Đang tải... (xem toàn văn)
ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ BSA TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI CHUỘT GIAI ĐOẠN TRƯỚC LÀM TỔ
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC PHẠM THỊ LAN HƯƠNG ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ BSA (BOVINE SERUM ALBUMIN) TRONG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI CHUỘT GIAI ĐOẠN TRƯỚC LÀM TỔ KHĨA LUẬN CỬ NHÂN KHOA HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC ThS BS ĐỖ QUANG MINH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2004 Mục lục Trang Đặt vấn đề Tổng quan tài liệu I SINH SẢN TRÊN CHUỘT I.1 Nội tiết sinh sản I.2 Sự phát triển trưởng thành trứng I.3 Sự rụng trứng 2 2 I.4 Sự thụ tinh I.5 Sự phát triển phôi chuột giai đoạn sau làm tổ I.6 Các giai đoạn phát triển phôi chuột II QUY TRÌNH TẠO PHÔI - THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY … II.1 Quy trình giao phối tự nhiên II.1.1 Sự thụ tinh thể (in vivo) II.1.2 Sự thụ tinh ống nghiệm (in vitro) II.2 Kích thích buồng trứng (superovulation) II.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu kích thích … II.3.1 Ảnh hưởng tuổi trọng lượng II.3.2 Liều kích dục tố II.4 Thu nhận phôi II.4.1 Block (sự kiềm hãm) giai đoạn tế bào II.4.2 Phôi dâu II.4.3 Phôi nang III MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY PHÔI GIAI ĐOẠN TRƯỚC … III.1 Lịch sử nghiên cứu môi trường III.2 Các loại môi trường nuôi cấy phôi động vật có vú III.3 Các thành phần môi trường nuôi cấy phôi chuột III.3.1 Nước III.3.2 Ion III.3.3 Carbohydrate III.3.4 Amino acid III.3.5 Chất bắt giữ kim loại nặng III.3.6 Chất chống oxi hóa III.3.7 Kháng sinh III.3.8 Protein/Các đại phân tử III.3.9 Ammonium IV THỂ TÍCH Ủ V KHÔNG KHÍ VI ALBUMIN HUYẾT THANH BÒ……… VI.1 BSA VI.2 BSA tổng hợp BSA thể động vật có vú VI.3 Thành phần amino acid BSA VI.4 Đặc tính chức BSA VI.4.1 Tạo bọt VI.4.2 Khả đông đặc BSA VI.4.3 Phối tử kết nối VI.5 Những nghiên cứu vai trò BSA … VII ỨNG DỤNG THỰC TIỄN Vật liệu – Phương pháp I ĐỐI TƯNG NGHIÊN CỨU 3 6 7 8 8á 10 10 10 11 11 12 13 13 13 13 14 15 15 16 16 17 17 18 18 18 19 19 20 20 20 21 21 23 25 II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU III DỤNG CỤ – THIẾT BỊ – HOÁ CHẤT IV.1 Dụng cụ IV.2 Thiết bị IV.3 Hoá chất IV QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM IV.1 Ổn định chuột – kích thích buồng trứng – phối IV.2 Mổ chuột – thu nhận phôi tế bào IV.3 Theo dõi phát triển phôi ghi nhện kết V ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ Kết – Biện luận I KẾT QUẢ 25 25 25 26 26 27 29 31 36 37 40 I.1 Đặc điểm lô thí nghiệm nghiên cứu 40 I.2 Kết thí nghiệm ảnh hưởng nồng độ BSA … 42 I.3 Kết thí nghiệm ảnh hưởng số lượng phôi/ 50µl … 43 I.4 Kết thí nghiệm ảnh hưởng kích thích buồng trứng 45 I.5 Kết thí nghiệm ảnh hưởng nguồn chuột … 45 I.6 Kết thí nghiệm kiểm tra vai trò nút nhầy âm đạo … 45 II BÀN LUẬN Kết luận – Đề nghị I KẾT LUẬN II ĐỀ NGHỊ Tài liệu tham khảo Phụ lục Phụ lục 47 51 52 53 ĐẶT VẤN ĐỀ Nghiên cứu nuôi cấy phôi bước khởi đầu cho nhiều lónh vực: chuyển gen, công nghệ hỗ trợ sinh sản, công nghệ cloning, tế bào mầm, bảo tồn nguồn gen….Trên giới từ năm 1956, Wesley Whitten công bố thành công nuôi cấy phôi chuột giai đoạn tế bào số phôi chuột tế bào thành phôi nang, Whitten vào năm 1957, thành công nuôi cấy phôi chuột tế bào phát triển thành phôi nang Cho tới ngày nay, việc nuôi cấy phôi chuột trở nên phổ biến, bước khởi đầu cho nghiên cứu sâu gen, vi thao tác, tế bào mầm … Đối với Việt Nam, nước có nghiên cứu khoa học phát triển với phương châm trước đón đầu, việc nghiên cứu tạo quy trình nuôi cấy phôi hoàn chỉnh phù hợp với điều kiện nước bước khởi đầu cho thí nghiệm sau lónh vực nghiên cứu Tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên, trung tâm đào tạo nghiên cứu hàng đầu nước, năm 2003 với đề tài nghiên cứu Phạm Ngọc Thụy Vi, bước đầu thành công nuôi cấy phôi chuột tế bào lên phôi nang nhiên kết thấp chưa ổn đị 1nh Kết nhiều nguyên nhân: điều kiện nuôi cấy, môi trường nuôi cấy, chủng chuột … Có nhiều nghiên cứu chứng minh môi trường nuôi cấy tối ưu chung phòng thí nghiệm khác có công thức môi trường khác để đạt kết nuôi cấy gần với phát triển thể Vì với khảo sát đánh giá thí nghiệm vừa qua cho thấy yếu tố có khả ảnh hưởng cao tới kết nuôi cấy môi trường không phù hợp Vì đề tài tiến hành với mục tiêu xác định nồng độ BSA tối ưu môi trường nuôi cấy phôi chuột từ giai đoạn tế bào lên phôi nang Bên cạnh đó, thí nghiệm tiến hành khảo sát ảnh hưởng số lượng phôi chuột thể tích môi trường nuôi cấy cố định lên khả phát triển phôi chuột tế bào thành phôi nang, khảo sát điều kiện ổn định chuột, nguồn chuột vai trò việc kiểm tra nút nhầy âm đạo đánh giá kết thụ tinh III SINH SẢN TRÊN CHUỘT III.1 Nội tiết sinh sản Hormone kích thích nang trứng phát triển FSH (follicle stimulating hormone) tuyến yên tiết kích thích nhóm nang trứng tiếp tục tăng trưởng Hormone kích thích rụng trứng LH (Luteinizing hormone) tuyến yên tiết ra, phá vỡ kiềm hãm phân bào giảm nhiễm, bắt đầu phân bào giảm nhiễm tạo thể cực thứ I, sau trứng trưởng thành phóng thích Mặc dù chế rụng trứng chưa hiểu rõ, việc trứng phóng thích khỏi nang trứng nhờ vào tăng kích thích LH III.2 Sự phát triển trưởng thành trứng [5] Ở chuột ngày tuổi, tất trứng giai đoạn diplotene (DNA nhân đôi) tiền kì lần phân bào giảm nhiễm thứ Mỗi trứng chứa nang trứng bao bọc lớp tế bào hạt Hơn nửa nang noãn nguyên thuỷ diện buồng trứng lúc sinh thoái hóa trước – tuần tuổi, nguyên nhân điều chưa biết rõ Chuột thành thục giới tính vào khoảng tuần đến tháng tuổi, tuỳ thuộc vào chủng chuột điều kiện môi trường Khi chuột trưởng thành buồng trứng chứa khoảng 104 trứng giai đoạn phát triển khác III.3 Sự rụng trứng Chu kì rụng trứng bình thường xảy ngày lần Tuy nhiên, thời gian chu kì rụng trứng bị ảnh hưởng nhiều yếu tố điều khiển kích thích hormone (kích thích buồng trứng) Trứng tăng trưởng kích thước dần bước vào giai đoạn cuối giảm phân đáp ứng với kích thích hormone Trong chu kì rụng trứng tự nhiên có số nang noãn đáp ứng với tăng FSH tuyến yên sản xuất Sự rụng trứng xảy có tăng LH tuyến yên sản xuất Dưới kích thích LH, nhân màng, nhiễm sắc thể tập trung sợi nhiễm sắc chia đôi, cuối diễn phân bào giảm nhiễm thứ tạo thể cực thứ I Trứng phóng thích khỏi nang noãn.Trứng rụng vào ống dẫn trứng, vào lúc đầu ngoại biên ống dẫn trứng trở nên ứ máu trương phòng lên thành đoạn bóng nơi thụ tinh diễn Trong rụng trứng tự nhiên, – 12 trứng phóng thích (tuỳ thuộc vào chủng chuột) tiến trình không đồng xảy khoảng thời gian 2- III.4 Sự thụ tinh Khoảng 58x106 tinh trùng phóng vào ống dẫn trứng lần phóng tinh Vài tinh trùng tới đoạn bóng khoảng phút thụ tinh xảy khoảng Sự thụ tinh khởi động trình phân bào giảm nhiễm thứ tạo thể cực thứ III.5 Sự phát triển phôi chuột giai đoạn sau làm tổ [13] Trứng Thụ tinh Hợp tử Phân chia Phôi bào Tinh trùng Hình 1: Sơ đồ phát triển ban đầu phôi Thụ tinh: kết hợp giao tử đực giao tử tạo thành hợp tử mốc bắt đầu phát triển hợp tử Sự phân chia: chuỗi phân bào nguyên nhiễm nhờ tế bào ban đầu (hợp tử) phân chia thành nhiều tế bào (phôi bào- blastomeres) Các đặc điểm phát triển phôi ban đầu động vật có vú: − Sự thụ tinh phân chia sớm xảy nhánh vòi trứng − Sự phân chia xảy chậm từ 12 – 24 − Sự phân chia ban đầu không đồng − Bộ gen hoạt hóa hợp tử bắt đầu phân chia Thể cực A Trứng thụ tinh Màng pellucida Tiền nhân đực B Phôi tế bào 11/2ngày C Phôi tế bào 21/2 ngày Kết khối Phôi 16 tế bào ngày D Phôi nang ngày E Khối tế bào Khoang Ngoại bên phôi phôi bì Hình 2: Sự phát triển phôi sau thụ tinh A: trứng thụ tinh B: phôi tế bào C: phôi dâu -phôi tế bào D: phôi 16 tế bào E: phôi nang Khó khăn việc nghiên cứu loài động vật có vú: − Trứng chúng nhỏ giới động vật (hợp tử người có kích thước 120µm, chuột khoảng 80µm) − Số lượng trứng động vật có vú tạo − Phôi động vật có vú phát triển bên thay bên thể III.6 Các giai đoạn phát triển phôi chuột [5,8,9] Giai đoạn tế bào rời (Cleavage): số lượng tế bào phôi đếm dễ dàng lúc xảy kết khối giai đoạn tế bào, làm hình dạng tế bào trở nên mờ nhạt Giai đoạn kết khối (Compaction): xảy vào 3,5 – 7,5 sau bắt đầu chu kì tế bào thứ 4, tức giai đoạn phôi tế bào Phân chia tới giai đoạn 16 tế bào: kết thúc chu kì tế bào thứ bắt đầu chu kì tế bào thứ 5, diễn phân bào nguyên nhiễm sau tách khối kết khối trở lại sau phân bào nguyên nhiễm kết thúc Hình thành khoang phôi (Blastocoel): chu kì tế bào thứ 6, biểu thị sớm chuyên chở chất dịch xảy phôi tiến gần tới số lượng 32 tế bào hình thành không bào chứa đầy dịch lỏng (hoặc không bào phồng to sau hợp lại) IV QUY TRÌNH TẠO PHÔI - THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY TRONG ỐNG NGHIỆM A B Hình 3: A: phôi giai đoạn tế bào chưa kết khối; B: phôi kết khối-không nhìn thấy rõ tế bào IV.1 Quy trình giao phối tự nhiên Chuột ổn định theo chu kì sáng tối thường rụng trứng theo chu kì 3-4 ngày, 3-4 sau bắt đầu chu kì tối Chuột đực ổn định điều kiện giao phối với vào chu kì động dục khoảng chu kì tối Có thể xác định chuột vào chu kì động dục cách xác định màu sắc, độ nhầy, sưng đỏ âm đạo Giai đoạn chu kì động dục Hình thái âm đạo Không động dục Âm đạo có độ mở nhỏ, phần mô không đỏ nhầy Tiền động dục Âm đạo hở, mô đỏ hồng nhầy, có nhiều nếp gấp theo chiều dọc nếp nhăn rõ ràng mép lưng mép bụng Động dục Âm đạo tương tự tiền động dục, mô hồng sáng nhầy, nếp nhăn rõ ràng Sau động dục Mô âm đạo tái nhạt khô; mép lưng không phù thời gian động dục Sau động dục Tương tự sau động dục môi nhợt nhạt lùi lại; mảnh vụn tế bào trắng làm đầy thành lấp đầy âm đạo) Bảng 1: Cách xác định giai đoạn chu kì động dục chuột dựa vào hình thái âm đạo Chuột (từ tuần đến tháng tuổi) kiểm tra cho tiếp xúc với chuột đực (1 chuột chuồng với chuột đực) Con đực trưởng thành từ 6-8 tuần tuổi (tuỳ thuộc vào chủng chuột), nên nhốt chuồng riêng Buổi sáng sau giao phối chuột kiểm tra xuất nút giao phốitức nút nhầy âm đạo Nút nhầy gồm protein bị đông lại từ dịch tinh trùng đực nhìn thấy dễ dàng hầu hết chủng chuột Nút nhầy âm đạo thường tan rã khoảng 12-14 sau xảy giao phối Thông thường, 50% chuột chọn phối II.1.1 Sự thụ tinh thể (in vivo) Để thụ tinh phát triển sau đồng bộ, thời gian tiêm hormone cần đảm bảo cho thụ tinh xảy trước rụng trứng- nghóa trứng vừa rụng thụ tinh lập tức, không trùng lấp với thời gian LH nội sinh Nếu có khác tuổi phát triển phôi lệch chế độ tiêm thuốc làm kéo dài thời gian rụng trứng thời gian giao phối dẫn đến không đồng phôi thu nhận Trứng thụ tinh phân biệt với trứng chưa thụ tinh cách quan sát xuất thể cực thứ Nên tránh thụ tinh với trứng rụng 12 làm tăng tượng tự phát hoạt tính sinh sản đơn tính trứng (tức trứng phân chia giả thoái hóa dần sau đó) Chuột giao phối hiệu sử dụng cân đối không thường xuyên II.1.2 Sự thụ tinh ống nghiệm (in vitro) Phương pháp có lợi điểm: Đồng thụ tinh thể thụ tinh thiết lập thời gian xác Tiến trình tách khỏi chu kì ngày đêm thông thường, cho phép thụ tinh trứng diễn theo thời gian thí nghiệm cho phép IV.2 Kích thích buồng trứng (superovulation) Đối với thí nghiệm cần nhiều phôi giai đoạn trước làm tổ phải tiêm kích dục tố cho chuột trước cho phối để tăng số lượng trứng rụng Hormone kích thích nang trứng phát triển - FSH thay kích dục tố thu từ huyết ngựa mang thai - PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin) Hormone kích thích rụng trứng - LH thay kích dục tố màng đệm người - hCG (human chorionic gonadotropin) Hiệu việc sử dụng kích dục tố gây kích thích buồng trứng chuột tuỳ thuộc vào nhiều yếu tố: tuổi, trọng lượng chuột, liều kích dục tố, thời gian tiêm kích dục tố chủng chuột Số lượng trứng rụng thụ tinh tuỳ thuộc vào khả sản xuất tinh trùng chuột đực IV.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu kích thích buồng trứng II.3.1 Ảnh hưởng tuổi trọng lượng Sự trưởng thành yếu tố ảnh hưởng tới số lượng trứng kích thích Tuổi tốt cho kích thích buồng trứng thay đổi tuỳ thuộc vào chủng chuột Vào giai đoạn phát triển tốt nhất, chín nang noãn tăng đột ngột làm tăng số lượng nang noãn có khả phản ứng với FSH tối đa Tuy nhiên, tình trạng dinh dưỡng sức khoẻ chuột ảnh hưởng đến chín nang noãn Những vật thiếu trọng lượng bệnh dẫn đến chậm phát triển giảm số lượng trứng việc gây kích thích buồng trứng cấy Ảnh hưởng số lượng phôi/50µl môi trường nuôi cấy Ảnh hưởng kích dục tố kích thích buồng trứng Ảnh hưởng nguồn chuột điều kiện nuôi ổn định chuột lên khả giao phối chuột Vai trò nút nhầy âm đạo kiểm tra chuột phối phôi/1 giọt mt thí nghiệm/mỗi nhóm thí nghiệm 31 thí nghiệm 26 thí nghiệm chuột ổn định tuần thí nghiệm chuột ổn định từ chuột ổ nhóm thí nghiệm: 210 phôi − phôi/50µl mt − 10 phôi/50µl mt 192 chuột Kích thích với loại kích dục tố: PMSG Pregnyl Thời gian tiêm kích dục tố cách 48 104 chuột Chuột mua từ Pasteur với tiêu chuẩn chọn chuột chủ yếu theo khối lượng chuột 16 chuột Chuột mua từ Pasteur dạng chuột ổ khoảng -2 tuần tuổi nuôi ổn định tới thí nghiệm Chuột cho phối vào ngày D0 thí nghiệm 40 chuột Kiểm tra mốc thời gian: (D0), 19 (D0), (D1) Bảng 9: Đặc điểm lô thí nghiệm tiến hành I.2 Thí nghiệm ảnh hưởng nồng độ BSA môi trường nuôi cấy Thí nghiệm thực nhằm xác định nồng độ BSA tối ưu cho phát triển phôi chuột tế bào thành phôi nang điều kiện nuôi cấy thực tế Thí nghiệm tiến hành với nồng độ BSA: 0,4%, 0,8%, 1,2%, với lô thí nghiệm nồng độ, tổng số 138 phôi tiến hành nuôi thí nghiệm Phôi chuột tế bào giai đoạn muộn thu nhận từ chuột kích thích buồng trứng tiến hành nuôi nồng độ BSA với điều kiện nuôi cấy tủ CO2 dạng ẩm: 37oC, 5% CO2, độ ẩm 100% Tỉ lệ phát triển tính theo số lượng phôi chuột tế bào thu nhận ban đầu Kết thí nghiệm trình bày Bảng 10 Hình 24: − Nồng độ BSA 1,2% cho phát triển cao giai đoạn phát triển phôi đánh giá (phôi tế bào, phôi dâu, phôi nang) − Ở nồng độ BSA thí nghiệm, tỉ lệ phát triển giảm dần từ phôi tế bào đến phôi nang Theo kết thống kê vơi p < 0,05: − Giai đoạn phôi tế bào: khác biệt không đáng kể nồng độ Giai đoạn phôi dâu: (1) 0,4% 1,2% khác biệt; (2) 0,4% 0,8% khác biệt; (3) 0,8% 1,2% có khác biệt Giai đoạn phôi nang: (1) nồng độ 0,4% 0,8% khác biệt; (2) 0,4% 1,2% có khác biệt; 0,8% 1,2% có khác biệt I.3 Thí nghiệm ảnh hưởng số lượng phôi/50µl môi trường nuôi cấy Thí ngiệm tiến hành nhằm xác định số lượng phôi thể tích cố định môi trường cho phát triển tối ưu phôi chuột tế bào thành phôi nang điều kiện thí nghiệm thực tế Thí nghiệm tiến hành với nhóm: phôi/50µl môi trường 10 phôi/50µl môi trường, với lô thí nghiệm thực nhóm, tổng số 210 phôi sử dụng Phôi chuột tế bào giai đoạn muộn thu nhận từ chuột kích thích buồng trứng tiến hành nuôi nhóm với điều kiện nuôi cấy tủ CO2 dạng ẩm: 37oC, 5% CO2, độ ẩm 100% Tỉ lệ phát triển tính theo số lượng phôi chuột tế bào thu nhận ban đầu Nồng độ BSA Số lượng bổ sung phôi Tỉ lệ phát triển trung bình (%) Phôi tế bào Phôi dâu Phôi nang 0,4% 42 71,43 ± 3,07a 54,76 ± 7,89ab 28,57 ± 3,07b 0,8% 54 75 ± 3,15a 59,52 ± 3,82b 33,33 ± 3,15b 1,2% 42 78,57 ± 4,76a 73,8 ± 3,37a 45,24 ± 4,73a Bảng 10: Tỉ lệ phát triển trung bình (%) thí nghiệm nuôi phôi từ giai đoạn tế bào môi trướng có bổ sung BSA với nồng độ: 0,4%, 0,8% 1,2% a, b: biểu khác biệt kết theo chiều dọc (phân tích ANOVA với P < 0,05) Tỉ lệ tính theo số lượng phôi tế bào ban đầu 100 80 Tỉ lệ 60 phát triển 40 (%) 0,4% BSA 0,8% BSA 1,2% BSA 20 Phoâi TB Phôi dâu Phôi nang Hình 24: Biểu đồ kết thí nghiệm ảnh hưởng nồng độ BSA môi trường nuôi cấy lên phát triển phôi chuột giai đoạn trước làm tổ Kết thí nghiệm trình bày Bảng 11, Hình 25: − Tỉ lệ phát triển giai đoạn đánh giá (phôi tế bào, phôi dâu, phôi nang) so với giai đoạn phôi tế bào thu nhận ban đầu nhóm phôi/50µl môi trường cho kết phát triển cao so với nhóm 10 phôi/50µl môi trường − Ở nhóm thí nghiệm có giảm dần tỉ lệ phát triển từ phôi tế bào tới phôi nang − Theo kết thống kê với p < 0,05: Giai đoạn phôi tế bào: có khác biệt nhóm Giai đoạn phôi dâu: khác biệt nhóm Giai đoạn phôi nang: có khác biệt nhóm I.4 nh hưởng kích dục tố kích thích buồng trứng Việc ghi nhận nhằm xác định mức độ ổn định trứng phôi thu nhận từ chuột kích thích buồng trứng với loại kích dục tố PMSG Pregnyl, với liều lượng 10UI, khoảng cách thời gian tiêm loại kích dục tố 48 26 thí nghiệm với 160 chuột ghi nhận, chuột ổn định theo chu kì sáng (7 – 19 giờ) chu kì tối (19 – giờ), sau tiêm kích dục tố với liều 1: 10UI PMSG, liều sau 48 giờ: 10UI hCG Kết thí nghiệm trình bày Hình 26: − Số lượng trứng (phôi) thu nhận từ chuột kích thích buồng trứng: 23,42 trứng (phôi)/chuột (Theo sinh lý chuột chuột bình thường, chu kì rụng trứng có từ – 12 trứng rụng.) − Theo kết ghi nhận, chuột gây kích thích buồng trứng với PMSG hCG, liều 10UI, thời gian lần tiêm kích dục tố 48 cho kết rụng trứng cao ổn định I.5 Ảnh hưởng nguồn chuột đến khả giao phối chuột Việc ghi nhận nhằm xác định vai trò số yếu tố sinh lý chuột trọng lượng, độ tuổi lên tần suất giao phối chuột Thí nghiệm tiến hành theo đối tượng chuột mua từ viện Pasteur: − Chuột chọn theo trọng lượng 20 – 30g: ổn định tuần tiến hành thí nghiệm Nguồn chuột dựa trọng lượng chuột không xác định độ tuổi xác Số phôi/50µl Số lượng mt phôi Tỉ lệ phát triển trung bình (%) Phôi tế bào Phôi dâu Phôi nang 10 phoâi 180 49 ± 7,45a 34,67 ± 5,01a 11,5 ± 2,18a phoâi 30 73,33 ± 4,08b 56,67 ± 10,00a 30 ± 3,33b Bảng 11: Tỉ lệ phát triển trung bình (%) phôi chuột nhóm 10phôi/50µl môi trường phôi/50µl môi trường a, b: biểu khác biệt kết theo chiều dọc (phân tích ANOVA với P < 0,05) Tỉ lệ tính theo số lượng phôi tế bào ban đầu 80 60 Tỉ lệ phát40 triển (%) 20 10 phôi/50µl mt phôi/50µl mt Phôi tb Phôi nang Phôi dâu Hình 25: Biểu đồ kết thí nghiệm số lượng phôi chuột/giọt 50µl môi trường 40.00 35.00 30.00 Số lượng trứng (phôi)/chuột thí nghiệm Số 25.00 lượng 20.00 trứng (phôi) 15.00 Số trứng (phôi)/chuột theo sinh lyù 10.00 5.00 0.00 13 10 16 19 22 25 Thí nghiệm Hình 26: Số lượng trứng (phôi)/chuột thu chuột kích thích buồng trứng Thí nghiệm Số chuột thí nghiệm Số chuột phối Tỉ lệ % chuột phối Chuột ổn định tuần 104 13 12,5 Chuột ổn định từ chuột ổ 16 15 93,75 Bảng 12: Tỉ lệ chuột phối thành công thí nghiệm nghiệm ảnh hưởng nguồn chuột điều kiện nuôi ổn định chuột đến khả giao phối chuột − Chuột ổ (1 – tuần tuổi): nuôi ổn định tới độ tuổi thí nghiệm (6 tuần – 10 tuần) xác định độ tuổi trọng lượng chuột Kết thí nghiệm trình bày Bảng 12: − Lô thí nghiệm chuột mua từ viện Pasteur tính theo lượng chuột ổn định tuần trước tiến hành thí nghiệm tỉ lệ chuột phối thấp 12,5% − Lô thí nghiệm chuột mua từ viện Pasteur dạng chuột ổ ổn định điều kiện thí nghiệm tới độ tuổi cần thiết, tiến hành thí nghiệm cho kết giao phối cao 93,75% I.6 Thí nghiệm kiểm tra nút nhầy âm đạo xác định chuột phối Thí nghiệm tiến hành nhằm đánh vai trò kiểm tra nút nhầy âm đạo việc xác định chuột giao phối, khoảng thời gian cho chuột phối phù hợp Thí nghiệm tiến hành với 40 chuột cái, sau ổn định tuần, chích kích dục tố, cho phối kiểm tra nút nhầy thời gian khác Ghi nhận chuột có chuột nút nhầy âm đạo Mỗ toàn chuột cho phối để thu nhận phôi đối chiếu chuột có phôi thu nhận với kết kiểm tra nút nhầy Kết thí nghiệm trình bày Bảng 13, Hình 27: − Chuột có nút nhầy âm đạo: có phôi − Chuột nút nhầy âm đạo: có phôi − Nút nhầy kiểm tra lúc sáng ngày D0, tức chuột phối vào khoảng đêm ngày D-1 (là thời gian dự kiến) − Nút nhầy kiểm tra lúc 19 ngày D0 tức chuột phối vào khoảng buổi sáng ngày D0 − Nút nhầy kiểm tra lúc ngày D1 tức chuột phối vào khoảng đêm ngày D0 − Chuột có biên độ thời gian giao phối rộng Phôi Thí nghiệm + - + 10 - 18 VP Bảng 13: Kết kiểm tra nút nhầy âm đạo Số chuột có VP Số chuột VP(+) (D0) 7) 19 (D0giờ (D1) Thời gian kiểm tra VP Hình 27: Sự xuất nút nhầy âm đạo/thời gian kiểm tra I BÀN LUẬN Tại phôi chuột tế bào thu nhận từ thụ tinh thể chọn làm đối tượng nghiên cứu? Mặc dù phôi chuột thu nhận từ thụ tinh ống nghiệm có ưu điểm chủ động nguồn mẫu, đồng không phụ thuộc vào chu kì sáng tối, việc thụ tinh ống nghiệm chuột lónh vực chưa hoàn thiện, chưa thu kết ổn định Phôi chuột có đặc điểm: bị ức chế (bị block) phát triển giai đoạn tế bào, điều ảnh hưởng lớn kết nghiên cứu phôi chuột Vì vậy, hầu hết nghiên cứu có liên quan tới việc nuôi cấy phôi chuột, phôi chuột thường thu nhận giai đoạn tế bào muộn, nhằm tránh tượng block phôi chuột giai đoạn tế bào Điều giúp cho kết thí nghiệm ổn định xác Tại sử dụng môi trường nuôi cấy IVF FertiCult? Môi trường sử dụng thí nghiệm nghiên cứu phôi chuột thường môi trường KSOM, M16 ….Trong thí nghiệm lại sử dụng môi trường nuôi cấy FertiCult IVF (FertiPro) môi trường thương mại dùng nuôi cấy phôi người Việc có môi trường nuôi cấy chuyên biệt đòi hỏi nhiều yếu tố mà điểu kiện thực tế không đáp ứng được: − Thành phần hoá chất pha chế đủ − Không có thiết bị để kiểm soát chất lượng môi trường pha: máy đo áp suất thẩm thấu… − Không có nguồn nước đảm bảo tiêu chuẩn cho pha môi trường nuôi cấy phôi chuột Trong đó, môi trường FertiCult IVF (FertiPro) môi trường thương mại sử dụng cho phôi người, nhiên hỗ trợ cho phát triển phôi chuột qua chứng nhận chất lượng lô hàng với > 80% phôi chuột đạt giai đoạn blastocyst Và môi trường nhà trường hỗ trợ đồng ý nghiên cứu Bàn luận kết thí nghiệm ảnh hưởng nồng độ BSA môi trường nuôi cấy lên phát triển phôi chuột? Kết (Bảng 10, Hình 24) cho thấy việc bổ sung BSA vào môi trường nuôi cấy có tác dụng làm tăng khả phát triển phôi chuột nuôi cấy, làm tăng rõ rệt khả phát triển lên phôi nang từ phôi tế bào nuôi cấy Điều phù hợp với thí nghiệm Brinster năm 1965 cho BSA với vai trò nguồn nitrogen hỗn hợp amino acid bị thuỷ phân cần thiết cho phát triển phôi chuột tế bào lên phôi nang nuôi cấy, phù hợp với kết Biggers, Summers Ginnis vào năm 1997 cho BSA bổ sung vào môi trường nuôi cấy làm tăng khả phát triển lên phôi nang phôi chuột tế bào Lý BSA làm tăng phát triển phôi rõ ràng, có khả năng: (1) BSA làm tăng amino acid bổ sung (2) BSA cung cấp phân tử amino acid kết hợp kích thích phát triển (3) BSA cung cấp chức bắt giữ Tuy nhiên, kết thí nghiệm lại trái ngược với kết cuả Evencen Alkan nồng độ BSA 1% ức chế phát triển phôi chuột nuôi cấy Kết thí nghiệm lại cho thấy rằng: nồng độ BSA bổ sung 1,2% (>1%) lại nồng độ cho kết phôi chuột tế bào phát triển lên phôi nang cao Điều điều kiện thí nghiệm khác về: môi trường, chủng chuột, điều kiện thí nghiệm Trong thí nghiệm Evencen Alkan sử dụng môi trường M16 môi trường Whitten’s, chủng chuột lai F1 CB6, điều kiện nuôi cấy 5%CO2, 5%O2, 90%N2, độ ẩm 100% Trong đó, với điều kiện thí nghiệm thực tế có được, điều kiện thí nghiệm không tối ưu mặt môi trường, chủng chuột điều kiện chất lượng thí nghiệm Với điều kiện thí nghiệm không đảm bảo tiêu chuẩn thí nghiệm vai trò BSA như: bắt giữ độc tố, kim loại nặng, điều hoà trình oxi hoá, chất bảo vệ bề mặt tế bào, chất bảo vệ enzyme làm BSA với nồng độ cao trở nên có vai trò quan trọng nuôi cấy phôi Qua kết thống kê giai đoạn phôi dâu nồng độ 0,4 1,2% khác biệt ý nghóa thống kê, có khác biệt rõ rệt giá trị trung bình Điều cho thấy giai đoạn phát triển phôi dâu nồng độ BSA 0,4% có sai số lớn, cần lập lại thí nghiệm để có kết xác nồng độ Kết nuôi cấy phôi tế bào phát triển lên thành phôi nang đạt tỉ lệ cao 45,24% nồng độ BSA 1,2% Tuy nhiên chưa kết cao nhất, tối ưu nhất, kết nuôi cấy phôi chuột từ tế bào lên phôi nang giới 80 – 90% Kết thí nghiệm cho thấy với điều kiện nuôi cấy tại, chủng chuột nước nồng độ BSA cho kết tốt nồng độ thí nghiệm 1,2% Bàn luận kết thí nghiệm ảnh hưởng số lượng phôi thể tích nuôi cấy định Kết thí nghiệm (bảng 11, hình 25) cho thấy, phát triển phôi chuột tế bào lên phôi nang thí nghiệm phôi/ giọt môi trường cao thí nghiệm 10 phôi/1 giọt môi trường Cho thấy với chủng chuột điều kiện nuôi cấy thực tế, nuôi phôi/1 giọt môi trường cho kết tốt 10 phôi/1 giọt môi trường đề nghị.(7) Toàn hệ thống nuôi cấy với khía cạnh: không khí, thể tích nuôi cấy, số lượng phôi nhóm nuôi cấy, bổ sung đại phân tử … có tác động lẫn tác động lên phát triển phôi Số lượng lớn phôi thể tích môi trường nuôi cấy ức chế phát triển phôi chuyển hoá chất tạo nguồn dinh dưỡng cho đồng thời chuyển hoá tạo số chất độc hại phôi (ví dụ phôi chuyển hoá khử gốc amin amino acid tạo ammonium ảnh hưởng xấu tới phát triển phôi), làm môi trường không đủ nguồn chất dinh dưỡng cung cấp cho phát triển phôi Tuy nhiên, số lượng lớn phôi thể tích môi trường nuôi cấy có lợi cho phát triển phôi phôi tạo nhân tố actocrine/paracrine đặc biệt kích thích phát triển Vì tìm số lượng phôi thích hợp thể tích nuôi cấy xác định làm tăng khả phát triển phôi Trong điều kiện nuôi cấy thực tại, nguồn môi trường, chủng chuột điều kiện thí nghiệm không tối ưu việc nuôi phôi/giọt môi trường cho kết tốt nuôi 10 phôi/giọt môi trường Bàn luận kết thí nghiệm ảnh hưởng kích thích buồng trứng Số trứng phôi chuột thu nhận từ chuột kích thích buồng trứng 23,42 trứng (phôi) ổn định số lượng phù hợp khoảng tiêu chuẩn kích thích Điều có nghóa việc sử dụng thuốc kích thích rụng trứng PMSG (PMSG 1000IU, Viện Chăn nuôi Quốc gia) hCG (Pregnyl 1500IU, N.V.Organon, Hà Lan), với thời gian tiêm loại kích dục tố cách 48 giờ, cho kết tốt ổn định (Hình 26) Bàn luận kết thí nghiệm ảnh hưởng nguồn chuột điều kiện nuôi ổn định chuột đến khả giao phối chuột (Bảng 13) Đối với nguồn chuột mua từ viện Pasteur với tiêu chuẩn chọn chuột 20 – 30g không kiểm soát độ tuổi chuột chất lượng chuột kết giao phối cho thấy nguồn chuột thí nghiệm không đảm bảo chất lượng Đối với nguồn chuột mua từ Pasteur dạng chuột ổ (1-2 tuần tuổi) nuôi ổn định tới thí nghiệm, tuổi chuột, trọng lượng chất lượng chuột kiểm soát hoàn toàn, chuột cho kết giao phối cao (93,75%) Bàn luận kết thí nghiệm kiểm tra vai trò nút nhầy âm đạo xác định chuột phối (Bảng 14) Kết kiểm tra nút nhầy chuột (Hình 27) cho thấy biên độ thời gian giao phối chuột rộng Vì vậy, việc thiết kế quy trình tạo phôi tài liệu nước đề nghị: chuột sau tiêm hCG cho phối với chuột đực, kiểm tra nút nhầy vào sáng ngày hôm sau, sau tách chuột(5,6,7,8) không phù hợp với điều kiện thực tế Vai trò nút nhầy việc xác định chuột phối (Bảng 13) không xác Chuột kiểm tra có VP(+) có phối có trường hợp chuột có phốii (thu nhận phôi tế bào theo lịch thí nghiệm) kết kiểm tra VP(-) Tuy nhiên, số lượng chuột có VP(-) có phối chiếm 11% tổng số chuột có VP(-) không phối III KẾT LUẬN a Trong phạm vi nghiên cứu này, mục đích cuối khảo sát số điều kiện nuôi cấy nhằm góp phần cải thiện kết nuôi cấy thí nghiệm vừa qua Kết nghiên cứu cho thấy điều kiện thí nghiệm trình bày tỉ lệ phát triển phôi chuột từ tế bào lên phôi nang đạt kết cao với lô thí nghiệm: phôi/giọt môi trường 50µl Nồng độ BSA bổ sung tốt 1,2% − Kết thí nghiệm cho thấy nồng độ BSA bổ sung 1,2% không xảy việc ức chế phát triển phôi giai đoạn trước làm tổ nuôi cấy ống nghiệm Tuy nhiên chưa điều kiện phát triển tối ưu tỉ lệ phát triển lên phôi nang thấp (dưới 50%) chưa thật ổn định Số lượng thí nghiệm chưa đạt số lượng thống kê cần thiết thời gian thí nghiệm bị giới hạn, bị giới hạn nguồn mẫu b Cách tạo nguồn phôi: Với điều kiện thí nghiệm chuột mua từ viện Pasteur, ổn định theo chù kì sáng tối từ 19 – (chu kì tối) thời gian tuần trước tiến hành thí nghiệm, thời gian tiêm thuốc kích thích siêu noãn 17 giờ, khoảng cách thời gian tiêm PMSG hCG 48 giờ, cho phối thu phôi, kết thu lượng phôi có vấn đề sau: i Liều lượng, thời gian tiêm kích dục tố, chất lượng thuốc gây kích thích buồng trứng phù hợp với sản phẩm PMSG (Viện Chăn nuôi Quốc gia), Pregnyl (N.V.Organon, Hà Lan) ii Chuột mua từ viện Pasteur theo tiêu chuẩn trọng lượng chuột không đảm bảo chất lượng, tốt nên ổn định từ chuột ổ (khoảng – tuần tuổi) − Nút nhầy âm đạo không dấu hiệu tốt cho việc xác định chuột giao phối Tuy nhiên, với tỉ lệ 11% chuột có VP(-) có phối nên việc kiểm tra nút nhầy có ý nghóa dấu hiệu cho việc xác định chuột phối − Biên độ thời gian giao phối nguồn chuột sử dụng thí nghiệm rộng IV ĐỀ NGHỊ • Tiến hành thí nghiệm với môi trường chuyên biệt sử dụng cho chuột, tiến hành thí nghiệm rộng nồng độ BSA số lượng phôi giọt nuôi cấy • Sự dụng chuột thí nghiệm kiểm soát độ tuổi trọng lượng chuột, tốt sử dụng chuột nuôi ổ • Trong việc xác đinh chuột giao phối qua nút nhầy âm đạo không ổn định tỉ lệ VP(-) chuột có phối không cao, nên chuột cho phối nên tiến hành thu phôi kiểm tra có nút nhầy Chuột cho phối vào ngày D-1, nên nhốt chung chuột đực sáng ngày thu phôi Chuột cho phối thông thường nên thu phôi vào khoảng trưa ngày D1 (khoảng 14 – 15 giờ) để đảm bảo phôi tế bào thu đủ muộn • Với kết tỉ lệ phát triển phôi chuột tế bào lên phôi nang 45,23% việc tiếp tục sử dụng kết nuôi cấy vào ứng dụng cao hơn, chuyển phôi, nuôi cấy phôi tới giai đoạn thoát nang sử dụng tiếp tục nuôi cấy tế bào mầm khả quan nên tiếp tục thực Tài liệu tiếng Việt Phan Kim Ngọc 2002 Giáo trình thực tập sở Công Nghệ Sinh Học Động Vật, nxb Đại học quốc gia Hồ Chí Minh, trang 72-111 Phan Kim Ngọc, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2000 Sinh học sinh sản, nxb Giáo dục, trang 5-10, 84-100 Nguyễn Văn Uyển, Nguyễn Văn Thắng, 2000, Những kiến thức công nghệ sinh học, nxb Giáo dục, trang 203-229 Tài liệu tiếng nước Alan O Trounson, David K Gardner 2000 Embryo culture systems Trong Handbook of In Vitro Fertilization, Second edition, CRC Press, trang 206-248 Andras Nagy, Marina Gertsenstein, Kristina Vintersten, Richard Behringer 2003 Developmental genetics and embryology of the mouse, Summary of mouse development, Production of transgenic and chimeric mice, Setting up a micromanipulation lab Trong Manipulating the Mouse Embryo, A laboratory Manual, Third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, trang 2-20, 32-121, 142-159, 708-723 David K Gardner, Ariel Weissman, Colin M Howles, Zeev Shoham 2001 Embryo culture Trong Textbook of Assisted Reproductive Techniques, Laboratory and Clinical Perspectives, Martin Dunitz, trang 203-222 Jose Cibelli, Robert P Lanza, Keith H.S Campbell, Michael D West 2002 Development of viable mamalian embryos in vitro: evolution of sequential media Trong Principles of Cloning, Elsevier Science (USA), trang 187-208 M Monk, Mouse husbandry, Isolation, culture and manipulation of preimplantation mouse embryos Trong Mammalian development – a practical approach, IRL Press, n.d, trang 1-41 Nancy Ford, Judy Cuddihy, Summary of mouse development, Setting up a colony for the production of transgenic mice, Recovery, culture and transfer of embryos Trong Manipulating the Mouse Embryo, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Publication Department, n.d, trang 17-147 10 Scott F Gilbert 1985 Cell interactions at a distance: hormones as mediators of development, Sex determination Trong Developmental Biology, Sinauer Associates, Inc, trang 603-660 Tài liệu truy cập internet 11 Mithat Evecen, Serhat Pabuccuogle, Serhat Alkan, I Kamuran Ileri, The effects of various BSA levels in different media on development in In Vitro culture of mouse embryos, Turk J Vet Anim Sci, 28 (2004) 337-342 12 John D.Biggers, Michael C.Summers, Lynsa K.McGinnis, Polyvinyl alcohol and amino acids as substitutes for bovine serum albumin in culture media for mouse preimplantation embryos, Human Reproduction Update 1997, vol 3, No pp 125-135 13 http://www.unicapinvitrosight.com/templates/Allergens.asp?id=2333 14 http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/0775827a.pdf 15 http://www.friedli.com/research/PhD/chapter5.html 16 http://www.cmb.uab.edu/courses/Lectures/balkovetz2.pdf ... Ảnh hưởng thí nghiệm/mỗi nồng độ BSA nồng độ BSA môi trường nuôi Số chuột số phôi tế bào 138 phôi Đặc điểm nồng độ BSA: 0,4%, 0,8%, 1,2% cấy Ảnh hưởng số lượng phôi/ 50µl môi trường nuôi cấy Ảnh. .. nghiệm ảnh hưởng nồng độ BSA môi trường nuôi cấy lên phát triển phôi chuột? Kết (Bảng 10, Hình 24) cho thấy việc bổ sung BSA vào môi trường nuôi cấy có tác dụng làm tăng khả phát triển phôi chuột nuôi. .. Hình 5: Các giai đoạn phát triển phôi chuột A -phôi tế bào; B -phôi tế bào; C- phôi tế bào; D -phôi dâu sớm; E -phôi dâu muộn; F -phôi nang III.5 Môi trường nuôi cấy phôi giai đoạn trước làm tổ III.5.1
