điều trị ung thư chống oxi hóa References Tiếng Việt Trương Văn Châu, Trần Hồng Quang, Đỗ Ngọc Liên (2004), "Đặc tính kháng khuẩn hợp chất phenolic số loài thuộc chi Garcinia L " Tạp chí Sinh học 26(4): pp 59-62 Đào Hùng Cường, Đỗ Thị Thuý Vân (2010), "Nghiên cứu chiết tách xác định xanthone từ vỏ Măng cụt (Garcinia mangostin L)", Tạp chí Khoa học công nghệ, Đại học Đà nẵng, 5(40): pp 167-173 Nguyễn Thị Ngọc Dao, Đỗ Thị Hồng Cẩm (1997), "Hoạt độ peroxidase số tổ chức thực vật", Tạp chí Y học Việt Nam, 6: pp 39-43 Hoàng Văn Huấn (1998), "Nghiên cứu biến đổi hệ thống enzyme cytochrome P450 vài thông số hóa sinh có liên quan nhiễm độc thực nghiệm nhiên liệu lỏng tên lửa", Luận văn thạc sỹ y học, Học viện Quân Y, Bộ Giáo dục Đào tạo - Bộ Quốc Phòng Đỗ Tất Lợi (2000), Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB Y học Hà Nội 567568 Hoàng Công Minh (2001), "Nghiên cứu ảnh hưởng hỗn hợp dichlorodiethyl sulfide với chlorovinyl dichlorarsine lên số tiêu độc học, hóa sinh, huyết học động vật thực nghiệm tác dụng thuốc điều trị", Luận án tiến sỹ y học, Học viện Quân y, Bộ Giáo dục Đào tạo - Bộ Quốc phòng Nguyễn Mai Phương, Nguyễn Thị Thịnh, Nguyễn Diệu Linh, Phan Tuấn Nghĩa (2010), "Thu nhận tìm hiểu tác dụng sinh học chế phẩm chứa xanthone từ vỏ măng cụt (Garcinia Mangostin L.)", Tạp chí công nghệ sinh học, 8: pp 717-735 Nguyễn Thị Mai Phương, Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Đỗ Ngọc Liên (2004), "Thành phần polyphenol vỏ măng cụt (Garcinia mangostana L) tác dụng ức chế sinh axit vi khuẩn sâu Streptococcus mutans", Tạp chí Dược học, 44: pp 18-21 Đỗ Thị Tuyên , Nguyễn Thu Thùy , Nguyễn Ngo ̣c Ha ̣nh , Nguyễn Thi ̣Ánh Tuyế t , Phùng Văn Trung, Quyề n Đình Thi, Nguyễn Thi ̣Mai Phương, Nguyễn Thi ̣Ngo ̣c Dao (2010), "Nghiên cứu quy trình tách chiết hoạt tính kháng khuẩn alphamangostin từ vỏ Măng cụt Garcinia mangostana L", Hội nghị Khoa học kỉ niệm 35 năm viện Công nghệ Khoa học Việt Nam, pp 136-143 Tiếng Anh 10 Anderson, J B (2005), "Evolution of antifungal-drug resistance: mechanisms and pathogen fitness", Nat Rev Microbiol, 3(7): pp 547-556 11 Balaram, P (2011), "Cancer: human mortality and cellular immortality", Curr Sci, 100(12): pp 1761-1762 12 Bumrungpert, K., Kalpravidh, R W., Chia-Chi Chuang, C C., Overman, A., Martinez, K., Kennedy, A., McIntosh, M (2010), "Xanthones from Mangosteen inhibit inflammation in human macrophages and in human adipocytes exposed to macrophage-conditioned media", J Nutr, 140: pp 842–847 13 Cohen, R J., Shannon, B A., McNeal, J E., Shannon, T., Garrett, K L (2005), "Propionibacterium acnes associated with inflammation in radical prostatectomy specimens: a possible link to cancer evolution", J Urol, 173(6): pp 1969-1974 14 Daniel, M B., Michael, D R., Stuart, J E (1996), Protein methods, ed WileyLiss, New York 15 Devi Sampath, P., Vijayaraghavan, K (2007), "Cardioprotective effect of alphamangostin, a xanthone derivative from mangosteen on tissue defense system against isoproterenol-induced myocardial infarction in rats", J Biochem Mol Toxicol, 21(6): pp 336-339 16 Ee, G C., Daud, S., Taufiq-Yap, Y H., Ismail, N H., Rahmani, M (2006), "Xanthones from Garcinia mangostana (Guttiferae)", Nat Prod Res, 20(12): pp 1067-1073 17 Favari, L., Perez-Alvarez, V (1997), "Comparative effects of colchicine and silymarin on CCl4-chronic liver damage in rats", Arch Med Res, 28(1): pp 11-17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 Gopalakrishnan, G., Banumathi, B., Suresh, G (1997), "Evaluation of the antifungal activity of natural xanthones from Garcinia mangostana and their synthetic derivatives", J Nat Prod, 60(5): pp 519-524 Iinuma, M., Tosa, H., Tanaka, T., Asai, F., Kobayashi, Y., Shimano, R., Miyauchi, K (1996), "Antibacterial activity of xanthones from guttiferaeous plants against methicillin-resistant Staphylococcus aureus", J Pharm Pharmacol, 48(8): pp 861865 Jakab, E., Zbinden, R., Gubler, J., Ruef, C., von Graevenitz, A., Krause, M (1996), "Severe infections caused by Propionibacterium acnes: an underestimated pathogen in late postoperative infections", Yale J Biol Med, 69(6): pp 477-482 Josephy, P D., Eling, T., Mason, R P (1982), "The horseradish-peroxidase catalyzed oxidation of 3,5,3'5'-tetramethylbenzidine Free radical and charge- transfer complex intermediates", J Biol Chem, 257: pp 3669-3675 Jung, H A., Su, B N., Keller, W J., Mehta, R G., Kinghorn, A D (2006), "Antioxidant xanthones from the pericarp of Garcinia mangostana (Mangosteen)", J Agric Food Chem, 54(6): pp 2077-2082 Kaomongkolgit, R., Jamdee, K., Chaisomboon, N (2009), "Antifungal activity of alpha-mangostin against Candida albicans", J Oral Sci, 51(3): pp 401-406 Mahabusarakam, W., Proudfoot, J., Taylor, W., Croft, K (2000), "Inhibition of lipoprotein oxidation by prenylated xanthones derived from mangostin", Free Radic Res, 33(5): pp 643-659 Matsumoto, K., Akao, Y., Yi, H., Ohguchi, K., Ito, T., Tanaka, T., Kobayashi, E., Iinuma, M., Nozawa, Y (2004), "Preferential target is mitochondria in alphamangostin-induced apoptosis in human leukemia HL60 cells", Bioorg Med Chem, 12(22): pp 5799-5806 McAlester, G., O'Gara, F., Morrissey, J P (2008), "Signal-mediated interactions between Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans", J Med Microbiol, 57(5): pp 563-569 Misra, H., Dwivedi, B K., Mehta, D., Mehta, B K., Jain, D C (2009 ), "Development and validation of high performance thin-layer chromatographic method for fetermination of α-mangostin in fruit pericarp of mangosteen plant (Garcinia mangostana L.) using ultraviolet visible detection ", Rec Nat Prod, 3(4): pp 178-186 Molero, G., Diez-Orejas, R., Navarro-Garcia, F., Monteoliva, L., Pla, J., Gil, C., Sanchez-Perez, M., Nombela, C (1998), "Candida albicans: genetics, dimorphism and pathogenicity", Int Microbiol, 1(2): pp 95-106 Nakagawa, Y., Iinuma, M., Naoe, T., Nozawa, Y., Akao, Y (2007), "Characterized mechanism of alpha-mangostin-induced cell death: caspase-independent apoptosis with release of endonuclease-G from mitochondria and increased miR-143 expression in human colorectal cancer DLD-1 cells", Bioorg Med Chem, 15(16): pp 5620-5628 Nakatani, K., Atsumi, M., Arakawa, T., Oosawa, K., Shimura, S., Nakahata, N., Ohizumi, Y (2002), "Inhibitions of histamine release and prostaglandin E2 synthesis by mangosteen, a Thai medicinal plant", Biol Pharm Bull, 25(9): pp 1137-1141 Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K (1979), "Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction", Anal Biochem, 95(2): pp 351-358 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 Pedraza-Chaverri, J., Cardenas-Rodriguez, N., Orozco-Ibarra, M., Perez-Rojas, J M (2008), "Medicinal properties of Mangosteen (Garcinia mangostana)", Food Chem Toxicol, 46(10): pp 3227-3239 Peres, V., Nagem, T J., de Oliveira, F F (2000), "Tetraoxygenated naturally occurring xanthones", Phytochemistry, 55(7): pp 683-710 Pothitirat, W., Chomnawang, T M., Gritsanapan, W (2009), "Anti-acne inducing bacteria activity and alpha-mangostin content of Garcinia mangostana fruit rind extracts from different provenience", Songklanakarin J Sci Technol, 31(1): pp 41-47 Pothitirat, W., Gritsanapan, W (2008), "Quantitative analysis of total mangostins in Garcinia mangostana fruit rind", J Health Res, 22(4): pp 161-166 Rachel, J G., Franklin, D L (2008), "Pathogenesis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection", Clin Infect Dis, 46(5): pp 350-359 Sakagami, Y., Iinuma, M., Piyasena, K G., Dharmaratne, H R (2005), "Antibacterial activity of alpha-mangostin against vancomycin resistant Enterococci (VRE) and synergism with antibiotics", Phytomedicine, 12(3): pp 203-208 Sen, K A., Sarkar, K K., Mazumder, C P., Banerji, N., Uusvuori, R., Hase, T A (1980), "A xanthone from Garcinia mangostana", Phytochemistry, 14(10): pp 22232225 Shankaranarayan, D., Gopalakrishnan, C., Kameswaran, L (1979), "Pharmacological profile of mangostin and its derivatives", Arch Int Pharmacodyn Ther, 239(2): pp 257-269 Shibata, M A., Iinuma, M., Morimoto, J., Kurose, H., Akamatsu, K., Okuno, Y., Akao, Y., Otsuki, Y (2011), "alpha-Mangostin extracted from the pericarp of the mangosteen (Garcinia mangostana Linn) reduces tumor growth and lymph node metastasis in an immunocompetent xenograft model of metastatic mammary cancer carrying a p53 mutation", BMC Med, 9: pp 69 Steinberg, D (1997), "Low density lipoprotein oxidation and its pathobiological significance", J Biol Chem, 272(34): pp 20963-20966 Sun, D., Zhang, S., Wei, Y., Yin, L (2009), "Antioxidant activity of mangostin in cell-free system and its effect on K562 leukemia cell line in photodynamic therapy", Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 41(12): pp 1033-1043 Szymonik-Lesiuk, S., Czechowska, G., Stryjecka-Zimmer, M., Slomka, M., Madro, A., Celinski, K., Wielosz, M (2003), "Catalase, superoxide dismutase, and glutathione peroxidase activities in various rat tissues after carbon tetrachloride intoxication", J Hepatobiliary Pancreat Surg, 10(4): pp 309-315 Williams, P., Ongsakul, M., Proudfoot, J., Croft, K., Beilin, L (1995), "Mangostin inhibits the oxidative modification of human low density lipoprotein", Free Radic Res, 23(2): pp 175-184 Yates, P., Stout, G H (1958), "The structure of mangostin", J Am Chem Soc, 80: pp 1691-1700 Yu, L., Zhao, M., Yang, B., Qiangzhong, Z., Jiang, Y (2007), "Phenolics from hull of Garcinia mangostana fruit and their antioxidant activities", Food Chemistry, 104: pp 176-181  ... công nghệ tách chiết tinh chế mangostin vỏ măng cụt Garcinia mangostana L làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư thực với mục tiêu: tách chiết tinh chế  -mangostin từ vỏ măng cụt nghiên cứu số hoạt... ung thư, nhằm mục đích tìm hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư Nguyên liệu phương pháp Chủng P aeruginosa JN 592444.1 cung cấp Phòng Vi sinh vật đất, Viện Công nghệ. .. Phùng Văn Trung, Quy ̀ n Đình Thi, Nguyễn Thi ̣Mai Phương, Nguyễn Thi ̣Ngo ̣c Dao (2010), "Nghiên cứu quy trình tách chiết hoạt tính kháng khuẩn alphamangostin từ vỏ Măng cụt Garcinia mangostana